CH667658A5

CH667658A5 - 1-alpha-hydroxyvitamin d2-analogverbindungen.

Info

Publication number: CH667658A5
Application number: CH4779/85A
Authority: CH
Inventors: Hector F Deluca; Heinrich K Schnoes; Rafal R Sicinski; Yoko Tanaka
Original assignee: Wisconsin Alumni Res Found
Priority date: 1984-03-05
Filing date: 1985-01-22
Publication date: 1988-10-31
Also published as: JPS61501447A; NL8520021A; DK153145B; IL74168A0; DE3590080C2; FR2560597B1; WO1985003939A1; IL74168A; BE901879A; DK506985D0; JPH064536B2; GB2155478A; DK506985A; DK153145C; IE850520L; DE3590080T; IE57951B1; FR2560597A1; GB2155478B; GB8505486D0

Description

BESCHREIBUNG

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft biologisch aktive Vitamin D-Verbindungen. Insbesondere betrifft die Verbindung la-Hydro-xyvitamin D2-Analogverbindungen, welche unerwartete biologische Eigenschaften aufweisen.

Stand der Technik

Aufgrund der gut bekannten und deutlich festgelegten Wirksamkeit von la-Hydroxyvitamin D-Verbindungen bei der Calcium- und Phosphathomöostase bei Tieren oder Menschen bestand ein Interesse an der Herstellung der natürlichen Metaboliten und an der Entdeckung von Analogverbindungen mit geeigneten biologischen Eigenschaften. Dies hat zur Herstellung einer Vielzahl von Verbindungen geführt, die biologische Aktivität aufweisen (beispielsweise vgl. DeLuca et al., Topics in Current Chem., Band 83, Seite 1 (1979); Ann. Rev. Biochem. 52, 411 (1983); Yakhimovich, Russian Chem. Rev. 49, 371 (1980)). Das Interesse an derartigen Verbindungen besteht weiterhin, insbesondere deswegen, weil erkannt wurde, dass zusätzlich zu ihrer klassischen Funktion als Regulatoren der Calcium-Homöostase bestimmte Vitamin D-Derivate, insbesondere la,25-Dihydro-xyvitamin D3 und la-Hydroxyvitamin D3 ebenso Zell-Diffe-renzierungsprozesse beeinflussen und in der Lage sind, das Wachstum und die Verbreitung bestimmter Leukämiezellen zu inhibieren [Suda et al., US-PS 4 391 802; Suda et al.,

Proc. Nati. Acad. USA 80, 201 (1983); Reitsma et al., Nature, 306, 492-494 (1983)].

Die meisten der bekannten Vitamin D-Metaboliten und -Analogverbindungen sind Derivate der Vitamin D3-Serie, d.h. sie besitzen gesättigte Steroid-Seitenketten. In der Seitenkette ungesättigte Vitamin D-Verbindungen sind jedoch ebenfalls bekannt, nämlich bestimmte Hydroxyderivate von Vitamin D2, wie 25-Hydroxyvitamin D2 (US-Patentschrift 3 585 221), 1 a,25-Dihydroxyvitamin D2 (US-Patentschrift 3 880 894), die 24-Hydroxy- und 24,25-Dihydroxyvitamin D2-Metaboliten (Jones et al., Arch. Biochem. Biophys. 202, 450 (1980)), la-Hydroxyvitamin D2 (US-Patentschrift 3 907 843), wie auch bestimmte verwandte 22-trans-Dehy-

dro-Verbindungen, welchen der 24-Methylsubstituent fehlt, wie sie beschrieben sind in der US-Patentschrift 3 786 062 und von Bogoslovskii et al., (J. Gen. Chem. USSR 48 (4), 828 (1978); Chem. Abstr. 89, 163848j, 89, 209016s).

Darstellung der Erfindung

Es sind nun neue Vitamin D-Analogverbindungen hergestellt worden, welche durch die Struktur charakterisiert sind, worin R ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe bedeutet. Die erfindungsgemässe Verbindung, worin R ein Wasserstoffatom darstellt, kann als eine Zwischen Verbindung bei der Herstellung der Verbindung erhalten werden, in der R eine Hydroxylgruppe ist.

Strukturmässig sind die erfindungsgemässen Verbindungen Analogverbindungen der Hydroxyvitamin D2-Verbin-dungen, denen der 24-Methylsubstituent fehlt, d.h. die Verbindungen sind la-Hydroxy-28-norvitamin D2 bzw. la,25-Dihydroxy-28 -norvitamin D2.

Sowohl das Produkt als auch die Zwischenverbindung zeigen eine starke biologische Aktivität und sind durch ein unerwartetes und neues Muster an Aktivität, wie es näher weiter unten beschrieben wird, charakterisiert.

Eine Ausführungsform des chemischen Verfahrens, welches zu den oben angegebenen Verbindungen führt, ist in dem Verfahrensschema I aufgezeichnet. In der folgenden Beschreibung dieses Verfahrens und in den Beispielen und Tabellen beziehen sich die durch arabische Zahlen angegebenen Verbindungszeichnungen (z.B. (1), (2), (3), . .. (10), (11), (12)) auf die so numerierten Strukturen in dem Verfahrensschema.

Das Ausgangsmaterial ist der Dien-geschützte Aldehyd der Struktur (1) (vgl. Verfahrensschema I), der aus dem Er-gosterolacetat nach dem Verfahren von Barton et al., (J.Chem.Soc. (C) 1968 (1971)) hergestellt worden ist. Die Umsetzung des Aldehyds (1) mit 3-Methyl-l -butylphenyl-sulfon der nachstehend angegebenen Struktur

(CH3)2CHCH2CH2-S02Ph in einem organischen Lösungsmittel in Gegenwart einer starken organischen Base ergibt die Hydroxysulfon-Zwischen-verbindung der Struktur (2 , wie sie in dem Verfahrensschema I dargestellt ist. Die Behandlung der Zwischenverbindung (2) mit Natriumamalgam in gepufferter Alkohollösung liefert dann das 22,23-trans-Olefin (22E-01efin) der Struktur (3).

