DE3590232T

DE3590232T - 1,24-Dihydroxy-Δ↑2↑↑2↑-Vitamin D↓3↓ und Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE3590232T
Application number: DE19853590232
Authority: DE
Inventors: Hector F. Madison Wis. DeLuca; Nobuo Musashino Tokio/Tokyo Ikekawa; Yoko Delmar N.Y. Tanaka
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 1984-05-31
Filing date: 1985-02-28
Publication date: 1986-06-26
Also published as: AU4063985A; GB2159520B; FR2565227A1; JPH0662664B2; JPH0692989A; WO1985005622A1; JPS61502257A; US4588528A; IE58286B1; IE851284L; DE3590232C2; GB8513721D0; FR2565227B1; GB2159520A; JPH0576940B2; BE902528A

Description

Wisconsin Alumni Research Foundation 614 North Walnut Street
Madison, WI 53705 / USA

1,24-Dihydroxy-&²²-Vitamin D₃ und

Verfahren zu dessen Herstellung

Technisches Gebiet 20

Die Erfindung betrifft neue Derivate von Vitamin D_ und ein Verfahren zu deren Herstellung.

Insbesondere betrifft die Erfindung 1,24-dihydroxylierte-

22
Δ -Vitamin D₃~Verbindungen.

Hintergrund der Erfindung

Seit der Entdeckung, daß die aktive hormonale Form von Vitamin D bei der Stimulierung des intestinalen Calciumtransports, des intestinalen Phosphattransports und der Knochen-Calcium-Mobilisierung das 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ (1,25-(OH)₂D₃) ist, wurde ein bemerkenswertes Interesse entwickelt bezüglich der chemischen Synthese von Analogverbindungen dieser Verbindung unter Berücksichtigung der Auffindung derartiger Analogverbindungen, die entweder

■ ^.

eine erhöhte biologische Aktivität aufweisen oder Spezielle Wirkungen bezüglich eines bestimmten Zielörgans aufweisen. Die wirksamsten Analogverbindungen, die bislang hergestellt wurden, sind 26,26,26,27,27,27-Hexafluor-1,25-dihydroxyvitamin D₃ (26,27,F₆~1,25-(OH)₂D₃) (US-Patentschrift 4 358 406) und 24,24-Difluor-1,25-dihydroxyvitamin D₃ (24,24,F₂-I,25-(OH)₂D₃) (US-Patentschrift 4 201 881). Diese Verbindungen stellen eine Wirksamkeit zur Verfügung, die mindestens den zehnfachen Wert der natürlichen Hormone beträgt. Alle anderen Modifizierungen der Seitenkette scheinen die biologische Aktivität zu verringern, mit Ausnahme der Ergosterol-Seitenkette, die eine NichtSättigung an der Δ -Stellung und eine Methylgruppe an der 24s-Stel~ lung aufweist. Diese Verbindung scheint in gleichem Maße wirksam zu sein bei der Bindung an den Küken-Intestinal-Cytosol-Rezeptor und bezüglich der biologischen Wirksamkeit gegenüber Säugetieren, zeigt jedoch nur ein Zehntel der Wirksamkeit bei Vögeln. Es ist somit von Interesse, verschiedene Analogverbindungen herzustellen, worin jede dieser Modifizierungen getrennt untersucht wird. Ferner ist die Tatsache von Interesse, daß 1,24-Dihydroxyvitamin D₃ (1,24-(OH)₂D₃) in gleichem Maße wie 1,25-(OH)₂D₃ wirksam ist bei der Bindung an den Küken-Intestinal-Rezeptor, jedoch bei der Verabfolgung in vivo 1,24R-(OH)2D3 lediglich ein Zehntel der Wirksamkeit von 1,25-(OH)₂D₃ aufweist, und daß das 1,24S-Isomer noch weniger wirksam als das 1,24R-Isomer ist.

Offenbarung der Erfindung

Zwei neue Vitamin D-Derivate wurden nun hergestellt. Diese Verbindungen sind die trans-Isomeren von 1,24-Dihydroxyvitamin D₃ (1,24-(OH)₂D₃), worin eine Doppelbindung in die 22-Stellung eingeführt wurde und eine Hydroxylfunktion in der S- und R-Sfcellung am Kohlenstoffatom 24 substituiert

wurde. Die Verbindungen sind (22E,24S)-1,24-Dihydroxy-Δ -

vitamin D und (22E,24R)-1,24-Dihydroxy-A²^-vitamin D_.

Beide Verbindungen weisen eine dem Vitamin D ähnliche Wirksamkeit auf*, wobei die 24-S-Verbindung die größere Wirksamkeit der beiden Verbindungen zeigt und sich der Wirksamkeit von 1,25-(OH)₂P₂ annähert.

Bestes Verfahren zur Durchführung der Erfindung

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können gemäß dem folgenden schematischen Diagramm und nach der Beschreibung synthetisiert werden, worin gleiche Verbindungen durch gleiche Zahlen identifiziert werden.

In der nachfolgenden Beschreibung werden die physiko-chemisehen Messungen folgendermaßen durchgeführt: Schmelzpunk te wurden bestimmt mit einem Heißstufen-Mikroskop und wurden nicht korrigiert. UV-Spektren wurden in ethanolischer Lösung mit einem Shimadzu UV-200-Doppelstrahl-Spektrometer erhalten. H-NMR-Spektren wurden mit einem Hitachi R-24A-Spektrometer, einem JEOL PS-100-Spektrometer oder einem JEOL FX-400-Spektrometer vermessen. Alle NMR-Spektren wurden in einer DCDl₃~Lösung mit Tetramethylsilan als interner Referenz aufgenommen. Massenspektren wurden mit

2ß einem Shimadzu LKB 9000S-Spektrometer bei 70 eV erhalten. Säulenchromatographie wurde durchgeführt mit Silikagel (Merck, 70-230 mesh). Präparative Dünnschichtchromatographie wurde an vorbeschichteten Platten aus Silikagel (Merck, Silicagel 60 F₃₅₄) durchgeführt. Die übliche Auf-

arbeitung betrifft die Verdünnung mit Wasser, Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, Waschen bis zur Neutralität, Trocknen über Magnesiumsulfat, Filtrieren und Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck

-fr- · 5

Schema

S, X=CHO

8-a. R₁=OH, R₂-K S-b R^-OMXPA/ R. 9-a R₁-H, >-b R,=H.

