DK158786B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af 1alfa-hydroxyvitamin d3 eller diacetatet deraf - Google Patents

Description

DK 158786 B

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af den hidtil ukendte forbindelse 1a-hydroxyvitamin , der har den i krav 1's indledning viste almene formel I, eller diacetatet deraf. Fremgangsmå-5 den ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav 1's kendetegnende del anførte.

1a-Hydroxyvitamin D-derivater som tillige indeholder en 25-hydroxygruppe vides at have fordelagtige biokemiske egenskaber der giver dem en betydelig værdi i terapi-10 en. De er således både hurtigere virkende og elimineres hurtigere fra systemet end de tilsvarende 1a-usubstituere-de forbindelser, og som resultat heraf er deres sandsynlighed for at inducere vitaminforgiftning mindre end de konventionelle vitamin D-forbindelser, der kun langsomt eli-15 mineres fra systemet. Desuden er de hydroxylerede derivater effektive med hensyn til at lindre symptomer på åbenbar vitamin D-mangel, der ikke reagerer på behandling med de konventionelle vitaminer.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendte 20 udgangsmaterialer med formlen II kan fremstilles ved, at 1a-hydroxy- og 1cc,2a-epoxysteroid-4,6-dien-3-oner og tilsvarende 6-substituerede steroid-4-en-3-oner, hvor 6-sub-stituenten er et reduktivt eliminerbart atom eller gruppe, reduceres direkte til den 25 tilsvarende 1a,3B-dihydroxysteroid-5-en ved omsætning med et alkalimetal/flydende ammoniak- eller alkalimetal/fly-dende amin-reduktionsmiddel i nærværelse af en protonkilde. Under disse betingelser undergår de i høj grad oxyderede udgangsmaterialer sekvensreduktion til det ønskede produkt praktisk talt uden nogen isomerisation af dobbeltbindinger eller eliminering af substituenter i Ø-stilling i forhold til karbonylgruppen i 3-stillingen. Man kan herved nå frem til en forbindelse med formel IV.

Egnede keton-udgangsmaterialer til fremstilling af et sådant 1a-hydroxysteroid-udgangsmateriale kan gengives ved den almene formel

DK 158786 B

2 . CH^T ^ R1 CH-j

R? j.cfA L_J

i ' I 111 i3 1 2 hvor R er en hydroxylgruppe og R et hydrogenatom, eller 1 2 hvor R og R tilsammen danner en epoxydgruppe , 3 10 hvor R er et reduktivt eliminerbart atom eller en reduk-. . 4 tivt eliminerbar gruppe og R er et hydrogenatom, eller 3 4 hvor R og R tilsammen danner en kulstof-kulstof-dobbelt-binding.

Reduktion af en forbindelse med den almene formel 15 III fører til dannelse af en 1a,33-diol der gengives med formlen R o c __ CH -j J ·, ·»· o CH > OH CH3

20 -‘ IV

XXJ

HCK *

Reduktivt eliminerbare substituenter som kan være til stede i 6-stillingen i udgangsmaterialet, dvs. som 25 3 gruppen R i formel III, er fx halogenatomer såsom fluor-, klor-, eller bromatomer, samt kulbrintesulfonatgrupper som fx aromatiske kulbrintesulfonatgrupper såsom p-tosylat eller alifatiske kulbrintesulfonatgrupper såsom mesylatgruppen.

Alkalimetaller i reduktionsmidlet kan fx være li-tium, natrium og kalium, idet litium er det foretrukne metal. Anvendelige flydende aminer er bl.a. primære, sekundære og tertiære alkylaminer, dialkylaminer, diaminer og mættede heterocykliske aminer.

Protonkilder i reaktionen er bl.a. ammonium- og aminsalte, nitrater, sulfater og lavtkogende alkanoler.

Reduktionen udføres hensigtsmæssigt i et inaktivt organisk opløsningsmiddel, fx tetrahydrofuran, dioxan el-

DK 158786 B

3 ler hexan. Det kan være fordelagtigt at udelukke fugtighed og/eller oxygen fra reaktionssystemet. Når der bruges et opløsningsmiddel, udføres reduktionen hensigtsmæssigt ved en temperatur mellem opløsningsmidlets frysepunkt og 5 100°C, fordelagtigt i kulden.