Die Umsetzung des 22E-01eflns (3) mit einem starken Hydrid-Reduktionsmittel (z.B. LiAlH4) in einem Ether-Lö-sungsmittel ergibt die 5,7-Dien-Zwischenverbindung (4). Diese Zwischenverbindung wird sodann mit ultraviolettem Licht in einem organischen Lösungsmittel bestrahlt, um das entsprechende Provitamin D-Derivat zu erhalten, welches isoliert wird und in einem organischen Lösungsmittel auf eine Temperatur erhitzt wird, die sich im Bereich von Raumtemperatur bis zur Rückflusstemperatur bewegt, um das Provitamin D-Chromophor zu dem Vitamin D-Chromo-phor zu isomerisieren, wodurch die 22E-Dehydrovitamin

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D3-Verbindung der Struktur (5) erhalten wird. Verbindung (5) ist eine bekannte Vitamin D-Analogverbindung, die zuvor nach einem weniger bequemen Verfahren hergestellt wurde (Bogoslovskii et al., an oben angegebener Stelle).

Die Zwischenverbindung (5) wird sodann am Kohlenstoffatom 1 hydroxyliert nach dem allgemeinen Verfahren von DeLuca et al. (US-Patentschriften 4 195 027 und 4 260 549). Diese Reaktionsschritte umfassen die Reaktion der Verbindung (5) mit Toluolsulfonylchlorid in herkömmlicher Weise, um das entsprechende 3ß-Tosylatderivat zu erhalten, welches direkt in gepuffertem Methanol solvolysiert wird, um die 3,5-Cyclovitamin D-Zwischenverbindung zu erhalten, welche durch die Struktur (6) im Verfahrensschema I angegeben ist. Durch Behandlung der letzteren Verbindung mit Selendioxid und tert.-Butylhydroperoxid wird nach chromatographischer Reinigung das entsprechende 1-hydro-xylierte Produkt erhalten, welches überwiegend die la-Hy-droxycyclovitamin D-Verbindung der Struktur (7) enthält. Eine kleine Menge des entsprechenden 1 ß-Hydroxy-Epimers kann ebenfalls in dem Produkt erhalten sein, jedoch ist die Trennung der Epimeren, obwohl diese mittels Chromatographie möglich ist, in dieser Stufe nicht erforderlich. Das Erhitzen dieser 1-Hydroxycyclo vitamin D-Zwischen Verbindung in Eisessig bei 40 bis 60 ' C liefert sodann ein Gemisch der 3-acetylierten Solvolyseprodukte, woraus durch Chromatographie die 5,6-cis- bzw. 5,6-trans-Verbindungen der Strukturen (8) und (9) isoliert werden. Wenn das 1-Hydroxy-cyclovitamin D-Produkt, welches der Solvolyse unterworfen wird, einen Anteil 1 ß-Hydroxy-Epimer enthielt, so enthält das Solvolysegemisch ebenfalls die 1 ß-Hydroxy-Epimeren entsprechend zu den Verbindungen (8) oder (9) und, sofern dies gewünscht wird, können diese Verbindungen durch Chromatographie isoliert werden.

Die herkömmliche Basenhydrolyse der Acetatfunktion in der Verbindung (8) ergibt das Diolprodukt der Struktur (10).

Dieses Diol (10) wird sodann einer enzymatischen Hy-droxylierung am Kohlenstoffatom 25 in vitro unterworfen, wobei ein Leberhomogenisat verwendet wird, welches von Ratten mit Vitamin D-Mangel hergestellt wurde (gemäss der Beschreibung in der US-Patentschrift 4 307 025), um nach chromatographischer Trennung des Produktgemisches das gewünschte la,25-dihydroxylierte Produkt in reiner Form zu erhalten, welches durch die Struktur (12) angegeben ist.

In der folgenden detaillierten Beschreibung des Syntheseverfahrens, welches oben in Grundzügen dargestellt wurde, wurden die physikochemischen Daten erhalten unter Verwendung der unten angegebenen Verfahren und Vorrichtungen. Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) wurde mittels der Vorrichtung der Firma Waters Associates Model ALC/GPC 204 unter Verwendung einer Säule aus Zor-bax-Sil (DuPont) (6,2 mm x 25 cm Abmessungen der Säule, Fliessgeschwindigkeit 4 ml/min, 1500 psi) durchgeführt. Die Säulenchromatographie wurde durchgeführt über Silikagel 60, 70-230 mesh ASTM (Merck). Die präparative Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde durchgeführt über Si-lika 60 PF-254 (20 x 20 cm-Platten, 1 mm Silikagel). Die Bestrahlungen wurden durchgeführt unter Verwendung einer Quecksilberdampflampe Hanovia 608A36, die mit einem Vycor-Filter ausgerüstet war. Alle Reaktionen werden vorzugsweise unter einer Inertgasatmosphäre durchgeführt (z.B. Argon).

