DE3590021T - 1α, 25-Dihydroxy-22Z-dehydrovitamin D-Verbindung - Google Patents

1α, 25-Dihydroxy-22Z-dehydrovitamin D-Verbindung

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DE3590021T
DE3590021T DE19853590021 DE3590021T DE3590021T DE 3590021 T DE3590021 T DE 3590021T DE 19853590021 DE19853590021 DE 19853590021 DE 3590021 T DE3590021 T DE 3590021T DE 3590021 T DE3590021 T DE 3590021T
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Description

PATENTANWÄLTE Dr. rer. nat. DIETER LOUIS
DJpl.-Phys. CLAUS PöHLAU
Dipl.-Ing. FRANZ LOHRENTZ / O \ r ~ ~ ~ ~ „
Dipl,PhyS.WOLFGANG SEGETH ** * 3 59 0 0
KESSLERPLATZ 1
8500 NÜRNBERG 20
1a>25-Dihydroxy-22Z-dehydrovitamin D-Verbindung
Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft eine biologisch aktive Vitamin D-Verbindung. Insbesondere betrifft die Erfindung eine neue 1cx,25-dihydroxylierte Vitamin D-Verbindung mit einer 22,23-cis-Doppelbindung in der Seitenkette und ein Verfahren zu deren Herstellung.
Hintergrund der Erfindung
Die Calcium- und Phosphat-Homöostase bei Tieren und Menschen wird durch Vitamin D-Metaboliten reguliert, und die Verbindung 1 α,25-Dihydroxyvitamin D3 wird allgemein als der aktivste und bedeutsamste vom Vitamin D abgeleitete Regulator des normalen Calcium- und Phosphat-Gleichgewichts angesehen. Dieser natürliche Metabolit und Verbindungen, die ihm struturell verwandt sind, sind somit von großem pharmazeutischem Interesse als wirksame Mittel zur Verhinderung und Behandlung von Knochenerkrankungen und verwandten Unregelmäßigkeiten des Calcium-Metabolismus. Zusätzlich zu den natürlichen D-^-Metaboliten sind in den letzten Jahren eine Reihe von Verbindungen hergestellt worden, die aufgrund ihrer hohen Wirksamkeit Anwendung finden oder als therapeutische Mittel sehr vielversprechend sind, wozu 1a-Hydroxyvitamin D^, 1a-Hydroxyvitamin D-, 1 α,25-Dihydroxyvitamin D- und bestimmte fluorierte Analogverbindungen gehören (US-PSen 3 741 996, 3 907 843, 3 880 894, 4 226 788, 4 358 406). Die meisten der bekannten aktiven Analogverbindungen sind durch den Typ von Sterol-Seitenkette charakterisiert, wie er beim Vita-
min D, auftaucht (d.h. gesättigte Seitenkette). Bekannte Analogverbindungen mit einer 22,23-ungesättigten Seitenkette werden durch die Verbindungen der Vitamin D^-Serie repräsentiert (d.h. 22,23-trans-ungesättigt mit einem
5 O24-Methylsubstituenten) , und umfassen zusätzlich zu den oben angegebenen Verbindungen 25-Hydroxyvitamin D- (US-PS 3 585 221) und die 24- und 24,25-Dihydroxyderivate (Jones et al., Arch. Biochem. Biophys. 202, 450 (1980)) und drei Verbindungen ohne den 24-Methylsubstituenten (US-PS !0 3 786 062·, Bogoslovskii et al., J. Gen. Chem. USSR, 48 (4) 828 (1978)·, Chem. Abstr. 8£, 163848J, 209016s).