OMa

11 R₁-OH, R₂-H

14-a 14-b 15-a 15-b

Anmerkung: THP = Tetrahydropyranyl

MPTA = α-Methoxy-oc-trif luormethylphenylacetyl

ph = Phenyl

.,a ■» » ♦ ·■ -s . ο « -i- s

Synthese

22-Hydroxy-23,24-dinorchol-1 ,4 _y6-trien-3-on (_2) · Einer Lösung von Sß-Acetoxydinorcholensäure -(JU' (7,0 g, 18,04 mMol) in THF (20 ml) wurde Lithiumäluminiumhydrid (3,0 g, 78,95 mMol) zugesetzt. Dieses Gemisch wurde 14 Stunden bei 60⁰C gerührt. Dem Reaktionsgemisch wurden Wasser und Ethylacetat vorsichtig zugesetzt. Das Filtrieren und Abziehen des Lösungsmittels ergab den Rückstand (5,2 g). Der Rückstand in Dioxan (140 ml) wurde mit Dichlordicyanbenzochinon (11,7 g, 51,54 mMol) unter Rückfluß für 14 Stunden behandelt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch filtriert und das Filtrat wurde eingedampft, um einen Rückstand zu hinterlassen, der auf eine Säule von Aluminiumoxid (200 g) gegeben wurde. Die Eluation mit Dichlormethan lieferte das Trienon [2) (2,8 g, 47 %): Schmelzpunkt 156-157°C (aus Ether).

UV/\^Et0H nm (£): 299 (13000), 252 (9200) , 224 (12000),

a max

¹H-NMR (CDCl₃): 0,80 (3H, s, 18-H₃), 1,04 (3H, d, J=6 Hz, 21-H₃), 1,21 (3H, s, 19-H₃), 3,10-3,80 (3H, m, 22-H₂ und OH), 5,90-6,40 (4H, m, 2-H, 4-H, 6-H und 7-H), 7,05 (1H, d, J=10 Hz, 1-H), MS m/z: 326 (M⁺), 311, 308, 293, 267, 112.

22-Tetrahydropyranyloxy-23,24-dinorchol-1α,2a-epoxy-4,6-dien-3-on

Der Alkohol U) (2,7 g, 8,28 mMol) in Dichlormethan (50 ml) würde mit Dihydropyran (1,5 ml, 16,42 mMol) und p-Toluolsulfonsäure (50 mg) bei Raumtemperatur für 1 Stunde behandelt. Die übliche Aufarbeitung (Ethylacetat zur Extraktion) ergab das Rohprodukt. Zu einer Lösung dieses Produkts in MeOH (70 ml) wurden.30 % H₃O₂ (4,8 ml) und 10 % NaOH/MeOH (0,74 ml) zugesetzt und dieses Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 14 Stunden gerührt. Die übliche Aufarbeitung

3J? (Ethylacetat zur Extraktion) ergab ein Rohprodukt, welches auf eine Säule aus Silikagel (50 g) gegeben wurde. Die

Eluation mit Benzol-Ethylacetat (100:1) lieferte das

Epoxid (3_) (1,45 g, 41 %): Schmelzpunkt 113-115°C (Hexan). UvA^Et0H nm (e): 290 (22000), ¹H-NMR (CDCl₇): 0,80 (3H, s, 18-H₃), 1,07 (3Ή, d, J=6 Hz, 21-H₃), 1,18 (3H, s, 19-H₃), 3,38 (1H, dd, J=4 und 1,5 Hz, 1-H), 3,55 (1H, d, J=4 Hz, 2-H), 3,30-4,10 (4H, m, 22-H₂ und THP), 4,50 (1H, m, THP), 5,58 (1H, d, J=1,5 Hz, 4-H), 6,02 (2H, s, 6-H und 7-H), MS m/z_: 342 (M⁺ - DHP), 324 (M⁺ -THPOH), 309, 283, 85.

23,24-Dinorchol-5-en-1 α,3ß,22-triol-1 ,3-diacetat (4_) Lithium (3,25 g) wurde in kleinen Portionen bei -78⁰C unter Argonatmosphäre über einen Zeitraum von 30 Minuten flüssigem Ammoniak (130 ml) zugesetzt. Nach 1-stündigem Rühren bei -78°C wurde das Epoxid (3_) (1,33 g, 3,12 mMol) in wasserfreiem THF (100 ml) tropfenweise bei -78°C über einen Zeitraum von 30 Minuten zugegeben und dieses Gemisch wurde bei -78°C für 1 Stunde gerührt. Diesem Reaktionsgemisch wurde wasserfreies NH₄Cl (40 g) in kleinen Portionen bei -78⁰C über einen Zeitraum von 1 Stunde zugesetzt♦ Nach 1,5 Stunden würde das Kühlbad entfernt und der größte Teil des Ammoniaks wurde mit durchperlendem Argon entfernt. Die übliche Aufarbeitung (Ether zur Extraktion) ergab das Rohprodukt (1,23 g). Dieses wurde mit Essigsäureanhydrid (3 ml) und Pyridin (4 ml) bei Raumtemperatur für 14 Stunden behandelt. Die übliche Aufarbeitung (Ethylacetat zur Extraktion) ergab ein Rohprodukt (1,3 g). Dieses Rohprodukt in Methanol (4 ml) und THF (5 ml) wurde mit 2 Tropfen 2M HCl bei Raumtemperatur für 2 Stunden behandelt. Die übliche Aufarbeitung (Ether zur Extraktion) ergab ein Rohprodukt (1,1 g), welches auf eine Säule aus Silikagel (40 g) aufgegeben wurde. Die Eluation mit Benzol-Ethylacetat (10:1) lieferte das 1,3-Diacetat (4_) (575 mg, 42 %) % Öl, ¹H-NMR (CDCl₃): 0,68 (3H, S, 18-H₃) , 1,07 (3H, s, 19-H₃), 1,99 (3H, s, Acetyl), 2,02 (3H, s, Acetyl), 3,02-3,72 (2H, m, 22-H₂), 4,79 (1H, m, 3-H), 4,98 (1H, m, 1-H), 5,46 (1H, m, 6-H), MS m/z_: 372 (M⁺ - CH₃COOH), 313, 312, 297, 279, 253.