3-Methyl-l -butylphenylsulfon (Isopentylphenylsulfon)

PhS02Na (1,97 g, 12 mMol) wurde zu einer gerührten Lösung von 3-Methyl -1-brombutan (1,51 g 1,2 ml, 10 mMol) in DMF (20 ml) bei 75 °C gegeben. Das Gemisch wurde 5 Stunden auf 75 °C erhitzt, sodann abgekühlt, in

Wasser eingegossen und mit Benzol extrahiert. Die organische Schicht wurde mit 5% HCl, 5% NaHC03 und Wasser gewaschen, über Na2S04 getrocknet und eingedampft. Das ölige Sulfonprodukt (1,69 g, 80%) war im wesentlichen rein 5 und wurde ohne jegliche Reinigung verwendet; NMR 5 0,88 (6H, d, J = 6,5 Hz, 2 x CH3), 1,61 (3H,m, CH2-CH), 3,08 (2H, m, S02-CH2-), 7,50-7,95 (5H, m, Ar-H); IR: 1300 (br), 1147, 1088, 745, 692, 564, 539 cm-1; Massenspektrum m/e 212 (M+, 3), 143 (92), 77 (57), 71 (73), 70 (73), 55 (42), io 43 (100), 41 (47).

(22E)-5a,8a-(4-Phenyl-l,2-urazol) -cholesta-6,22-dien-3$ -ol

(3)

n-Butyllithium (1,7 M-Lösung in Hexan, 4,12 ml, 7 15 mMol) wurde einer gerührten Lösung von Diisopropylamin (707 mg, 1 ml, 7 mMol) in wasserfreiem THF (14 ml) zugesetzt und das Gemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Sulfon gemäss der Herstellung in Beispiel 1 (1,50 g, 7,07 mMol) in wasserfreiem THF (11 ml) wurde in-20 nerhalb von 10 Minuten tropfenweise zugesetzt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur gerührt für weitere 15 Minuten, sodann abgekühlt auf 0 °C und der Aldehyd (1) (545 mg, 1 mMol) in wasserfreiem THF (7 ml) wurde zugesetzt. Das Rühren wurde 2 Stunden bei 0 °C fortgesetzt und die Lö-25 sung wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmt (30 Minuten). Das Gemisch (welches das Hydroxysulfonprodukt (2) enthielt) wurde in gesättigte Lösung von Na2HP04 in Methanol (200 ml) eingegossen, Natriumamalgam (5,65%, 10 g) wurde zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde für 30 17 Stunden bei 4 °C gerührt. Ausgefallenes Quecksilber wurde abfiltriert und nach der Einengung des Reaktionsgemisches auf etwa 5 ml wurde es mit Wasser verdünnt und mit Methylenchlorid extrahiert. Der organische Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet (Na2S04), unter ver-35 mindertem Druck eingeengt und der ölige Rückstand wurde über eine Silikagelsäule chromatographiert. Überschüssiges Sulfonreagens wurde mit Benzol-Ether (7:3)-Gemisch eluiert.

Die Eluation mit Benzol-Ether (6:4) lieferte das reine Pro-40 dukt (3) (375 mg, 67%) als einen Schaum: NMR 5 0,81 (3H, s, 18-H3), 0,86 (6H, d, J = 6,7 Hz, 26-H3 und 27-H3), 0,97 (3H, s, 19-H3), 1,03 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-H3), 3,16 (1H, dd, J, =4,4 Hz, J, = 14 Hz, 9-H), 4,44 (1H, m, 3-H), 5,25 (2H, br, m, 22-H und 23-H), 6,22 und 6,39 (2H, AB q, J=8,5 45 Hz, 6-H und 7-H), 7,40 (5H, br m, Ar-H); IR: 3444, 1754, 1701, 1599, 1402, 969, 757 cm~', Massenspektrum, m/e 557 (M+, 1%), 382 (70), 349 (51), 253 (28), 251 (45), 119 (PhNCO, 83), 55 (100).

50 (22E)-Cholesta -5,7,22-trien-3$-ol (4)

Das Addukt (3) (330 mg, 0,6 mMol) und Lithiumaluminiumhydrid (700 mg) in wasserfreiem THF (40 ml) wurden unter Rückfluss auf 18 Stunden erhitzt. Das überschüssige Reagens wurde mit einigen Tropfen Wasser zersetzt. Wasser-55 freies Na2S04 wurde zugesetzt und die organische Phase wurde dekantiert und eingeengt, um einen kristallinen Rückstand zu ergeben, der über einer Silikagelsäule gereinigt wurde. Die Eluation mit Benzol-Ether (94:6)-Gemisch ergab reines Dien (4) (180 mg, 80%), welches aus Methanol umkri-60 stallisiert wurde: Schmelzpunkt 119,5-122,5 °C;

[aß4= -118° (c = 1,2, CHC13); NMR S 0,63 (3H, s,18-H3), 0,87 (6H, d, J = 6,7 Hz, 26-H3 und 27-H3), 0,95 (3H, s,19-H3), 1,03 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-H3), 3,64 (1H, m, 3-H), 5,25 (2H, br m, 22-H und 23-H), 5,38 und 5,57 (2H, AB q, 65 J = 6 Hz, 7-H und 6-H); UV l!mK 281 nm; IR: 3436,1461, 1382,1366, 1062,1036, 968 cm-1; Massenspektrum, m/e 382 (M+, 100), 349 (M+ -H20-Me, 71), 323 (34), 271 (M+-Sei-tenkette, 16), 253 (M+-Seitenkette-H20, 32).

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4

(5ZJE22Ej-9 JO-Secocholesta-5,7,10 ( 19),22 -tetraen-3ß-ol

(5)

Eine Lösung der Verbindung (4 (100 mg, 0,26 mMol) in Ether (120 ml)-Benzol (30 ml)-Gemisch wurde mit Argon für 40 Minuten entgast. Die Lösung wurde bei 0 C für 13 Minuten bestrahlt in einer Quarztauchquelle, die mit einer UV-Lampe und einem Filter ausgerüstet war. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde durch HPLC getrennt, wobei 1% 2-Propanol in Hexan als Eluationsmittel verwendet wurde, um das reine Provitamin D-Derivat zu erhalten (40,4 mg, 40%), welches bei 24 ml gesammelt wurde; NMR 8 0,72 (3H, s, 18-H3), 0,87 (6H, d, J = 6,7 Hz, 26-H3 und 27-H3), 1,04 (3H, d, J = 6,8 Hz, 21-H3), 1,65 (3H, s, 19-H3), 3,91 (1H, m, 3-H), 5,28 (2H, br m, 22-H und 23-H), 5,50 (1H, m, 11-H), 5,69 und 5,96 (2H, AB q, J = 12,5 Hz, 7-H und 6-H); UV ^max 260,5 nm; A.min 234 nm.