Beschreibung der Erfindung
j5 Es wurde nun eine neue Analogverbindung des Vitamin D gefunden, welche durch die nachstehende Struktur I dargestellt werden kann:
Diese neue Verbindung ist charakterisiert durch eine 22,23-Doppelbindung in der Seitenkette mit der eis(oder Z)-Geometrie. Aufgrund der Gegenwart dieser 22Z-Doppelbindung, welche zu einer Seitenkettengeometrie führt, die recht unterschiedlich ist von derjenigen der Verbindüngen mit der normalen gesättigten Seitenkette (beispielsweise beim 1a,25-Dihydroxvitamin D3) oder einer 22,23-trans-(22E)-ungesättigten Seitenkette ( beispielsweise in 1a,25-Dihydroxyvitamin D„), wurde angenommen, daß dieses cis-ungesättigte Produkt eine geringe biologische Aktivität aufweisen würde, sofern überhaupt eine biologische Aktivität vorhanden wäre, überraschenderweise zeigt dieses Material im Gegensatz zu seiner geänderten
Seitenkettenstruktur eine hohe Aktivität und ist so aktiv wie Va,25-Dihydroxyvitamin D- in seiner Fähigkeit, die Serum-Calcium-Niveaus bei Testtieren zu erhöhen.
Herstellung der Verbindung
Das neue erfindungsgemäße Produkt, die obige Verbindung I, wurde aus einem 22Z-Dehydrovitamin D-Vorläufer mit der nachstehenden Struktur II hergestellt durch enzymatische Hydroxylierung in vitro am Kohlenstoffatom 25 unter Verwendung einer Leben-Homogenat-Präparation von Ratten mit einem Vitamin D-Mangel.
Das folgende Vorgehen wurde angewendet: Männliche Weanling-Ratten wurden mit einer Diät mit geringem Calcium- und Vitamin D-Mangel, wie sie von Suda et al. [J. Nutr. 100, 1049 (1970)] beschrieben wurde, für zwei Wochen gefüttert. Sie wurden durch Enthauptung getötet und ihre Lebern wurden entfernt. Ein 20 % (w/v)-Homogenat wurde in eiskalterÖ,25 M Sucrose hergestellt. Die Inkubation wurde durchgeführt in 10 ml Inkubationsmedium in einem 125 ml fassenden Erlenmayer-Kolben der ein Aliquot des Leberhomogenats enthielt, bestehend aus 1 g Gewebe, 0,125 M Sucrose, 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,4), 22,4 mM Glucose-6-phosphat, 20 mM ATP, 160 mM Nicotinamid, 25 mM Succinat, 0,4 mM NADP, 5 mM MgCl3, 0,1 M KCl und 0,5 Einheiten Glucose-6-phosphat-dehydrogenase. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 400 μg des Substrats, der obigen Verbindung II, gelöst in 100 μΐ 95 %-igen Ethanols, initiiert. Das Inkubationsgemisch wurde bei 370C inkubiert unter Schütteln mit 80 Schwingungen/Minute für
3 Stunden. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 20 ml Methanol und 10 ml Dichlormethan abgebrochen. Nach weiterer Zugabe von 10 ml Dichlormethan wurde die organische Phase gesammelt, während die wässrige Phase mit 10 ml Dichlormethan erneut extrahiert wurde. Die organischen Phasen aus den gesamten drei Extraktionen wurden vereint und mit einem Rotationsverdampfer eingedampft. Der Rückstand, welcher das gewünschte Produkt enthielt, wurde in 1 ml eines Gemisches von CHCl3:Hexan (65:35) gelöst und auf eine mit Sephadex LH-20 gepackte Säule (0,7 cm χ 14 cm) aufgebracht, equilibriert und mit demselben Lösungsmittel eluiert. Die ersten 10 ml wurden verworfen, während die folgenden 40 ml gesammelt und eingedampft wurden. Der Rückstand wurde sodann gelöst in 8 %-igem 2-Propanol in Hexan und einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unterworfen (Modell LC/GPC 204 HPLC, Firma Waters Associates, Medford, MA) unter Verwendung einer Zorbax-SIL-Säule (4,6 mm χ 25 cm, DuPont, Wilmington, Delaware), die unter einem Druck von 1000 psi mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min betrieben wurde. Das gewünschte 25-hydroxylierte Produkt wurde bei 44 ml eluiert. Dieses Produkt wurde weiter durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie gereinigt, wobei eine Umkehrphasen-Säule verwendet wurde (Richrosorb Rp-18, 4,6mm χ 25 cm, E. Merck, Darm-Stadt, West-Deutschland), die unter einem Druck von 1200 psi und einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min betrieben wurde. Die Säule wurde mit 22 % H2O in Methanol eluiert und die Verbindung wurde bei 50 ml eluiert. Dieses Produkt wurde ferner durch HPLC gereinigt, wobei die Zorbax-SIL-Säule und die oben beschriebenen Bedingungen verwendet wurden. Das erhaltene Produkt wurde sodann der physikalischen Charakterisierung unterworfen.