1g,3ß-Diacetoxy-23,24-dinorcholan-22-al _ per 22-Alkohol [i) (550 mg, 1,27 mMol) in Dichlormethan (20 ml) wurde mit Pyridiniumchlorchromat (836 mg, 3,85 mMol) und Natriumacetat (100 mg) bei Raumtemperatur für 1 Stunde behandelt. Diesem Reaktionsgemisch wurde Ether (100 ml) zugesetzt und dieses Gemisch wurde durch eine kurze Florisilsäule filtriert* Das Filtrat wurde eingeengt, um einen Rückstand zu hinterlassen, welcher auf eine Silikagelsäule (20 g) aufgegeben wurde. Die Eluation mit 1Q Benzol-Ethylacetat (20:1) lieferte den 22-Aldehyd (5_) (448 mg, 82 %): Öl, ¹H-NMR (CDCl₃): 0,70 (3H, s, 18-H₃), 1,07 (3H, s, 19-H₃), 1,09 (3H, d, J=7 Hz, 21-H₃), 1,99 (3H, s, Acetyl), 2,02 (3H, s, Acetyl), 4,79 (1H, m, 3-H), 4,98 (1H, m, 1-H), 5,45 (1H, m, 6-H), 9,45 (1H, d, J=4 Hz, 22-H), MS m/z: 310 (M⁺- 2 χ CH-COOH), 295, 253.

(22E)-1 α,Sß-Diacetoxy-cholesta-S,22-dien-24-on (6_) Einer Lösung des 22-Aldehyds (5_) (420 mg, 0,977 mMol) in Dimethylsulfoxid (30 ml) wurde Isobutyrylmethylentriphenyl phosphoran (2,03 g, 5,87 mMol) zugegeben. Dieses Gemisch wurde für 72 Stunden bei 95 ⁰C gerührt. Die übliche Aufarbeitung (Ether zur Extraktion) ergab ein Rohprodukt, welches auf eine Säule aus Silikagel (10 g) aufgegeben wurde. Die Eluation mit Benzol-Ethylacetat (10:1) lieferte das Enon {§) (392 mg, 81 %): Öl, ¹H-NMR (CDCl₃): 0,71 (3H, s, 18-H₃), 1,08 (3H, s, 19-H₃), 1,09 (9H, d, J=7 Hz, 21-H₃, 26-H₃ und 27-H₃), 1,99 (3H, s, Acetyl), 2,02 (3H, S, Acetyl),4,79 (1H, m, 3-H), 4,98 (1H, m, 1-H), 5,45 (IH, m, 6-H), 5,96 (1H, d, J=16 Hz, 23-H), 6,65 (TH, dd,

J=16 und 8 Hz, 22-H), MS m/z: 438 (M⁺-CH₃COOH), 378 (M⁺- 2 χ CH₃COOH), 363, 335, 307, 253, 43.

(22E)-1g,3ß-Diacetoxy-5g,8a-(3,5-dioxo-4-phenyl-1,2,4-triazolidino)-cholesta-6,22-dien-24-on (2) Zu einer Lösung des Enons (£) (385 mg, 0,773 mMol) in Kohlenstofftetrachlorid (20 ml) wurde N-Bromsuccinimid (193 mg, 1,4 Äq) zugegeben und.dieses Gemisch wurde unter

Argonatmosphäre für 25 Minuten unter Rückfluß erhitzt.

Nach dem Abkühlen auf 0⁰C wurde der erhaltene Niederschlag abfiltriert. Das Filtrat wurde unterhalb von 40⁰C eingeengt, wobei ein 'Rückstand verblieb. Dieser Rückstand in THF (15 ml) wurde mit einer katalytischen Menge an Tetra-η-butylammoniumbromid bei Raumtemperatur für 50 Minuten behandelt. Sodann wurde zu diesem Reaktionsgemisch eine Lösung von Tetra-n-butylammoniumfluorid in THF (3,5 ml, 3,5 mMol) zugesetzt und dieses Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt. Die übliche Aufarbeitung (Ethylacetat zur Extraktion) ergab ein rohes 5,7-Dien (380 mg). Dieses Dien in Chloroform (15 ml) wurde mit einer Lösung von "J-Phenyl-1 ,2,4-triazolin-3,5-dion (95 mg, 0,54 mMol) in Chloroform (10 ml) bei Raumtemperatur für 1 Stunde behandelt. Die Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck ergab den Rückstand, welcher auf eine Silikagelsäule (10 g) aufgegeben wurde. Die Eluation mit Benzol-Ethylacetat (5:1) lieferte das Triazolin-Addukt (2) (191 mg, 37 %): öl, ¹H-NMR (CDCl₃): 0,83 (3H, s, 16-H₃), 1,01 (3H, s, 10-H₃), 1,08 (9H, d, J=7 Hz, 21-H₃, 26-H₃ und 27-H₃), 1,97 (3H, s, Acetyl), 1,98 (3H, s, Acetyl), 5,03 (1H, m, 1-H), 5,84 (1H, m, 3-H) , 5,96 (1H, d, J=16 Hz, 23-H), 6,28 (1H,d, J=8,5Hz, 6-H oder 7-H), 6,41 (1H, d, J=8,5 Hz, 6-H oder 7-H), 6,65 (1H, dd, J=16 und 8 Hz, 22-H), 7,20-7,60 (5H, m, -ph), MS m/z: 436 (M⁺ - PhC₀N-O₉-CH₃COOH), 376 (436 -CH₃COOH), 333, 305, 251, 43.