Det foretrækkes i almindelighed at beskytte 1a-hy-droxygruppen i steroid-udgangsmaterialet, fx med en fraspaltelig beskyttelsesgruppe, for at undgå dannelse af et 6 7 Δ ' -steroid som resultat ved intern protonoverføring. Eg-1 q nede beskyttelsesgrupper er bl.a. silylgrupper.

De dannede 1a,3ø-dihydroxy-steroid-5-ener kan omdannes til de tilsvarende 1a, 3/3-dihydroxy-steroid-5, 7-diener ved fx konventionel teknik såsom bromering i 7-stillingen, efterfulgt af dehydrobromering, fx med et amid såsom dime-·] 5 tylacetamid i nærværelse af et jordalkalimetalkarbonat.

Dehydrobromering kan også ske ved behandling med trimetyl-fosfit eller en base såsom kollidin, pyridin eller diazabi-cyklooktan.

7,8-Dobbeltbindingen kan også indføres under anven-20 delse af den af Daubin et al udarbejdede metode, fx ved at oxydere 1a,3/3-dihydroxysteroid-5-enen til den tilsvarende steroid-5-en-7-on med et kromtrioxyd-oxydationsmiddel, hvorefter man omsætter denne keton med et sulfonylhydra-zin til dannelse af den tilsvarende 7-sulfonylhydrazon, 25 som derefter underkastes en Wolff-Kishner-reduktion til dannelse af den ønskede 5,7-dien.

Det kan være fordelagtigt at beskytte 1a- og 30-hydroxygrupper såsom ved forestring til fx dibenzoatet for at undgå uønskede bireaktioner under den reaktionsfølge 30 der behøves til indførelse af 7,8-dobbeltbindingen.

Den steroid-5,7-dien, der fremkommer ved behandling af en forbindelse med den almene formel IV på en eller anden af de foran beskrevne metoder gengives ved formlen 35 ph ch3

jÆl I__I V

X I

HO ’ 4

DK 158786B

Bestråling af en forbindelse med formlen V, fortrinsvis med næsten ultraviolet lys, fx med en bølgelængde på 275-300 nm, bevirker dannelsen af et 1a-hydroxyleret prævitamin som kan gengives med den i krav 1's kendetegnende del viste formel II.

C

^ Forbindelsen med formel II kan eventuelt være i termisk ligevægt med 1a-hydroxyvitamin med formel I og omdannes ifølge opfindelsen dertil ved opvarmning fx i en alkohol eller et kulbrinte-opløsningsmiddel. Forbindelsen har den i krav 1 viste cis-konfiguration. Dannelsen ^ af uønskede oxyderede biprodukter under denne omdannelse kan minimeres ved forestring af 1a- og 3/3-hydroxygrupperne, med eddikesyre eller et reaktivt derivat deraf.

Udgangsmaterialet med formel III kan fremstilles ved en hvilken som helst hensigtsmæssig måde, fx ved oxydering af den til- 1 5 svarende 3-hydroxysteroid-5-en, fx ved anvendelse af et guinol/gui-non-oxydationsmiddel såsom diklordicyanguinon efterfulgt af behandling med et peroxyd, fx hydrogenperoxyd sammen med en base såsom natriumhydroxyd, hensigtsmæssigt i et vandigt alkoholisk medium, til dannelse af 1a,2a-epoxydet, 20 der om ønsket kan omdannes til den tilsvarende 1a-hydroxy-forbindelse ved reduktion, fx under anvendelse af zink og en syre såsom eddikesyre.