Charakterisierung des Produkts
Die UV-Absorption des Produkts in 95 %-igem Ethanol zeigte ein λ = 265 nm und ein λ . = 228 nm, wodurch das Vor-
handensein des 5,6-cis-Trien-chromophoren angezeigt wurde.
Das Massenspektrum der Substanz enthält ein Molekülion bei m/e 414, wie es für ein 25-hydroxyliertes Produkt erforderlich ist. Die Eliminierung von einem und zwei Molekülen H2O ergibt Fragmentionen bei m/e 396 und 378. Der Verlust der gesamten Steroid-Seitenkette (Abspaltung der C17/C2Q-Bindung) führt zu dem Fragment m/e 287, welches durch Eliminierung von einem oder zwei Molekülen KUO zu den Peaks bei m/e 269 und 251 führt. Das Spektrum zeigt deutliche Peaks bei m/e 152 und 134 (152-H2O), welche Ring Α-Fragmente repräsentieren und Hinweise für 1ot,3ß-Dihydroxyvitamin D-Verbindungen sind. Zusätzlich zeigt das Spektrum einen sehr deutlichen Fragmentpeak bei m/e 59, welcher sich aus der Abspaltung der C24/C25-Bindung ergibt. Das Vorhandensein dieses Ions bestätigte die Gegenwart der 25-Hydroxygruppe in dem Produkt. Somit bestätigten diese Daten die Struktur des Produktes, welches als die 1a,25-dihydroxylierte Verbindung erhalten wurde, welche durch die obige Struktur I dargestellt ist.
Biologische Aktivität
Die biologischen Aktivitäten der neuen Analogverbindungen wurden durch in vivo-Versuche bei Ratten demonstriert.
Männliche Weanling-Ratten wurden mit einer Diät mit einem geringem Galciüm- und Vitamin D-Mangel nach Suda et al. (obige Literaturangabe) für 3 Wochen gefüttert. Sie wurden sodann in Gruppen von jeweils 5 Ratten eingeteilt. Die Ratten in einer Kontrollgruppe empfingen 0,05 ml 95 %-igen Ethanols intrajugular, während die Ratten in den anderen Gruppen 325 pMol der Verbindung I oder von 1 ο,25-Dihydroxy vitamin D3 gelöst in 0,05 ml 95 %-igem Ethanol erhielten. 18 Stunden später wurden sie durch Enthauptung getötet und das Blut wurde gesammelt. Das Serum, welches durch Zentrifugieren des Blutes erhalten wurde, wurde mit 0,1 %-iger Lanthanchlorid-Lösung (1:20) verdünnt und die
Serum-Calcium-Konzentration wurde mit einem Atomabsorptions-Spektrophotometer ermittelt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle dargestellt:
Ansteigen der Serum-Calcium-Konzentration in
Ansprache auf eine Einzeldosis von 325 pMol der Verbindung I oder von 1a,25-Dihydroxyvitamin D3, welche 18 Stunden vor der Tötung verabfolgt werden
Verabfolgte Serum-Calcium-Konzentration
Verbindung (mg/1Ö0 ml) +_ Standardab
weichung
Ethanol 4,2 +_ 0,1 a)
Verbindung I 5,2 _+ 0,2 b)
1o,25-Dihydroxyvitamin D_ 5,4 + 0,4
' ist deutlich unterschiedlich von a' ρ <0,001
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß die neue Analogverbindung in hohem Maße wirksam ist und eine biologische Aktivität aufweist, die im wesentlichen zu derjenigen von 1a,25-Dihydroxyvitamin D_ äquivalent ist.