(22E,24R)- und (22E,24S)-1a,3ß-Diacetoxy-5a,8a-(3,5-dioxo-4-phenyl-1,2 ,4-triazolidino) T-cholesta-6 ,22-dien-24-ol (9a, und 8a)

Das Enon (7> (150 mg , 0,224 mMol) in THF (6 ml) und Methanol (6 ml) wurde mit Natriumborhydrid (17 mg, 0,448 mMol) bei Raumtemperatur für 10 Minuten behandelt. Die übliche Aufarbeitung (Ether zur Extraktion) ergab ein Rohprodukt (150 mg), welches der präparativen TLC unterworfen wurde (Benzol-Ethylacetat, 3:1, 7mal entwickelt). Das Band mit

. jo-

einem R^-Wert 0,53 wurde abgestreift und mit Ethylacetat eluiert. Die Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck ergab den weniger polaren (24S)-24-Alkohol (8a) (43,2 mg, 28,7 %): Schmelzpunkt 142-144°C (Ether-Hexan), MS m/z: 438 (M⁺- PhC₃N₃O₃ - CH₃COOH), 420, 378 (438 -CH₃COOH), 360, 363, 345, 335, 318, 109, 43. Das Band mit einem R^-Wert 0,50 wurde abgestreift und mit Ethylacetat eluiert, um den höher polaren (24R)-24-Alkohol (9a.) (64,8 mg, 43,1 %) zu erhalten: Schmelzpunkt 140-142⁰C (Ether-Hexan) . Das Massenspektrum von (9a.) war mit demjenigen von (8_a) identisch.

(22E) ,24S) -ig^ß-Diacetoxy-ScSa- (3 ,5-dioxo-4-phenyl-1,2,4-triazolidino)-cholesta-6,22-dien-24-ol (+)-MTPA- Ester (8b)

Der 24-Alkohol (8a) (8,3 mg, 0,0123 mMol) in Pyridin (1 ml) wurde mit 3 Tropfen (+)-MTPA-Cl bei Raumtemperatur für 1 Stunde behandelt. Die-übliche Aufarbeitung (Ethylacetat) lieferte den MTPA-Ester (8b) (10,4 mg, 95 %):

2Q ¹H-NMR (CDCl₃, 100 MHz): 0,85 (3H, s, 18-H₃), 0,88 (3H, d, J=7 Hz, 26-H₃), 0,92 (3H, d, J=7 Hz, 27-H₃), 1,04 (3H, d, J-I Hz, 21-H₃), 1,08 (3H, s, 19-H₃), 2,03 (3H,'s, Acetyl), 2,06 (3H, s, Acetyl), 3,27 (1H, m), 3,54 (3H, s, -OCH₃), 6,28 (1H, d, J=8 Hz, 6-H oder 7-H), 6,41 (1H, d, J=8 Hz, 6-H oder 7-H), 7,24-7,56 (5H, m, -ph).

(22E,24R)-1 α,3ß-Diacetoxy-5a,8 α-(3,5-dioxo-4-phenyl-1,2,4-triazolidino)-cholesta-6,22-dien-24-ol-24-(+)-MTPA-Ester

Der 24-Alkohol (9a.) (7,9 mg, 0,0117 mMol) wurde gemäß der Beschreibung für (8b) in den MTPA-Ester (9b>) (9,3 mg, 89 %) überführt: ¹H-NMR (CDCl₃, 100MHz): 0,83 (3H, s, 18-H₃), 0,88 (6H, d, J=7 Hz, 26-H₃ und 27-H₃), 1,04 (3H, d, J=7 Hz, 21-H₃), 1,08 (3H, s, 19-H₃), 2,03 (3H, s, Acetyl), 2,05 (3H, s, Acetyl), 3,27 (1H, m), 3,54 (3H, s, -OCH₃), 6,28 (1H, d, J=8 Hz, 6-H oder 7-H), 6,41 (1H, d, J=8 Hz, 6-H oder 7-H), 7,24-7,56 (5H, m, -ph).

-?-■ M ■

(22E, 24S)-6B-Methoxy-3a, S-

24-(+)-MTPA-Ester (14b)

Der bekannte (24S) -24-Alkohol (Ua.) (10,1 mg, 0,0244 mMol) wurde gemäß der'Beschreibung für (8b) in den (24S)-MTPA-Ester (Jib) (8,2 mg, 54 %) überführt: ¹H-NMR (CDCl₃, 100 MHz): 0,72 (3H, S, 18-H₃), 0,89 (3H, d, J=7 Hz, 26-H₃), 0,93 (3H, d, J=7 Hz, 27-H₃), 1,02 (3H, d, J=7 Hz, 21-H₃), 1,04 (3H, s, 19-H₃), 2,75 (1H, m, 6-H) , 3,33 (3H, s, -OCH₃), 3,54 (3H, s, -OCH₃).

(22E,24R)-6ß-Methoxy-3a,5-cyclo-5a-cholesta-22-en-24-ol-24-(+)-MTPA-Ester (15b)

Der bekannte (24R)-24-Alkohol (15a) (11,0 mg, 0,0266 mMol) wurde gemäß der Beschreibung für (8b) in den (24R)-MTPA-Ester (J_5b) (9,4 mg, 56 %) überführt: ¹H-NMR (CDCl₃, 100 MHz): 0,76 (3H, s, 18-H₃), 0,88 (6H, d, J=7 Hz, 26-H₃ und 27-H₃), 1,04 (3H, d, J=7 Hz, 21-H₃), 1,05 (3H, s, 19-H₃), 2,77 (1H, m, 6-H), 3,36 (3H, s, -OCH₃), 3,57 (3H, s, -OCH₃).