Das Provitamin (40 mg, 0,1 mMol) in Ethanol (100 ml) wurde unter Rückfluss für 3 Stunden erhitzt. Nach dem Abzug des Lösungsmittels wurde das Produktgemisch durch HPLC getrennt (Eluation mit 1% 2-Propanol in Hexan). Die Ausbeute des Vitamins (5) (gesammelt bei 34 ml) betrug 30,8 mg (77%); Schmelzpunkt (Hexan) (99-101 C; NMR 8 0,56 (3H, s, 18-H3), 0,88 (6H, d, J = 6,7 Hz, 26-H, und 27-H3), 102 (3H, d, J = 6,6 Hz, 21-H3), 3,96 (1H, m, 3-H), 4,82 und 5,05 (2H, jeweils enges m, 19-H-,), 5,27 (2H, br m, 22-H und 23-H), 6,03 und 6,24 (2H, AB q, J = 11,4 Hz, 7-H und 6-H); UV À.max 265 nm, Xmin 228 nm; IR: 3420, 1458, 1441, 1378, 1366, 1050, 970, 943, 891, 862 cm"1; Massenspektrum, m e (M+, 22), 349 (M+ -H20-Me, 4), 271 (M+-Seitenkette, 8), 253 (M+-Seitenketten-~H->0, 13), 136 (100), 118(80).

(5Z,7E,22E)-3$-Acetoxy -9,10-secocholesta-5,7,10( 19),22-tretraen-la-ol (8_)

Ein frisch umkristallisiertes p-Toluolsulfonylchlorid (50 mg, 0,26 mMol) wurde einer Lösung des Vitamins (5) (30 mg, 0,08 mMol) in wasserfreiem Pyridin (300 |il) zugesetzt. Nach 30 Stunden bei 4 C wurde das Reaktionsgemisch in Eis gesättigte NaHC03 unter Rühren eingegossen. Das Gemisch wurde 15 Minuten gerührt und mit Benzol extrahiert. Der organische Extrakt wurde mit gesättigter NaHC03, gesättigtem Kupfersulfat und Wasser gewaschen, getrocknet (Na2S04) und unter vermindertem Druck eingeengt, um das ölige 3ß-Tosylderivat zu erhalten. Das rohe Tosylat wurde mit NaHC03 (150 mg) in wasserfreiem Methanol (10 ml) behandelt und das Gemisch wurde 8,5 Stunden bei 55 C gerührt. Nach dem Abkühlen und Einengen auf etwa 2 ml wurde das Gemisch mit Benzol (80 ml) verdünnt, mit Wasser gewaschen, getrocknet (Na2S04) und unter vermindertem Druck eingeengt.

Die erhaltene ölige 3,5-Cyclovitamin D-Analogverbindung (6) war hinreichend rein, um für die folgende Oxida-tionsstufe ohne jegliche Reinigung eingesetzt zu werden. Einer heftig gerührten Suspension von Se02 (4 mg, 0,036 mMol) in wasserfreiem CH2C12 (5 ml) wurde tert.-Butylhy-droperoxid (13,2 jj.1, 0,094 mMol) zugesetzt. Nach 30 Minuten wurde wasserfreies Pyridin (40 jj.1) zugesetzt und das Gemisch wurde weitere 25 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, mit CH2C12 (3 ml) verdünnt und auf 0 C abgekühlt. Das rohe 3,5-Cyclovitaminprodukt (6) in CH2C12 (4,5 ml) wurde sodann zugegeben und die Reaktion wurde bei 0 C für 15 Minuten fortschreiten gelassen. Das Gemisch wurde sodann langsam (30 Minuten) auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Das Gemisch wurde in einen Trenntrichter überführt und mit 30 ml 10%iger-NaOH geschüttelt. Ether (150 ml) wurde zugesetzt und die abgetrennte organische Phase wurde mit 10% NaOH, Wasser gewaschen und über

Na2S04 getrocknet. Die Einengung zur Trockne unter vermindertem Druck ergab einen gelben öligen Rückstand, der über Silikagel-TLC-Platten gereinigt wurde, welche entwik-kelt wurden in einem 7:3-Gemisch von Hexan-Ethylacetat (Rf 0,35 wodurch das 1-Hydroxycyclovitaminprodukt erhalten wurde (14,4 mg, 45%) NMR 8 0,55 (3H, s, 18-H3), 0,64 (1H, m, 3-H), 0,88 (6H, d, J= 6,9 Hz, 26-H3 und 27-H3), 1,03 (3H, d, J = 6,9 Hz, 21-H3), 3,26 (3H, s, -OCH3), 4,2 (2H, m, 1-H und 6-H), 4,95 (1H, d, J = 9,3 Hz, 7-H), 5,1-5,4 (4H,br m, 19-Hi, 22-H und 23-H); Massenspektrum m/e 412 (M+, 27),~380 (M+-MeOH, 46), 339 (22), 269 (M+-Seitenketten-MeOH), 29), 245 (18), 135 (100). Das oben angegebene Produk enthielt überwiegend die la-Hy-droxycyclovitamin D-Analogverbindung der Struktur (7) und eine kleine Menge des entsprechenden lß-Epimers. Eine Lösung dieses 1-Hydroxycyclovitamin D-Produkts (12 mg) in Eisessig (0,5 ml) wurde für 15 Minuten auf 55 °C erhitzt. Das Gemisch wurde sorgfältig in Eis/gesättigte NaHC03 eingegossen und mit Benzol und Ehter extrahiert. Die vereinten Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, getrocknet (Na2S04) und eingeengt. Das erhaltene Produktgemisch wurde der HPLC unterworfen (1,5% 2-Propanol in Hexan als Eluationsmittel), um 4,9 mg der Verbindung (8) zu erhalten (Eluation bei 42 ml) und 3,1 mg der Verbindung (9) (Eluation bei 50 ml).