Aufgrund dieser hohen Wirksamkeit wird diese erfindungsgemäße Verbindung als ein therapeutisches Mittel Anwendung finden in der Therapie oder Prophylaxe von Erkrankungen derartig verschiedener Arten, wie Rachitis, Hypoparathyroidismus, Knochendystrophie, Knochenerweichung oder Osteoporose beim Menschen oder zur Behandlung von verwandten Calcium-Mange!erkrankungen (z.B. Milchfieber, Beinschwäche, geringe Eierschalenstärke) bei Tieren. In gleicher Weise kann die Verbindung bei der Behandlung von bestimmten malignen Erkrankungen angewandt werden, wie bei Leukämie beim Menschen.
Zu therapeutischen Zwecken kann die Verbindung nach jeder herkömmlichen Verabfolgungsweise und in jeder geeigneten
Form für die ausgewählte Verabfolgungsweise verabfolgt werden. Die Verbindung kann mit jedem verträglichen und unschädlichen pharmazeutischen Träger in Form von Pillen/ Tabletten, Gelatinekapseln oder Suppositorien oder in Form von Lösungen, Emulsionen, Dispersionen oder Suspensionen in unschädlichen Lösungsmitteln oder ölen formuliert werden, und derartige Formulierungen können auch andere therapeutisch wirksame und vorteilhafte Bestandteile enthalten, wie sie für die spezifischen Anwendungen geeig-
IQ net sein können. Für Anwendung beim Menschen wird die Verbindung vorteilhafterweise in Mengen von 0,25 bis 10 μg pro Tag verabfolgt, wobei die spezifische Dosierung in Übereinstimmung mit der zu behandelnden Krankheit und mit der medizinischen Entwicklung, dem Zustand und dem Anspre-
jc chen des Patienten ausgewählt wird, wie dem Fachmann vertraut ist.
Das 22Z-Dehydro-Vorläufersubstrat, die obige Verbindung II, welche für die Herstellung des neuen Produkts gemäß der Erfindung erforderlich ist, wird selber nach dem Verfahrensschema I gemäß Anlage und gemäß nachfolgender Beschreibung hergestellt. In der Beschreibung beziehen sich die Verbindungsbezeichnungen nach arabischen Ziffern (z.B. (Y) , (2) , (_3) , etc.) auf die so durchnumerierten Strukturen in dem Verfahrensschema. Das gewünschte Substrat (Verbindung II) für die oben beschriebene 25-Hydroxylierungsreaktion wird durch die arabische Ziffer (JT[) im Verfahrensschema I und in der folgenden Beschreibung identifiziert.
(22Z)-3ß-(Methoxymethoxy)-5a,8a-(4-phenyl-1,2-urazol)- cholesta-6,22-dien (2)
Isopentylphosphoniumbromid [(CH3)2CHCH2CH2PPh3Br] (1,67 g, 4,04 mMol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (73 ml) wurde gr mit n-Butyllithium (1,7 M Lösung in Hexan, 2,42 ml, 4,11 mMol) bei 3-50C unter Rühren behandelt. Nach 1-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die orange-rote Losung auf
3°C gekühlt und der Aldehyd (j[) (1,84 g, 3,36 mMol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (24 ml) wurde zugesetzt. Das farblose Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und sodann in Wasser eingegossen und mit Benzol extrahiert. Der organische Extrakt wurde mit 5 % HCl, gesättigtem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen, getrocknet (Na3SO4) und unter vermindertem Druck zu einem öl eingeengt, welches über einer Säule mit Silikagel gereinigt wurde. Die Eluation mit einem Gemisch von Benzol-Ether (94:6) lieferte das Addukt (2) (1,38 g, 68 %) als einen Schaum: NMR δ 0,83 (3H, s, 18-H3), 0,89 und 0,91 (6H, jeweils d, J=6,8 Hz, 26-H3 und 27-H3), 0,97 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-H3), 0,98 (3H, s,. 19-H3), 3,30 (1H, dd, J.,=4,4 Hz, J2=14 Hz, 9-H), 3,38 (3H, s, OCH3), 4,33 (1H, m, 3-H), 4,70 und 4,81 (2H, ABq, J=6,8 Hz, OCH2O), 5,21 (2H, br m, 22-H und 23-H), 6,23 und 6,39 (2H, ABq, J=8,5 Hz, 6-H und 7-H), 7,41 (5H, br m, Ar-H)-, IR: 1756, 1703, 1601, 1397, 1046 cm ·, Massenspektrum m/z 601 (M+, 1 %) , 426 (4), 364 (61), 349 (16), 253 (18), 251 (18), 119 (PhNCO, 100).