(22E,24R)-Cholesta-5,7,22-trien-1α,3ß,24-triol (JJ)) Das Triazolin-Addukt (9a) (15,0 mg, 0,0223 mMol) in THF (5 ml) wurde unter Rückfluß für 2 Stunden mit Lithiumaluminiumhydrid (5 mg, 0,132 mMol) behandelt. Diesem Reaktionsgemisch wurde Wasser zugesetzt und es wurde filtriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingeengt, wobei ein Rückstand verblieb,.welcher der präparativen TLC unterworfen wurde (Benzol-Ethylacetat, 1:1, dreimal entwickelt). Das Band mit einem R_£-Wert 0,35 wurde abgestreift und mit Ethylacetat eluiert. Die Entfernung des Losungsmittels lieferte das 5,7-Dien (JJ^) (3,3 mg, 36 %), UVA^°^H : 294, 282, 272, MS m/z: 414 (M⁺), 396, 381, 378, 363, 353, 335, 317, 287, 269, 251, 127, 109.

(22E,24S)-Cholesta-5,7,22-trien-1α,3ß,24-triol [Vl) Das Triazolin-Addukt (8a) (16,5 mg, 0,0245 mMol) wurde ge-

-yz- ■ M'

maß der Beschreibung für (JjO) in das 5,7-Dien (VO (3,5 mg, 35 %) überführt. Die UV- und MS-Spektren von (JJJ waren mit denjenigen von (JjO) identisch.

(22E,24R) -la ,24-Dihydroxy-A²²-vitantin D ₃ (Jj2) Eine Lösung des (24R) -5,7-Diens (JjO) (3,3 mg, 7,97 mMol) in Benzol (90 ml) und Ethanol (40 ml) wurde mit einer Mitteldruck-Quecksilberlampe durch ein Vycor-Filter für 2,5 Minuten unter Eiskühlung und unter Argonatmosphäre bestrahlt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde unter Argonatmosphäre und unter Rückfluß erhitzt. Die Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck ergab ein Rohprodukt, welches der ,präparativen TLC unterworfen wurde (Benzpl-Ethylacetat, 1:1, dreimal entwickelt). Das Band mit einem R_f-Wert 0,40 wurde abgestreift und mit Ethylacetat eluiert. Die Entfernung des Lösungsmittels unter vermin- ·, dertem Druck lieferte die Vitamin D₃-Analogverbindung (12) (0,59 mg, 18 %). Diese wurde weiter durch Hochleistungs-Flüssigkeit schromatographie über eine Zorbax-SIL-Säule (4,6 mm χ 15 cm) bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min mit 2 % Methanol in Dichlormethan als Eluationsmittel gereinigt. Die Retentionszeit von (Jj2) betrug 5,2 Minuten. UVÄJ^°^H 265 nm,Ά ?J°^H 228 nm, MS m/z: 414 (M⁺), 396,. 378, 363, 360, 345, 335, 317, 287, 269, 251, 249, 152, 135, 109. ¹H-NMR (CDCl₃, 400,5 MHz): 0,57 (3H, S, 18-H₃), 0,87 (3H, d, J=6,7 Hz, 26-H₃), 0,92 (3H, d, J=6,7 Hz, 27-H₃), 1,04 (3H, d, J=6,6 Hz, 21-H₃), 2,32 (1H, dd, J=i13,7 und 6,6 Hz), 2,60 (1H, dd, J=13,4 und 3,4 Hz), 2,83 (1H, dd, J=12,6 und 4,0 Hz), 4,23 (1H, m, 3-H), 4,43 (1H, m, 1-H), 5,00 (1H, bs, W_1/2=4,3 Hz, 19-H9, 5,33 (1H, bs, W₁,₂=4,3 Hz, 19-H) 5,39 (1H, dd, J=15,2 und 7,1 Hz, 22-H), 5,51 (1H, dd, J=15,2 und 8,3 Hz, 23-H), 6,01 (1H, d, J=11,4 Hz, 6-H), 6,38 (1H, d, J=11,4 Hz, 7-H).

(22E,24S) -1 α, 24-Dihydroxy-A²²-vitamin D ₃ (jU) Das (24S)-5,7-Dien (JM_) (3,5 mg, 8,45 mMol) wurde gemäß der Beschreibung für (JT2) in die Vitamin D₃~Form (13)

(0,56 mg, 16 %) umgewandelt. Die Retentionszeit von (13) unter der oben beschriebenen HPLC-Bedingung betrug 4,7 Minuten. Die UV- und MS-Spektren von (Jl_3,) waren mit denjenigen von (12) identisch. ¹H-NMR (CDCl,, 400,5 MHz): 0,57 (3H, s, 18-H₃), 0,87 (3H, d, J=6,7 Hz, 26-H₃), 0,92 (3H, d, J=6,7 Hz, 27-H₃), 1,05 (3H, d, J=6,6 Hz, 21-H₃), 2,32 (1H, dd, J=13,7 und 6,6 Hz), 2,60 (1H, dd, J=13,4 und 3,4 Hz), 2,83 (1H, dd, J=12,6 und 4,0 Hz), 4,23 (1H, m, 3-H) , .4,43 '(1H, m, 1-H) , 5,00 (1H, bs, W_1/2=4,3 Hz, 19-H), 5,33 (1H, bs, W_1/2=4,3 Hz, 19-H), 5,37 (IH, dd, J=15,4 und 7,5 Hz, 22-H), 5,46 (1H, dd, J=15,4 und 8,3 Hz, 23-H), 6,01 (1H, d, J=11,4 Hz, 6-H), 6,38 (1H, d, J=11,4 Hz, 7-H).

Zur Bestimmung der Konfiguration an der C-24-Stellung wurden die 24-Alkohole 8a und 9ai in die entsprechenden (♦)'-MTPA-Ester 8b und 9b überführt. Die ¹H-NMR-Spektren von 8b und 9b wurden mit denjenigen der (+)-MTPA-Ester 14b und 15b verglichen, welche von dem bekannten (24S)-24-Alkohol 14a bzw. dem (24R)-Isomeren 15a stammten. Die H-NMR· Daten der Methylgruppen von 8b, 9b, 14b und 15b sind in Tabelle 1 gezeigt.