1a-Hydroxyvitamin har ikke blot højere vitaminaktivitet end vitamin D„ og vitamin D,, men også end de 25 Δ o kendte 1a,25-dihydroxyvitamin D-forbindelser. Således udviser fx 1a-hydroxyvitamin en langt kraftigere virkning på knoglemetabolismen end disse; forsøg i vitamin D3~ræk~ ken viser at 1a-hydroxyvitamin er 10-50 gange så aktivt som usubstitueret vitamin D,, mens 1a,25-dihydroxyvitamin 30 5 kun er 3-5 gange så kraftigt som det usubstituerede vitamin. Disse resultater er særlig overraskende i betragtning af tidligere formodninger om, at 25-hydroxygruppen er involveret i metabolismen og derfor må formodes at være aktivitetsfremmende. 1α-Hydroxyvitamin D, er også hurtigt 35 ^ virkende og elimineres hurtigt fra organismen, så de problemer man tidligere har stødt på med hensyn til vitamin-

DK 158786 B

5 forgiftning praktisk taget undgås ved anvendelse af denne forbindelse.

1a-Hydroxyvitamin er bl.a. i stand til at stimulere tarmens kalciumtransport, knoglernes kalciummobilise-5 ring, knoglemineralisering og knogledannelse.

1oc-Hydroxyvitamin har betydningsfulde profylaktiske og terapeutiske anvendelser til forebyggelse eller behandling af mangeltilstande såsom rachitis og osteomala-ci, og det er værdifuldt til behandling af sygdomme der rea-10 gerer på vitamin D såsom hypoparathyreoidisme, hypofos- fatæmi, hypokalcæmi og beslægtede knoglelidelser, nyreforstyrrelser og nyresvigt og hypokalcæmisk tetani. Desuden gør den kraftigere virkning af 1a-hydroxyvitamin i sammenligning med konventionelle 1-hydrogenvitamin D-forbin-15 delser 1α-hydroxyvitamin værdifuld til behandling af sådanne forstyrrelser som vitamin D-resistent rachitis, renal osteodystrofi, steatorré galde-cirrose og andre funktionsfejl i absorption, osteoporose, sekundær hypokalcæmi og/eller knoglelidelser stammende fra dysfunktio-20 ner i lever, nyre eller mave-tarmkanalen, samt sekundær hypokalcæmi eller knoglesygdomme stammende fra behandling med dilantin, barbiturater såsom fenylbarbitone og beslægtede lægemidler, der viser sig modstandsdygtige over for konventionelle forbindelser såsom vitamin .

25 I almindelighed kan 1α-hydroxyvitamin indgives parenteralt sammen med en injicerbar væskeformet bærer såsom sterilt pyrogenfrit vand, sterilt peroxydfrit ætylole-at, dehydratiseret alkohol, propylenglykol eller en dehy-dratiseret blanding af alkohol og propylenglykol. Sådanne 30 præparater kan indgives intravenøst, intraperitonealt eller intramuskulært. Injicerbare forbindelser oparbejdes fortrinsvis i dosisenhedsform, fx i ampuller, således at hver enhed med fordel indeholder 0,1-200 pg og fortrinsvis 0,2-20 pg af den aktive vitaminforbindelse. Den normale dosis 35 til behandling af voksne mennesker vil i almindelighed være i området 0,1-200 pg om dagen, idet lavere doser inden for dette område, fx 0,1-2 pg bruges ved profylakse og 6

DK 158786B

højere doser, fx 5-50 pg, ved terapeutisk behandling.

I betragtning af følsomhed ,n af 1α-hydroxyvitamin for oxydation foretrækkes det i almindelighed at farmaceutiske præparater indeholdende disse materialer inde-5 holder i det mindste spor af en antioxydant såsom ascorbin-syre, butyleret hydroxyanisol eller hydroquinon.

Det har meget overraskende vist sig at 1a-hydroxyvi-tamin har fremragende aktivitet ved oral indgift. Denne egenskab var fuldstændig uventet i betragtning af tidli-10 gere resultater med hensyn til la,25-dihydroxyvitamin D^, der har vist at orale doser af dihydroxyvitaminet har meget lav aktivitet (fx bestemt ved målinger over den anti-rakitiske aktivitet) og at parenteral indgift af dihydroxy-vitaminet er nødvendig for at opnå gunstige terapeutiske 15 resultater; man ville normalt forvente at 1a-hydroxyvita-min D-forbindelserne ville udvise analog almen opførsel med det tilsvarende dihydroxyvitamin i betragtning af ligheden i arten af den biologiske aktivitet hos disse forbindelser i andre henseender.