(22Z)-5a,8q-(4-Phenyl-1,2-urazol)cholesta-6,22-dien-3ß-ol
Eine Lösung des Addukts (2) (601 mg, 1 mMol) und p-Toluolsulfonsäure (523 mg, 2,75 mMol) in einem Gemisch aus Methanol (20 ml)-THF (12 ml) wurde 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt . Das Reaktionsgemisch wurde in gesättigtes Natriumbicarbonat eingegossen und einige Male mit Benzol extrahiert. Die Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und unter vermindertem Druck einge-
QQ dampft. Die Reinigung des Rohprodukts durch Säulenchromatographie (Benzol-Ether 70:30 als Eluationsmittel) ergab das Hydroxyaddukt O) (550 mg, 99 %) als einen Schaum: NMR δ 0,83 (3H, s, 18-H3), 0,89 und 0,91 (6H, jeweils d, J=6,8 Hz, 26-H3 und 27-H3), 0,95 (3H, s, 19-H3), 0,98 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-H3), 3,16 (IH, dd, J.,=4,4 Hz, J2 = 14 Hz, 9-H), 4,44 (1H, m, 3-H), 5,22 (2H, br m, 22-H und 23-H), 6,22 und 6,39 (2H, ABq, J=8,5 Hz, 6-H und 7-H), 7,40 (5H,
40-
-1.
br m, Ar-H); IR: 3447, 1754, 1700, 1600, 1397 cm Massenspektrum m/z 557 (M+, 1 %) , 3 (20), 251 (33) , 119 (100) , 55 (82).
Massenspektrum m/z 557 (M+, 1 %), 382 (35), 349 (33), 253
(22Z) -Cholesta-5 ,7,22-trien-3ß-ol (4_) Das Addukt (3) (530 mg, 0,95 mMol) wurde in das Dien (4_) überführt durch Reduktion mit Lithiumaluminiumhydrid (1 g) in Tetrahydrofuran (60 ml) unter Rückfluß für 18 Stunden. Nach der herkömmlichen Aufarbeitung wurde das Produkt durch Chromatographie über Silika gereinigt (Benzol-Ether 94:6 als Eluationsmittel), um das reine Dien (4_) (290 mg, 76 %) nach der ümkristallisation aus Ethanol zu ergeben: Schmelzpunkt 148-151°C; [a]£ = -132° (c=0,9, CHCl3); NMR δ 0,66 (3H, s, 18-H3), 0,90 und 0,91 (6H, jeweils d, J=6,8 Hz, 26-H3 und 27-H3), 0,96 (3H, s, 19-H3), 0,98 (3H, d, J=6,9 Hz, 21-H3), 3,64 (TH, m, 3-H), 5,20 (2H, br m, 22-H und 23-H), 5,39 und 5,57 (2H, ABq, J=6 Hz, 7-H und 6-H)}
UV 281 nm; IR: 3346, 1463, 1375, 1364, 1067, 1040, max
831 cm"1; Massenspektrum m/z 382 (M , 100), 349 (65), 323 (32), 271 (15), 253 (30).
(5 Z,7E,22Z)-9,1O-Secocholesta-5,7,10(19) ,22-tetraen-3ß-ol (5)
Die Bestrahlung des 5,7-Diens (4_) (150 mg, 0,39 mMol), welches -r- in Ether (120 ml) und Benzol (30 ml) (mit Argon für 40 Minuten entgast) gelöst war, wurde bei 0.0C für 13 Minuten unter Verwendung einer UV-Lampe und eines Vycor-Filters durchgeführt. Die HPLC (1 % von 2-Propanol in Hexan) des erhaltenen Gemisches lieferte das Provitamin (56,9 mg, 38 %) als ein farbloses öl: NMR δ 0,75 (3H, s, 18-CH3), 0,90 und 0,91 (6H, jeweils d, J=6,7 Hz, 26-H3 und 27-H3), 0,99 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-H3), 1,64 (3H, s, 19-H3), 3,90 (1H, m, 3-H), 5,20 (2H, br m, 22-H und 23-H), 5,69 und 5,95 (2H, ABq, J=12 Hz, 7-H und 6-H); UV λ 261 nm, ^ min 234 nm.