Verbindung (8): NMR S 0,56 (3H, s, 18-H3), 0,88 (6H, d, J = 7,0 Hz), 26-H3 und 27-H3), 1,02 (3H, d, J = 6,8 Hz, 21-H3), 2,04 (3H, s, -OCOCH3), 4,41 (1H, m, 1-H), 5,02 (1H, enges m, 19-H), 5,1-5,4 (4H, br m, 3-,19-, 22- und 23-H), 6,03 und 6,35 (2H, AB q, J = 11,4 Hz, 7-H und 6-H); UV Àmax 264 nm, /,mm 227,5 nm; Massenspektrum, m/e 440 (M+, 15), 380 (M+-HOAc, 84), 362 (M*-HOAc-HzO, 9), 269 (M+-Seitenketten-HOAc, 40), 251 (15), 135 (100), 134 (94).

Verbindung (9): NMR 8 0,57 (3H, s, 18-H3), 0,89 (6H, d,J = 7,0 Hz, 26-Hi und 27-H3), 1,03 (3H, d, J = 6,8 Hz,

21-H3), 2,04 (3H, s, -OCOCH3), 4,49 (1H, m, 1-H), 5,00 und 5,14 (2H, jeweils enges m, 19-H-.), 5,25 (3H, br m, 3-,

22- und 23-H), 5,81 und 6,58 (2H, AB q, J = 12,0 Hz, 7-H und 6-H); UV X max 269,5 nm, ^min 228 nm; Massenspektrum, m/e 440 (M + , 6), 380 (47), 269 (15), 135 (100), 134 (62).

Ebenfalls wurde aus dem Solvolyse-Produktgemisch eine geringe Menge (0,87 mg) des 1 ß-Hydroxy-Epimers entsprechend der Verbindung (8) erhalten, welches durch die folgenden Daten charakterisiert ist: NMR 8 0,55 (3H, s, 18-H3), 0,87 (6H, d, J = 6,9 Hz, 26-H3, und 27-H3), 1,01 (3H, d, J = 6, 9 Hz, 21-H3), 2,06 (3H, s, -OCOCH ,), 4,17 (1H, m, 1-H), 4,99 (2H, m, 3-H und 19-H), 5,1-5,4 (3H, br m, 19-,

22- und 23-H), 6,00 und 6,38 (2H, AB q, J = 11,3 Hz, 7-H und 6-H); UV /lmax 262,5 nm, A.min 227 nm; Massenspektrum, m/e 440 (M + , 27), 380 (78), 362 (12), 269 (28), 251 (20), 135 (100), 134 (78).

Hydrolyse der 3ß-A ceto.xygruppe in den Verbindungen (8) und (9)

Eine Lösung des 3ß-Aeetoxyvitamin-Derivats (8) (0,7-6 mg) in Ethanol (0,1 ml) wurde mit 10% KOH in Methanol (0,8 ml) behandelt und das Gemisch wurde für 1 Stunde auf 50 C erhitzt. Nach der üblichen Aufarbeitung und abschliessenden HPLC-Reinigung (8% 2-Propanol in Hexan als Eluationsmittel) wurde das la,3ß-Diol der Struktur (10) in 84%iger Ausbeute erhalten: NMR 8 0,56 (3H, s, 18-H3), 0.87 (6H, d, J = 7, 0 Hz, 26 H, und 27-H3), 1,02 (3H, d, ' J = 6,8 Hz, 21-H3), 4,22 (1H, m, 3-H), 4,42 (1H, m, 1-H), 5,00 (1H, enges m, 19-H), 5,1-5,4 (3H, br m, 19-, 22- und

23-H), 6,01 und 6,38 (2H, AB q, J = 11,4 Hz, 7-H und 6-H); UV A.miiX 264,5 nm, /.min 227,5 nm; Massenspektrum, m/e 398

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(M+, 21) 380 (M+ - H20, 9) 2,87 (M+-Seitenkette, 6), 269 (M+ -ß-Seitenketten -H20, 8), 251 (5), 152 (38), 134 (100). Die Verbindung (10) eluiert bei 40 ml in dem obigen HPLC-System.

Die analoge Behandlung des Acetoxyderivats (9) ergab nach HPLC-Reinigung das 5,6-trans-lcc,3ß-Diol der Struktur (11) in 72%iger Ausbeute: NMR 5 0,58 (3H, s, I8-H3), 0,87 (6H, d, J=7,0 Hz, 26-H3 und 27-H3), 1,03 (3H, d, J = 6,8 Hz, 2I-H3), 4,24 (lH,m,3-H), 4,49 (1H, m, 1-H), 4,97 und 5,13 (2H, jeweils enges m, 19-H2), 5,25 (2H, br m, 22-H und 23-H), 5,88 und 6,58 (2H, AB q, J= 11,5 Hz, 7-H und 6-H); UV Xmax 273 nm, Xmin 229,5 nm; Massenspektrum, m/e 398 (M+, 21), 380 (5), 287 (6), 269 (5), 251 (4), 152 (33), 134 (100). Die Verbindung (11) eluiert bei 38 ml.