20 Den følgende tabel, der viser effekten på serumkal cium- og fosforniveauet for parathyreoidektomiserede/thy-reoidektomiserede rotter (hanrotter af stammen Charles River med en vægt på 80-100 g; hver forsøgsgruppe med 6 rotter) af oral indgift af Ια-hydroxyvitamin D^ og 1a,25-dihydro-25 xyvitamin D^ (0,1 pg/kg ved gastrisk intubation), godtgør at 1α-hydroxyvitamin D^ har god aktivitet ved oral indgift, hvilket fremgår af stigningen i serumkalcium-niveauet i forhold til de ubehandlede kontroldyr, hvorimod oralt indgivet 1a,25-dihydroxyvitamin D^ er forholdsvis inak-30 tivt og ikke frembringer nogen signifikant ændring i serumkalcium-niveauet i forhold til kontroldyrene.

Tabellen viser også at de metaboliske ændringer, der frembringes af 1α-hydroxyvitamin D^ er af forholdsvis kort varighed, idet serumkalcium-niveauet hos de med 1a-35 hydroxyvitamin D^ behandlede rotter ligger tæt ved niveauet hos kontrolrotterne inden for 24 timer efter indgiften

DK 158786 B

7 af vitaminet. Dette bekræfter at 1a-hydroxyvitamin hurtigt elimineres af systemet og dermed ikke giver nævneværdig risiko for at frembringe bivirkninger i form af uønskede vitaminforgiftninger.

5

Tabel I

Virkning af oralt indgivet 1a-hydroxyvitamin og 1a,25- dihydroxyvitamin på serumkalciumniveauet og fosforniveauer hos parathyreoidektomiserede/thyreoidektomiserede 10 rotter.

Vitamin Serumkalc.iumniveau Serumfosforniveau indgivet {mg/100 ml) (mg/100 ml) 8 timer 24 timer 8 timer 24 timer efter efter efter efter 15 indgift indgift indgift indgift (kontrol) 4,5+0,43 4,8+0,46 12,0+0,44 14,1+1,9 lot-hydroxy- vitamin D3 9,9+0,80 6,4+0,73 9,5+1,1 14,5+1,0 1a,25-dihydro~ xyvitamin D3 5,9+0,56 5,8+0,52 13,3+1,73 13,0+1,44

Virkningen efter oral indgift og den deraf følgende nemhed ved indgiften af 1α-hydroxyvitamin giver den-25 ne forbindelse meget betydelig terapeutisk værdi ved en lang række anvendelser og gør den særlig nyttig i sammenligning med kendte, parenteralt indgivelige 1a,25-dihydro-xyvitamin D-derivater.

1a-Hydroxyvitamin D3 kan fx bruges som næringstil-30 skud eller komponenter i næringstilskud, fx i kombination med andre vitaminer. Et eksempel på en sådan anvendelse er berigelse af mælk, idet inkorporering af 0,1-0,5 pg 1a-hydroxyvitamin D3 pr. liter mælk vil være af profylaktisk værdi til forhindring af forstyrrelser som fx rachitis og 35 osteomalaci.

DK 158786B

8

Tilsvarende kan 1a-hydroxyvitamin oparbejdes til oralt indgivelige farmaceutiske præparater til mange forskellige anvendelser, fx behandling af en hvilken som helst af de ovennævnte tilstande der reagerer på vitamin 5 D, eller de kan bruges til behandling af en hvilken som helst af de tilstande der reagerer på 1a-hydroxyvitamin D, men som normalt er modstandsdygtige mod vitamin D, og navnlig kan de bruges til en langvarig behandling af sådanne sygdomme som osteoporose samt profylaktisk som vita-10 min og i multivitaminpræparater.