Wie in Tabelle 2 gezeigt wird, befinden sich die ¹H-NMR-Daten von C-22- und C-23-Protonen der (24R)-Vitamin D₃-

Analogverbindung J_2 und diejenigen des bekannten (24S)-Isomeren J_3_ in guter Übereinstimmung mit denjenigen des bekannten (24R)-Allylalkohols 15a bzw. dessen (24S)-IsO-mer 14a. Diese H-NMR-Daten (wie sie in Tabelle 1 und Tabelle 2 gezeigt sind) bestätigen die Zuweisung der synthetischen Vitamin D-j-Analogverbindungen I^ und 13.

TABELLE 1

¹H-NMR (100 MHz)-Spektraldaten der Methylgruppen 8b_, SJb, 14b und 15b

Chemische Verschiebung ^a Verbindung 18-Me 19-Me 21-Me 26-Me und 27-Me

1,04 (J=7) 0,88 (J=7), 0,92 (J=7) 1,04 (J=7) 0,88 (J=7)

10 -^u ^W"^Ä """" ¹'^{02 (J=7)} °'^{89 (J=7)}' °'^{93 (J=7)}

__ 1,04 (J=7) 0,88 (J=7)

Die Verschiebungen sind angegeben in ppm und J-Werten in Hz

8b	O	,85	1	,08
9b	O	,83	1	•,08
14b	O	,72	1	,04
15b	O	,76	1	,05

TABELLE 2

20 H-NMR-Spektraldaten vom C-22- und C-23-Proton

in 12, j_3 (400 MHz) und t4a, JjLa (360 MHz)

Chemische Verschiebung

Verbindung 22-H 23-H

25 V2 5,39 (dd, J=15,2, 7,1) 5,51 (dd, J=15,2, 8,3

15a 5,374 (dd, J=15,39, 6,80) 5,494 (dd, J=15,40, 8,23)

JJ3 5,37 (dd, J=15,4, 7,5) 5,46 (dd, J=15,4, 8,3)

14a 5,353 (dd, J=15,38, 7,06) 5,448 (dd,. J=15,03, 8,20)

on Die Verschiebungen sind angegeben in ppm und

J-Werten in Hz

Biologische Aktivität

Die biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindun-35 gen wurde in Übereinstimmung mit den gut bekannten Verfahren gemäß nachstehender Angabe gemessen.

ι ha

Ratten

Männliche Weanling-Ratten wurden von der Firma Holtzman (Madison, WI) bezogen und entweder mit" einer Vitamin D^J Mangeldiät von'niedrigem Phosphorgehalt (0,1 %) und hohem Calciumgehalt (1,2 %) gefüttert gemäß der Beschreibung von Tanaka und DeLuca (Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA (1974), 71, 1040) (Tabelle 3) oder mit einer Vitamin D-Mangeldiät von geringem Calciumgehalt (0,02 %) und einem adäquaten Phosphorgehalt (0,3 %) gemäß, der Beschreibung von Suda et al (J. Nutrition (1970) 100, 1049) (Tabelle 4) für einen Zeitraum von 3 Wochen.

Bestimmung des Calciums und des anorganischen Phosphors im Serum

Serum-Calcium wurde durch Atomabsorptionsspektrometrie bestimmt unter Verwendung von Proben, die in 0,1 % Lanthanchlorid verdünnt waren. Das verwendete Instrument war ein Perkin-Elmer-Atomabsorptionsspektrometer Modell 403. Der anorganische Phosphor im Serum wurde nach dem VeriahrW von Chen et al (Anal. Chem. (1956) 28, 1756) bestimmt.

Messung der Knochenasche

Die Messungen der Knochenasche wurden an Oberschenkelknochen durchgeführt. Das Bindegewebe wurde entfernt, die Oberschenkelknochen wurden, nacheinander für 24 Stunden mit 100 % Ethanol und anschließend für 24 Stunden mit 100 % Diethylether unter Verwendung eines Soxhlet-Extraktors extrahiert. Der fettfreie Knochen wurde 24 Stunden getrocknet und in einem Muffelofen bei 650⁰C für 24 Stunden verascht.

Messung der intestlnalen Calciumtransportaktivität Der intestinale Calciumtransport wurde gemessen unter Verwendung des Verfahrens mit dem umgestülpten Duodenumbeutel gemäß der Beschreibung von Martin und DeLuca (Am. J. Physiol. (1969) 216, 1351).

Verdrängung von 1,25- (OH) >,- [26 ,27- H]D ₃ vom Küken-Intesti nal-Cytosol-Rezeptorprotein durch eine der Verbindungen Die Verdrängung von 1,25-(OH)»-[26,27-³H]D₃ vom Küken-Intestinal-Rezeptor wurde bestimmt nach dem Verfahren von Shepard et al (Biochem. J. (1979) 182, 55-69).

Die in diesen Messungen erhaltenen Ergebnisse sind in Figur 1 und in den Tabellen 3 und 4 angegeben.

TABELLE 3

Anstieg der Konzentration von anorganischem Phosphor im Serum und von Knochenasche in Ansprache auf : (22E,24R)-1 ,,24-(OH)₂-A²²D₃, (22E,24S)-1 ,24-(OH) ₂~A²²-D₃ Oder 1,25-(OH)₂D₃

Oder 1,25-	(OH)	2^D3	anorganischer im Serum (mg/100. ml)	Phosphor	Knochenasche (mg)	1 4,6	e)
Vorgegebene Verbindung		2,4 +0,1*	a)	35,0	+_ 6,9	t)
Keine		3,3 + 0,4	^b)	53,2	+ 6,7
1,25-(OH)₂D₃		2,7 + 0,4	c)	35,0	+ 4,2	g)
(22E,24R)-1 ,	24-	2,9 _+ 0,4	α)	46,5
(22E,24S)-1,	24-

Mänriliche Weanling-Rätten wurden mit einer Rachitis erzeugenden Diät für 3 Wochen gefüttert. Sie erhielten sodann 32,5 ρ Mol/Tag einer der Verbindungen aufgelöst in einem 0,1 ml-Gemisch von 95 % Ethanol/Propylenglykol (5/95) subkutan täglich für einen Zeitraum von 7 Tagen. Ratten in einer Kontrollgruppe wurde der Träger verabfolgt. Jede Gruppe umfaßte 6 bis 7 Ratten. * Standard-Abweichung von dem Mittel. Deutlich unterschiedlich: a) von b) ρ < 0,001

c) ρ < 0,025

d) ρ < 0,005

e) von f) und g) ρ < 0,001

f) von g) ρ < 0,05

* *
• Si.