25-Hydroxylierung der Verbindung (10)

Das 5,6-cis-la,3ß-Diol der Struktur (10) gemäss obiger Darstellung wurde sodann 25-hydroxyliert nach dem folgenden Verfahren: Männliche Weanling-Ratten wurden mit einer Diät mit geringem Calcium-Vitamin D-Mangel nach der Beschreibung von Suda et al., J. Nutr. 100, 1049 (1970) für 2 Wochen behandelt. Sie wurden durch Enthauptung getötet und ihre Lebern wurden entfernt. Ein 20%iges (w/v) Homogenisat wurde hergestellt in eisgekühlter 0,25 M Sucrose. Die Inkubation wurde in 10 ml Inkubationsmedium in einem 125 ml fassenden Erlenmayer-Kolben durchgeführt, der eine aliquote Menge an Leberhomogenisat enthielt, die 1 g Gewebe, 0,125 M Sucrose, 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,4), 22,4 mM Glucose-6-phosphat, 20 mM ATP, 160 mM Nicotinsäureamid, 25 mM Succinat, 0,4 mM NADP, 5 mM MgCl2, 0,1 M KCl und 0,5 Einheiten Glucose-6-phosphat-dehydro-genase enthielt. Die Reaktion wurde initiiert durch Zugabe von 400 /ig der Verbindung (10), die in 100 (il 95%igem Ethanol gelöst war. Das Gemisch wurde bei 37 °C inkubiert, unter Schütteln mit 80 Auslenkungen/min für 3 Stunden. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 20 ml Methanol und 10 ml Dichlormethan gestoppt. Nach weiterer Zugabe von 10 ml Dichlormethan wurde die organische Phase gesammelt, während die wässrige Phase mit 10 ml Dichlormethan erneut extrahiert wurde. Die organischen Phasen von insgesamt drei Extraktionen wurden vereint und mit einem Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand, der das gewünschte Produkt enthielt, wurde in 1 ml CHCl3:Hexan (63:35)-Gemisch gelöst und auf eine Sephadex-LH-20-Säule (0,7 cm x 14 cm) gepackt, äquilibriert und mit demselben Lösungsmittel eluiert. Die ersten 10 ml wurden verworfen, während die nächsten 40 ml gesammelt und eingedampft wurden. Der Rückstand wurde sodann in 8% 2-Propanol in Hexan gelöst und der Hochleistungs-Flüssigkchromatogra-phie unterworfen (Modell LC/GPC 204 HPLC, Waters Associates, Medford, MA) unter Verwendung einer Zorbax-Sil-Säule (4,6 mm x 25 cm, DuPont, Inc., Wilmington, DE), welche unter einem Druck von 1000 psi mit einer Fliessgeschwindigkeit von 2 ml/min arbeitete. Das gewünschte 25-hydroxylierte Produkt wurde bei 42 ml eluiert. Das Produkt wurde ferner durch Hochleistungs-Flüssigchromatogra-phie gereinigt, wobei eine Umkehrphasen Säule verwendet wurde (Richrosorb Rp-18,4,6 mm x 25 cm, E. Merck, Darmstadt, West-Deutschland), die unter einem Druck von 1200 psi und einer Fliessgeschwindigkeit von 2 ml/min betrieben wurde. Die Säule wurde mit 22 ml eluiert. Das Produkt wurde bei 50 ml eluiert. Das Produkt wurde ferner durch HPLC unter Verwendung von Zorbax-Sil gereinigt und die Bedingungen entsprachen der obigen Beschreibung. Das erhaltene Produkt wurde durch die folgenden Daten charakterisiert: UV-Absorption (95% Ethanol) Xmax 265 nm, Xmin 228 nm; Massenspektrum, m/z 414 (Molekül-Ion M+), 396 (M+-H20), 378 (M+-2 x H20), 287 (M+ Seitenkette),

269 (M+-Seitenketten-H20), 251 M+-Seitenketten-2 x H20), 152 (Ring A, C 7/8 Bindungsspaltung), 134 (152-H20) und 59 (CH3)2C = OH)+ erhalten aus der C24/25-Bindungsspal-tung).

5 Die obigen Daten, insbesondere die charakteristische Ul-traviolett-Absorption und die hervortretenden und diagnostischen Peaks bei m/z 152, 134 und 59 in dem Massenspektrum zeigen, dass es sich bei dem Produkt um die gewünschte 25-hydroxylierte Verbindung handelt, die durch die Struk-10 tur (12) (Verfahrensschema I) angegeben wird.

Wenn es gewünscht wird, können die erfmdungsgemäs-sen Verbindungen leicht in kristalliner Form erhalten werden durch Umkristallisation aus geeigneten Lösungsmitteln, z.B. Hexan, Ethern, Alkoholen oder Gemischen davon, wie 15 den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt ist.

Biologische Aktivität der Seitenketten-Dehydrovitamin D-Verbindungen

Die biologische Wirksamkeit der oben beschriebenen De-20 hydrovitamin D-Analogverbindungen wurde durch Versuche in vivo an Ratten und im Vergleich mit la-Hydroxyvitamin D-Verbindungen bekannter Wirksamkeit nachgewiesen. Beide Produkte, (12) und die Schlüssel-Zwischenverbindung, Verbindung (10), wurden getestet und als hoch aktiv 25 befunden.