Oralt indgivelige præparater indeholdende det omhandlede 1α-hydroxyvitamin kan om ønsket indeholde en eller flere fysiologisk forenelige bærere og/eller excipi-enter, og præparaterne kan være faste eller flydende. Præ-15 paraterne kan have en hvilken som helst hensigtsmæssig form som fx tabletter, overtrukne tabletter, kapsler, pastiller, vandige eller olieagtige suspensioner, opløsninger, emulsioner, saft, eliksir eller tørre produkter egnede til rekonstitution med vand eller en anden egnet væske 20 før anvendelsen. Præparaterne oparbejdes fortrinsvis i dosisenhedsform således at hver dosis med fordel indeholder 0,2-20 pg, fortrinsvis 0,5-5 yg 1α-hydroxyvitamin . Den dosis af 1α-hydroxyvitamin , der bruges til behandling af voksne mennesker, vil typisk være i området 0,2-20 yg 25 om dagen. Tabletter og kapsler indeholdende 1a-hydroxyvitamin kan eventuelt indeholde konventionelle bestanddele såsom bindemidler, fx sirup, akaciegummi, gelatine, sorbitol, traganth eller polyvinylpyrrolidon; fyldstoffer som fx laktose, sukker, majsstivelse, kalciumfosfat, sorbitol 30 eller glycin; smøremidler som fx magniumstearat, talkum, polyætylenglykol eller kiselsyreanhydrid; sønderdelingsmidler som fx kartoffelstivelse; eller acceptable befugtnings-midler såsom natriumlaurylsulfat. Tabletter kan overtrækkes ved i og for sig velkendte metoder.

35 Flydende præparater af 1α-hydroxyvitamin kan in deholde konventionelle additiver såsom suspenderingsmid-

DK 158786B

9 ler, fx sorbitolsaft, metylcellulose, glukose/sukkersirup, gelatine, hydroxymetylcellulose, karboxymetylcellulose, aluminiumstearatgel eller hydrogenerede spiselige fedtstoffer, emulgeringsmidler som fx lecithin, sorbitanmono-5 oleat, akaciegummi; ikke-vandige bærestoffer som kan indbefatte spiselige olier som fx vegetabilske olier såsom jord-nøddeolie, mandelolie, fraktioneret kokosolie, fiskeleverolier, olieagtige estere såsom polysorbat 80, propylengly-kol eller ætylalkohol; og præserveringsmidler som fx metyl-10 eller propyl-p-hydroxybenzoat eller sorbinsyre. Flydende præparater kan hensigtsmæssigt indkapsles i fx gelatine for at give et produkt i dosisenhedsform.

Sådanne præparater kan indeholde andre terapeutisk nyttige bestanddele såsom kalciumsalte (fx laktatet, natri-15 umlaktat, fosfat, glukonat eller hypofosfit) og/eller salte af andre essentielle sporelementer såsom magnium, mangan, jern, kobber, zink og jod og/eller andre vitaminer såsan vitamin A, vitamin , vitamin B2, nikotinamid, pantothensyre eller salte deraf som fx kalciumsaltet, vitamin B^, vita-20 min B^j folinsyre, vitamin C og vitamin E. Multi-vitamin-præparater omfattende de hidtil ukendte 1oc-hydroxyforbin-delser kan oparbejdes på en måde, som er analog til den, der anvendes ved fremstilling af multivitaminpræparater, der indeholder konventionelle 1-hydrogenvitamin D-forbin-25 delser.

Aktiviteten af 1α-hydroxyvitamin gør det også velegnet til rektal indgift, og farmaceutiske præparater til dette formål, indeholder fx en effektiv dosis af 1a-hydroxyvitamin iblandet et konventionelt suppositorie-30 grundlag såsom kakaosmør eller et andet glycerid.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal i det følgende belyses ved nogle eksempler.

35 10

DK 158786B

Eksempel 1 Ια-Hydroxyvitamin A. Udgangsmateriale 5 a) Kolesta-1,4,6-trien-3-on 19,3 g kolesterol og 38 g diklordicyanoquinon i 500 ml tørt dioxan opvarmedes under tilbagesvaling i 22 timer. Derpå afkøledes blandingen, filtreredes og filtratet inddampedes til tørhed. Kromatografering af remanensen på alu-10 miniumoxyd og eluering med benzen/hexan efterfulgt af elue-ring med benzen gav trienonen som en lys olie i en mængde på 11,5 g, der størknede ved henstand. Materialets fysiske egenskaber stemte med den tilskrevne struktur.