Die thermische Isomerisierung dieser Provitamin-Zwischen-
verbindung (56 mg, 0,15 mMol) in unter Rückfluß siedendem Ethanol (3 Stunden) ergab die ölige Vitamin-Analogverbindung (5_) (43 mg, 77 %) nach der Trennung mittels HPLC. NMR δ 0,60 (3H, s, !8-H3), 0,89 und 0,90 (6H, jeweils d, J=6,7 Hz, 26-H3 und 27-H3), 0,97 (3H, d, J=6,6 Hz, 21-H3), 3,96 (1H, s, 3-H), 4,82 und 5,05 (2H, jeweils schmales Multiplet, 19-H2), 5,20 (2H, br m, 22-H und 23-H), 6,04 und 6,24 (2H, ABq, J=11,4 Hz, 7-H und 6-H); A
IUcLX
265,5 nm, 7imin 228 nm·, IR: 3427, 1458, 1379, 1048, 966, 943, 892 cm-1; Massenspektrum m/z 382 (M+, 21), 349 (5), 271 (8), 253 (14), 136 (100), 118 (82) . Die Vitamin-Analogverbindung (5_) ist eine bekannte Verbindung (Bogoslovskii et al., obige Literaturangabe).
1-Hydroxylierung der Verbindung (5) Frisch umkristallisiertes p-Toluolsulfonylchlorid (50 mg, 0,26 mMol) wurde zu einer Lösung des Vitamins (5_) (50 mg, 0,13 mMol) in wasserfreiem Pyridin (300 μ.1) zugesetzt. Nach 30 Stunden bei 40C wurde das Reaktionsgemisch in Eis/gesättigte NaHCO3 unter Rühren eingegossen. Das Gemisch wurde 15 Minuten gerührt und mit Benzol extrahiert. Der organische Extrakt wurde mit gesättigter NaHCO3, gesättigtem Kupfersulfat und Wasser gewaschen, getrocknet (Na-SO.) und unter vermindertem Druck eingeengt, um das ölige Tosylat (6_) zu ergeben. Das rohe Tosylat (6_) wurde mit NaHCO3 (150 mg) in wasserfreiem Methanol (10 ml) behandelt und das Gemisch wurde 8,5 Stunden bei 550C gerührt. Nach dem Kühlen und dem Einengen auf 2 ml wurde das Gemisch mit Benzol (80 ml) verdünnt, mit Wasser gewaschen, getrocknet (Na2SO.)und unter vermindertem Druck eingeengt. Die ölige 3,5-Cyclovitamin D-Verbindung (2)/ die so erhalten wurde, war von hinreichender Reinheit, um für die folgende Oxidationsstufe ohne jegliche Reinigung verwendet zu werden. Zu einer heftig gerührten Suspension von SeO2 (5,1 mg, 0,046 mMol) in wasserfreiem CH2Cl2 (5 ml) wurde tert.-Buty!hydroperoxid (16,5 μΐ, 0,118 mMol) zugesetzt. Nach 30 Minuten wurde wasserfreies
Pyridin (50 μΐ) zugesetzt und das Gemisch wurde weitere 25 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, mit CH3Cl2 (3 ml) verdünnt und auf 00C gekühlt. Das rohe 3,5-Cyclovitamin-Produkt (2) in CH2Cl2 (4,5 ml) wurde sodann zugegeben. Die Reaktion schritt bei 00C für 15 Minuten fort und das Reaktionsgemisch wurde sodann langsam (30 Minuten) auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Das Gemisch wurde in einen Trenntrichter überführt und mit 30 ml 10 %-iger NaOH geschüttelt. Ether (150 ml) wurde zugesetzt und die abgetrennte organische Phase wurde mit 10 %-iger NaOH, Wasser gewaschen und über Na3SO4 getrocknet. Die Einengung zur Trockne unter vermindertem Druck ergab einen gelben öligen Rückstand, der gereinigt wurde über einer Silikifgel-TLC-Platte unter Entwicklung mit 7:3 Hexan-Ethylac:etat und das 1-Hydroxycyclovitamin-Produkt (20 mg, 37 %) ergab: NMR δ 0,59 (3H, s, 18-H3), 0,63 (1H, m, 3-H), 0,89 und 0,90 (6H, jeweils d, J=6,9 Hz, 26-H3 und 27-H3), 0,96 (3H, d, J=6,9 Hz, 21-H3), 3,25 (3H, s, -OCH3), 4,17^(2H, m, 1-H und 6-H), 4,96 (1H, d, J=9,3 Hz, 7-H), 5,1-5,4 (4H, br m, 19-H2, 22-H und 23-H); Massenspektrum m/z 412 (M+, 26), 380 (48), 339 (22), 269 (28), 245 (20), 135 (100). Dieses Produkt setzte sich hauptsächlich zusammen aus der 1 ot-Hydroxycyclovitamin D-Verbindung der Struktur (8) , wie auch aus einer geringen Menge des entsprechenden 1ß-Hydroxy-Epimeren. Diese Komponenten können in dieser Stufe getrennt werden, sofern dies gewünscht wird, jedoch ist eine derartige Trennung nicht erforderlich.