Biologische Aktivität der Verbindung (10)

Der Versuch wurde folgendermassen durchgeführt: Männliche Weanling-Ratten wurden von der Firma Holtz-30 man Co., Madison, WI gekauft und ad libitum mit Wasser und einer Diät mit geringem Calciumgehalt, adäquatem Phosphor und Vitamin D-Mangel gemäss der Beschreibung von Suda et al (J. Nutr. 100, 1049 (1970)) für drei Wochen gefüttert. Die Ratten wurden sodann in Gruppen von jeweils 35 6 Ratten eingeteilt und sie erhielten 650 pMol der Verbindung (10) oder von la-Hydroxyvitamin D3 (la OH-D3) gelöst in 0,05 ml 95%igem Ethanol intrajugular 18 Stunden vor ihrer Tötung. Die Ratten in der Kontrollgruppe bekamen den Ethanolträger in der gleichen Weise. Die Ratten 40 wurden sodann durch Enthauptung getötet und das Blut wurde gesammelt. Das durch Zentrifugieren erhaltene Serum des Blutes wurde mit 0,1% Lanthanchloridlösung (1:20) verdünnt und die Serum-Calcium-Konzentration wurde mit einem Atomabsorptionsspektrophotometer gemessen. Die Er-45 gebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I angegeben:

Tabelle I

Anstieg der Serum-Calcium-Konzentration in Ansprache 50 auf eine Einzeldosis von 650 pMol der Verbindung (10) oder der Verbindung la-OH- D3, verabfolgt 18 Stunden vor der Tötung

± Stan-

Biologische Aktivität der Verbindung (12)

Die Untersuchung wurde gemäss folgender Beschreibung 65 durchgeführt: Männliche Weanling-Ratten wurden mit einer Diät mit geringem Calciumgehalt und Vitamin D-Mangel für 3 Wochen gemäss obiger Beschreibung behandelt. Sie wurden sodann in Gruppen von jeweils 5 Ratten unterteilt.

Verabfolgte Verbindung Serum-Calcium-1 55 tion (mg/100 ml)

dardabweichung

Ethanol 3,2 ± 0,la)

Verbindung (10) 4,5 ± 0,4b)

60 la-OH-Dj 4,7 ± 0,5b>

b) ist deutlich unterschiedlich vona) p < 0,001

667 658

6

Ratten in einer Kontrollgruppe erhielten 0,05 ml 95%iges Ethanol intrajugular, während Ratten in den Testgruppen 325 pMol der Verbindung (12) oder von la,25-Dihydroxy-vitamin D3 (la,25-(OH)2D3) gelöst in 0,05 ml 95%igem Ethanol erhielten. 18 Stunden später wurden sie durch Enthauptung getötet und das Blut wurde gesammelt. Die Se-rum-Calcium-Konzentration wurde mit einem Atomab-sorptionsspektrophotometer gemäss obiger Beschreibung ermittelt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II angegeben:

Tabelle II

Anstieg der Serum-Calcium-Konzentration in Ansprache auf eine Einzeldosis von 325 pMol der Verbindung (12) oder der Verbindung la,25-(OH)2D3 verabfolgt 18 Stunden vor der Tötung

Verabfolgte Verbindung Serum-Calcium-Konzentration (mg/100 ml) ± Standardabweichung

Ethanol 4,2 ± 0,la)

Verbindung (12) 5,0 ± 0,4b)

la,25-(OH)2D3 5,4 ± 0,4b>

b) ist deutlich unterschiedlich vona) p <0,001.

Die obigen Ergebnisse zeigen, dass beide Verbindungen (10) und das Endprodukt (12) gemäss der Erfindung hoch aktiv sind bezüglich der Förderung eines Anstiegs der Se-rum-Calcium-Niveaus von Ratten mit Vitamin D-Mangel. Sie sind tatsächlich äquivalent bezüglich ihrer biologischen Wirksamkeit im Vergleich zu entsprechenden bekannten, in der Seitenkette gesättigten Verbindungen, la-OH-D3 und la,25-(OH)2D3, deren hohe Wirksamkeit und pharmazeutische Verwendbarkeit durch viele Berichte allgemein und in der Patentliteratur (z.B. vgl. US-Patentschrift 4 225 596) dokumentiert ist.

Besonders bemerkenswert und unerwartet ist die überlegene Aktivität von Verbindung (10) bei der Mineralisierung der Knochen von Tieren (Küken), die sich gegenüber der physiologischen Verwendung von Vitamin D2-Verbindungen unterscheidet. Dies ist eine Verstärkung, welche durch die folgenden Daten erläutert wird.

Verfahren

1 Tag alte weisse männliche Leghorn-Küken wurden von der Firma Northern Hatcheries (Beaver Dam, WI) erhalten. Sie wurden mit der Sojaproteindiät mit Vitamin D-Mangel gemäss der Beschreibung in Omdahl et al (Biochemistry 10, 2935, 2940, 1971) für 3 Wochen gefüttert, wonach sie einen Vitamin D-Mangel aufwiesen. Sie wurden sodann in Gruppen von jeweils 6 Küken eingeteilt. Eine Gruppe erhielt Wes-son-Öl-Träger oral verabfolgt; die anderen Gruppen erhielten die angegebene Verbindung (vgl. Tabelle III) gelöst in derselben Menge von Wessen-Ol jeden Tag für eine Zeit von 7 Tagen. 24 Stunden nach der letzten Verabfolgung wurden alle Küken durch Umdrehen des Halses getötet. Ihre Tibiae (Schienbeine) wurden entfernt und von anhaftendem weichem und Verbundgewebe befreit und für 24 Stunden in Alkohol extrahiert, woran sich 24 Stunden in Diethylether unter Verwendung eines Soxhlet-Extraktors anschlössen. Die Knochen wurden sodann bei 100 "F auf ein konstantes Gewicht getrocknet und gewogen. Sie wurden sodann bei 650 °C für 24 Stunden in einem Muffelofen verascht. Die Asche wurde gewogen und der prozentuale Aschegehalt in jedem der Tibiae wurde berechnet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle III nachfolgend aufgeführt.