TABELLE 4

Anstieg des intestinalen Calciumtransports und der Serum-Calciumkonzentration in Ansprache auf (22E,24R)-i'_f24-(OH) ₂-^?²-D₃, (22E,24S)-1,24-(OH) ₂~ ^²²-D₃ oder 1,25-(OH)₂D₃

vorgegebene intestihaler CaI- Serum-Calcium Verbindung ciumtransport

(Ca serosal/Ca mucosal) (mg/100 irtl)

keine 2,5 +_ 0,3*^a) 3,5 ± 0,1 ^e)

1,25-(OH)₂D₃ 6,4 +_ 1,1 ^b) 3,8 +; 0,1 ^f) (22E,24R)-1,24-

(OH)₂-^?²-D₃. 3,4 + 0,6 ^c) 3,4+0,1 (22E,24S)-1,24-

(OH)₂-^²-D₃ 3,9 +_ 0,4 ^d) 3,6 +_' 0,1

Männliche Weanling-Ratten wurden mit einer Vitamin D-Mangeldiät von geringem Calciumgehalt für 3 Wochen gefüttert. Sie erhielten sodann 32,5 ρ Mol/Tag einer der Verbindungen aufgelöst in einem 0,1 ml-Gemisch von 95 % Ethanol/Propylenglykol (5/95) subkutan täglich für einen Zeitraum von 7 Tagen. Ratten in einer Kontrollgruppe erhielten den Träger. Jede Gruppe umfaßte 7 Ratten. * Standardr-Abweichung vom Mittel.

Deutlich unterschiedlich: a) von b) und d) ρ < 0,001

a) von c) ρ < 0,005

b) von c) und d) ρ < 0,001

e) von f) ρ < 0,005

Figur 1 demonstriert die Fähigkeit der beiden synthetic sehen 1,24-(OH)₂D -Isomeren zur Verdrängung von radioaktiv markiertem 1,25-(OH) ₂D₃ aus dem Küken-Intestinal-¹ Rezeptor. Die Ergebnisse demonstrieren, daß das 24S-Isomere

in gleichem Maße wie das nicht markierte 1/25-(OH)₂D₃ wirksam jLst bei der Verdrängung des radioaktiv markierten 1,25-(OH)₂D- von dem Rezeptor. Es zeigte sich, daß das 24R-Ispmere etwa ein Zehntel der Aktivität von 1,25-(OH)₂D₃ 5· oder des S-isomers aufweist. Bei der Stimulierung des intestinalen CaIciumtransports von Ratten auf einer Vitamin D-Mangeldiät geringen Calciumgehaltes ist es offensichtlich, daß kein Isomer 1,25-(OH)₂D₃ hinsichtlich dieser Kapazität gleichkommt (Tabelle 4). Dies steht im Gegensatz zu den Ergebnissen, die bei dem Küken-Intestinal-Rezeptor erhalten wurden, worin das S-Isomer dem 1,25-(OH)₂D₃ hinsichtlich der Fähigkeit zur Verdrängung des radioaktiv markierten 1,25-(QH)„D_ aus dem Rezeptor gleichkam. Keines der Isomeren war bei den verabfolgten Dosen in der Lage, eine Knochencalcium-Mobilisierungsansprache hervorzurufen, wie durch die Anhebung des Serumcalciums vpn Ratten auf einer Diät mit geringem CaIciumgehalt unterstrichen wird. Im Gegensatz dazu stimulierte 1,24-(OH)₉D-diese Ansprache auf ein minimales Maß bei dieser Dosierung.

Tabelle 3 veranschaulicht die Fähigkeit der Isomeren zur Mineralisierung des Oberschenkelknochens von rachitischen Ratten. Die verwendete Dosierung von 1,25-(OH)₂D- war voll in der Lage, den rachitischen Oberschenkelknochen innerhalb von 7 Tagen zu mineralisieren. Auf der anderen Seite war das R-Isomer nicht in der Lage, deutliche Knochenmengen bei diesem Dosierungsmaß zu mineralisieren, während die 24S-Verbindung weniger aktiv war als 1,25-(OH)₂D₃, jedoch deutlich wirksam.war bezüglich dieser Fähigkeit.

Der Anstieg der Konzentration von anorganischem Phosphor im Serum bei Tieren auf einer Diät geringen Phosphorgehaltes igt eine kritische Ansprache bezüglich der Mineralisierüng von Knochen. Es ist deutlich* daß alle drei Formen von Vitamin D die Konzentration des anorganischen Phosphors

im Serum stimuliertenj jedoch war keines der Isomeren bezüglich dieser Fähigkeit dem 1,25-(OH)₂D₃ gleich.