Das nach dem oben beschriebenen Verfahren erhaltene 1-Hydroxycyclovitamin-Produkt (18 mg) wurde erhitzt (55°C/15 min) in Eisessig (0,8 ml), das Gemisch wurde neutralisiert (Eis/gesättigte NaHCO3) und mit Benzol und Ether extrahiert, um nach der HPLC (1,5 % von 2-Propanol in Hexan als Eluationsmittel)-Trennung die reinen 1a-Hydroxy-3ß-acetoxyvitamine (9) (6,60 mg, 34 %,*"Eluation bei 42 ml) und (j_0) (4,20 mg, 22 %, Eluation bei 50 ml) zu ergeben.
Verbindung (9): NMR δ 0,60 (3H, s, !8-H3), 0,90 und 0,92 (6H, jeweils d, J=7,0 Hz, 26-H3 und 27-H3), 0,97 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-H3), 2,04 (3H, s, -OCOCH3), 4,41 (1H, m, 1-H), 5,02 (1H, schmales Multiplet, 19-H), 5,1-5,4 (4H, br m, 3-, 19-, 22- und 23-H), 6,03 und 6,35 (2H, ABq, J=11,4 Hz, 7-H und 6-H); UV λ_ 264,5 nm, > . 227,5 nm; Massen-
lud x min
Spektrum m/ζ 440 (M , 10), 380 (72), 362 (7), 269 (31), 251 (12), 135 (100) , 134 (99) .
Verbindung (J[O) : NMR δ 0,60 (3H, s, 18-H3), 0,90 und 0,91 (6H, jeweils d, J=7,0 Hz, 26-H3 und 27-H3), 0,97 (3H, d, J=6,9Hz, 21-H3), 2,05 (3H, s, -OCOCH3), 4,49 (1H, m, 1-H), 5,00 und 5,14 (2H, jeweils schmales Multiplet, 19-H2), 5,20 .(3H, br m, 3-, 22- und 23-H), 5,82 und 6,59 (2H, ABq, J=12,0 Hz, 7-H und 6-H); UV } 270 ταα,'Χ . 228 nm;
max mxn
Massenspektrum m/z 440 (M , 4), 380 (30), 269 (10), 135 (100) ,. 134 (52) .