Tabelle III

Mineralisierung von rachitischen Kükenknochen

Verbindung

Menge

Anzahl

%Asche

(pMol/d/7

der Tiere

Tage)

-D

0

6

32,0 ± 1,0

l,25-(OH)2D3

130

6

41,0 ± 3,4'

1cc-OH-D3

130

6

42,0 ± 3,2'

la-OH- D2

1300

6

38,0 ± 4,0'

Verbindung

130

6

38,0 ± 3,9'

'Diese Werte sind nicht wesentlich unterschiedlich.

Die Ergebnisse zeigen, dass 130 pMol von l,25-(OH)2D3 oder lcc-OH-D3 oder von der neuen Verbindung (10) gemäss der Erfindung in gleichem Mass wirksam sind bezüglich der Steigerung des Mineralgehaltes der rachitischen Tibia. Um jedoch das gleiche Mass an Effektivität zu erreichen, waren 1300 pMol la-OH-D2 erforderlich. Dies stimmt mit den vorangehenden Ergebnissen überein, worin gezeigt wurde, dass eine lOfach grössere Dosis von la-OH- D2 als von la-OH-D3 erforderlich ist, um die gleiche Mineralisierung der Tibia von rachitischen Küken zu erzeugen. Diese Ergebnisse zeigen überraschenderweise, dass die Verbindung (10), obwohl sie eine Analogverbindung von la-OH-D2 ist, eine unerwartete und überlegene Wirksamkeit bezüglich der Mineralisierung der Knochen von Tieren bietet, als sie bekannt ist zur Unterscheidung gegen die Vitamin Do-Verbindungen in physiologischer Verwendung. Dies ist ein unerwartetes Merkmal dieser neuen Analogverbindung und zu deren Anwendung. Da diese unerwartete Aktivität in vivo der Verbindung (10) unzweifelhaft nach der Hydroxylierung zur entsprechenden la,25-DihydroxyVerbindung (Verbindung (12)) in vivo auftritt, sollte die Verbindung, d.h. Verbindung (12), welche die 24-Desmethyl-Analogverbindung von der bekannten Verbindung la,25-Dihydroxyvitamin D3 ist, wirksam sein, um eine Knochenmineralisation bei Küken zu schaffen, die äquivalent zu derjenigen ist, die durch la,25-Dihydroxyvitamin D3 gezeigt wird; somit würde diese neue Vitamin D2-Analogverbindung in Küken voll wirksam sein. Diese hohe Wirksamkeit der Verbindungen (10 ) und (12) in einem Tier, welche sie gegenüber Derivaten vom Vitamin D2-Typ unterscheidet ist neu und ein unterscheidendes Merkmal dieser Substanzen.

Aufgrund der ausgeprägten biologischen Aktivität werden die erfindungsgemässen Verbindungen leicht Anwendung finden als Ersatzstoffe für verschiedene der bekannten Vitamin D-Metaboliten in der Therapie oder Prophylaxe von Unregelmässigkeiten des Calcium-Metabolismus, wie Rachitis, Hypoparathyroidismus, Osteodystrophie, Knochenerweichung oder Osteoporose bei Menschen oder verwandten Calcium-Mangel-Erkrankungen (z.B. Milchfieber) bei Tieren. Entsprechend können diese Verbindungen bei der Behandlung von bestimmten bösartigen Erkrankungen, z.B. bei menschlicher Leukämie eingesetzt werden. Unter Berücksichtigung der ausgeprägten und unerwarteten Wirksamkeit der erfindungsgemässen Verbindungen (Verbindungen (10) und (12)) bei der Förderung der Mineralisierung von Knochen bei Vögeln (vgl. Tabelle III) können diese Verbindungen eine spezielle Verwendung haben bei der Abwendung oder der Behandlung von Zuständen, die durch Calcium-Ungleichgewicht erzeugt werden (z.B. Dünne der Eischale, Schwäche von Geflügelbeinen) bei Geflügel, wobei alle die bekannten Vitamin D2-Derivate eine sehr schlechte Wirksamkeit aufweisen.

Zu therapeutischen Zwecken können die Verbindungen

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

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auf jeden herkömmlichen Verabfolgungswege und in jeder Form, die für die ausgewählte Verabfolgungsmethode geeignet ist, verabfolgt werden. Die Verbindungen können mit jedem verträglichen und unschädlichen pharmazeutischen Träger formuliert werden in Form von Pillen, Tabletten, Gelatinekapseln oder Suppositorien oder als Lösungen, Emulsionen, Dispersionen oder Suspensionen in unschädlichen Lösungsmitteln oder Ölen, und eine derartige Formulierung kann ebenfalls andere therapeutisch wirksame und vorteilhafte Bestandteile enthalten, wie sie für die speziellen Verabfolgungen zweckmässig sein können. Für Verabfolgungen an Menschen werden die Verbindungen vorteilhafterweise in Mengen von 0,5 bis 10 jag pro Tag verabfolgt, wobei die spe-5 zielle Dosis eingestellt wird in Übereinstimmung mit der speziellen verabfolgten Verbindung, der zu behandelnden Krankheit und dem Zustand und der Ansprache des Patienten, wie den Fachleuten auf diesem Gebiet verständlich ist.

C

1 Blatt Zeichnungen

Claims

667 658

2

PATENTANSPRÜCHE 1. Verbindungen der Formel

OH

worin R ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe ist.
2. Verbindung nach Anspruch 1, worin R ein Wasserstoffatom ist.
3. Verbindung nach Anspruch 2 in kristalliner Form.
4. Verbindung nach Anspruch 1, worin R eine Hydroxylgruppe ist.
5. Verbindung nach Anspruch 4 in kristalliner Form.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche die Verbindung nach Anspruch 2 und einen pharmazeutisch unbedenklichen Exzipienten enthält.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche die Verbindung nach Anspruch 4 und einen pharmazeutisch unbedenklichen Exzipienten enthält.