Die gemessene biologische Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen deutet auf ihre Verwendung bei physiologischen Zuständen, in denen eine dem Vitamin D ähnliche Wirksamkeit angezeigt ist. Das 1,24S-Isomere kann tatsächlich als eine sehr wirksame 1-hydroxylierte Form von Vitamin D betrachtet werden, welche dort Anwendung findet, wo eine vorzugsweise Wirksamkeit bezüglich der Intestinal- und Knochenminerälisierung im Gegensatz zur Knochenmobili^ sierung in Ordnung zu sein scheint.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen oder Kombinationen davon mit arideren Vitamin D-Derivaten oder anderen therapeutischen Mitteln können leicht verabfolgt werden als sterile parenteral^ Lösungen durch Injektion oder intra*- venöse Verabfolgung oder durch einen Ernährungskanal ii» der Form von oralen Dosierungen oder transdermal Oder durch Suggositor^en. Dosierungen von etwa 0,5 Mikrogrämm bis etwa 25 Mikrogratrm der Verbindungen pro Tag allein oder in Kcmblnaticnmit andaceü·. vitamn D-Derivaten,wobei die Anteile der Verbindungen ih der Kombination abhängig ist von dem speziellen Krankheitszustand, der angesprochen wird, und von dem Maß der gewünschten Knochenmineralisierung und/oder Kno-> chenmobilisierung, sind allgemein wirksam zur Durchführung der vorliegenden Erfindung. Wenn auch die tatsächlich verwendete Menge dejr Verbindungen nicht kritisch ist, sollte in allen Fällen eine hinreichende Menge der Verbindung verwendet werden; um die Knochenmineralisierung zu induzieren. Überschüssige Mengen von etwa 25 Mikrogrämm pro Tag von den Verbindungen allein oder in Kombination mit einem die Knochenmobilisierung induzierenden Vitamin D-Derivat sind allgemein nicht erforderlich, um die gewünsch*- ten Ergebnisse zu erzielen und mögen in der Praxis nicht ökonomisch zu sein. In der Praxis werden höhere DoSierUn**

gen verwendet, wo eine therapeutische Behandlung eines Erkrankungszustandes das gewünschte Ergebnis ist, während geringere Dosierungen allgemein zu prophylaktischen Zwekken verwendet werden, wobei zu verstehen ist, daß die spezifisch verabfolgte Dosierung in jedem gegebenen Fall eingerichtet wird in Übereinstimmung mit den speziell verabfolgten Verbindungen, der zu behandelnden Erkrankung, d^m Zustand des Patienten und den anderen relevanten medizinischen Faktoren, welche die Aktivität des Arzneimittels TO qder die Ansprache des Patienten modifizieren können, wie es den Fachleuten auf diesem Gebiet vertraut ist.

Dosierungsformen der Verbindungen können durch Kombination mit nicht-toxischen, pharmazeutisch verträglichen Trägern, wie sie dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden.

Derartige Träger können entweder Feststoffe oder Flüssigkeiten sein, beispielsweise Maisstärke, Lactose, Sucrose, Erdnußöl, Olivenöl, Sesamöl und Propylenglykol. Wenn ein fester Träger verwendet wird, kann die Dosierungsform der Verbindungen Tabletten, Kapseln, Pulver, Pastillen oder Tabletten (lozenges) sein. Wenn ein flüssiger Träger verwendet wird, können Weichgelatinekapseln oder eine Sirupoder Flüssigkeitssuspension, Emulsionen oder Lösungen die Dosierungsform sein. Die Dosierungsformen können ebenfalls Zusatzstoffe umfassen, wie Konservierungsmittel, Stabilisierungsmittel, Netzmittel oder Emulgiermittel, Lösungspromotoren etc. enthalten. Sie können ebenfalls andere therapeutisch wertvolle Substanzen enthalten.

Es wird verstanden, daß die acylierten Derivate der Verbindungen TO, 11, 12 und 13 als ebenfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet werden, wobei bestimmte Acylate der Verabfolgung zugänglich sind, wie für die Verbindungen 12 und 13 beschrieben ist, unter Umwandlung der Acylate in die Hydroxy-Derivate, welche in vivo durchgeführt wird. Somit haben die Verbindungen die '·■ Struktur

und

worin R₁ und R„ für Wasserstoff oder Hydroxyl stehen, mit der Ausnahme, daß sofern R. Wasserstoff ist, ^R ₂ Hydroxyl ist, und wenn R. Hydroxyl ist, R₂ Wasserstoff ist, und R₃ und R₄ jeweils Wasserstoffatome oder Acylreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind.

Wenn es gewünscht wird, können die erfindungsgemäßen Verbindungen ebenfalls in ihrer kristallinen Form erhalten werden durch Auflösung in einem geeigneten Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelsystem, z.B. in Methähoi-Ether, Methanol-Hexan und anschließender Entfernung des Lösungsmittels durch Verdampfung oder durch andere bekannte Maßnahmen.

Claims

-X- ■ . . !■

10 Wisconsin Alumni Research Foundation 614 North Walnut Street
Madison, WI 53705 / USA

15 1,24-Dihydroxy-& -Vitamin D₃ und

Verfahren zu dessen Herstellung

Patentansprüche 20

1. Verbindungen der Formel

30 worin R₁ und R₂ für Wasserstoff oder Hydroxyl stehen, i mit der Ausnahme, daß,sofern R₁ Wasserstoff ist, R_ I Hydroxyl ist, und wenn R₁ Hydroxyl ist, R₂ Wasserstoff ist, und R₃ und R. Wasserstoffatome oder Acylreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind.

35. ^; ■. ■■..-. ■ ■ ;

2, (22E,24R)-1,24-Dihydroxy-Zs>²²-vitamin D₃. '

r ι ι:

I 3. Verbindung nach Anspruch 2 in kristalliner Form. 4. (22E,24S)-1,24-Dihydroxy-A²²-vitamin D₃.

5 5. Verbindung nach Anspruch 4 in kristalliner Form. 6. Verbindungen der Formel

worin R- und R₂ für Wasserstoff oder Hydroxyl stehen, 15 mit der Ausnahme, daß sofern R₁ Wasserstoff ist, R-Hydroxyl ist, und wenn R- Hydroxyl ist, R- Wasserstoff ist, und R3 und R. Wasserstoffatome oder Acylreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind.

20 7. (22E,24R)-Cholesta-5,7,22-trien-1a,3ß,24-triol. 8. (22E,24S)-Cholesta-5,7,22-trien-1α,3ß,24-trioiι