Hydrolyse des 3ß-Acetoxyrestes in den Verbindungen (9)
und (10)
Jede der 3ß-Acetoxy-Derivate (J)) oder (J[O) wurde getrennt hydrolysiert unter Verwendung des gleichen Verfahrens. Eine Lösung von 3ß-Acetoxyvitamin (0,7-6 mg) in Ethanol (0,1 ml) wurde mit 10 % KOH in Methanol (0,8 ml) behandelt und das Gemisch wurde für 1 Stunde auf 500C erhitzt. Nach der üblichen Aufarbeitung und der abschließenden HPLC-Reinigung (8 % von 2-Propanol in Hexan als Eluationsmittel) wurden die entsprechenden 1-Hydroxyvitamine erhalten, nämlich:
Verbindung (11): NMR δ 0,59 (3H, s, 18-H-), 0,89 und 0,90
™—"~ Jj
(6H, jeweils d, J=7,0 Hz, 26-H3 und 27-H3), 0,96 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-H3), 4,23 (1H, m, 3-R), 4,43 (1H, m, 1-H), 5,00 (IH, schmales Multiplet, 19-H), 5,1-5,4 (3H, br m, 19-, 22- und 23-H), 6,02 und 6,39 (2H, ABq, J=11,4 Hz, 7-H und 6-H); UV λ 264,5 nm, > . 227,5 nm; Massenspektrum m/z 398 (M , 21), 380 (8), 287 (6), 269 (7), 251 (5), (36), 134 (100). (Eluationsvolumen 39 ml).
Verbindung (12): NMR δ 0,61 (3Η, s, 18-Η_), 0,89 und 0,91 — j
(6H, jeweils d, J=7,0 Hz, 26-H3 und 27-H3), 0,97 (3H, d, J=6,9 Hz, 21-H3), 4,25 (1H, m, 3-H), 4,51 (1H, m, 1-H), 4,98 und 5,13 (2H, jeweils schmales Multiplet, 19-H2), 5,21 (2H, br m, 22-H und 23-H), 5,89 und 6,59 (2H, ABq,
J=11,5 Hz, 7-H und 6-H) ; UV* 273 nm, ^ . 229,5 nm>
ludx lux η
lud.x lux η Massenspektrum m/z 398 (M+, 17), 380 (4), 287 (5), 269 (5), 251.(4), 152 (29), 134 (100). (Eluationsvolumen 38 ml).
!0 In dem oben beschriebenen Verfahren wurde die Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) durchgeführt mittels einer Vorrichtung der Firma Waters Associates, Modell ALC/GPC 204 unter Verwendung einer Säule mit Zorbax-Sil (DuPont) (6,2 nun χ 25 cm Säule, Fließgeschwindigkeit 4 ml/min, 1500 psi). Die Säulenchromatographie wurde durchgeführt mit Silikagel 60, 70-230 mesh ASTM (Merck). Die präparative Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde durchgeführt über Silica 60 PF-254 (Platten mit 20 χ 20 cm, 1 mm Silicagel). Die Bestrahlungen wurden durchgeführt durch Verwen-
2Q dung einer Quecksilberdampf-Bogenlampe Hanovia 608A36, welche mit einem Vycor-Filter ausgerüstet war. Alle Reaktionen werden vorzugsweise unter einer Inertgasatmosphäre (z.B. Argon) durchgeführt.
Die erfindungsgemäße Verbindung kann, sofern dies gewünscht wird, in kristalliner Form durch Umkristallisation aus geeigneten Lösungsmitteln, wie Hexan, Ethern und Alkoholen (absolut oder wässrig) und Gemischen davon erhalten werden, wie dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist.
Verfahrensschema I
45-
CHO
R«CH1OC H1
WO**
(£) R'H (6) R> Ts
IZ) 'R ■ CH1OCH,
R« H
X,« Acetyl (M) X1 1H
HO" - 0X. (ΙΟ) X, «Acetyl (12) X1 = H

Claims (3)

  1. HAIfcNIANWALIt Or. rer. nat. DIETER LOUIS Dlpl.-PHys. CLAUS POHLAU
    Dipl.-lng. FRANZ LOHRENT2 . j r
    Dlpl.-Phys.WOLFGANG SEGETH 1^ VO*
    KESSLERPLATZ 1 '8S00 NÜRNBERG-2Ό
    Patentansprüche 1. Verbindung der Struktur
    10
    15
  2. 2. Verbindung nach Anspruch 1 in kristalliner Form.
  3. 3. Pharmazeutische Formulierung, welche die Verbindung nach Anspruch 1 zusammen mit einem pharmazeutisch
    verträglichen Exzipienten enthält.
    25 30 35
DE19853590021 1984-01-30 1985-01-07 1&alpha;, 25-Dihydroxy-22Z-dehydrovitamin D-Verbindung Pending DE3590021T (de)

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