15 b) 1α,2a-Epoxykolesta-4,6-dien-3-on 1 g af trienonen fra (a) i 50 ml ætanol behandledes ved 0°C med 0,25 ml 10%s vandigt natriumhydroxyd og 2,5 ml 30%s vandigt I^C^· Blandingen opbevaredes ved 5°C natten over og det resulterende epoxyd frafiltreredes, vaskedes 20 med vandig alkohol og tørredes, hvorved der fremkom 0,86 g af den i overskriften angivne forbindelse. Omkrystallisation fra ætanol gav farveløse nåle med smp. 107-109°C.

c) 1a,3g-Dihydroxykolest-5-en 25 Til en under omrøring værende opløsning af 0,2 g litiummetal i 80 ml flydende ammoniak og 50 ml tørt te-trahydrofuran indeholdende 0,5 g ammoniumklorid sattes der en deoxygeneret opløsning af 4,3 g af epoxydet fra (b) i 25 ml tørt tetrahydrofuran, idet tilsætningen skete 30 dråbevis. Da den blå farve var forsvundet, afbrødes tilsætningen af steroidet, og der tilsattes yderligere 0,2 g litium og 1 g ammoniumklorid, efterfulgt af yderligere tilsætning af epoxydopløsningen. Denne behandlingsfølge gentoges indtil hele mængden af steroidet var blevet til-35 sat. På dette punkt tilsattes der yderligere et stykke litium (0,2 g, i alt 0,8 g) efterfulgt af yderligere ammoniumklorid til en total mængde på 8,0 g. Man lod derefter

DK 158786 B

11 det meste af ammoniakken afdampe, og den tilbageværende blanding udhældtes i isvand og ekstraheredes med kloroform. Koncentrering af kloroformekstrakten gav en brun gummi som kromatograferedes på 160 g aluminiumoxyd. Eluering med 5 ætylacetat/benzen gav 1a,3j3-diolen som en glas, der hurtigt krystalliserede ved tilsætning af ætanol. Omkrystallisation fra vandig ætanol gav 1,7 g af den i overskriften angivne forbindelse, smeltepunkt 161,5-163°C.

Beregnet for C27H46°2: C ®^,54 H 11,52 10 Fundet: C 80,40 H 11,39% d) 1a-Hydroxykolesta-4,6-dien-3-on 130 mg af epoxydienonen fra afsnit b) i 10 ml ætanol behandledes med 1 g zinkstøv under omrøring, ef-15 terfulgt af tilsætning af 3 dråber eddikesyre. Derefter filtreredes blandingen og filtratet koncentredes til tørhed. Kromatografering på silikagel gav kolesta-1,4,6-trien-3-on (der kunne opsamles og recirkuleres), efterfulgt af den i overskriften angivne forbindelse med λ

1 ulclX

20 3600, 3400, 1675, 1625 og 1590 cm ; δ 6,15 (2 protoner, s, H6, H7), 5,73 (1 protonsinglet H4), δ 4,15 (1 proton, smal multiplet, H1).

e) 1a, 3j3-Dihydroxykolest-5-en 25 0,6 g af hydroxydienonen fra d) omdannedes til tri- metylsilylæteren deraf ved behandling af en opløsning i 2 ml tetrahydrofuran og 2 ml pyridin med 1,5 ml hexame-tyldisilazan og 0,6 ml trimetylklorsilan. Den rå trime-tylsilylæter opløstes i 10 ml tetrahydrofuran og opløs-30 ningen sattes dråbevis til en under omrøring værende opløsning af ca. 200 mg litiummetal i 20 ml flydende ammoniak. Efter nogle få minutter tilsattes der 2 g ammonium-klorid og opløsningen omrørtes. En yderligere portion litiummetal (omtrent 100 mg) tilsattes. På ny omrørtes 35 opløsningen. Derefter tilsattes der en yderligere portion ammoniumklorid og blandingen udhældtes i koldt vand. Produktet isoleredes ved ekstraktion med æter og metylen-

DK 158786 B

12 diklorid, efterfulgt af søjlekromatografi der gav den i overskriften angivne forbindelse som efter krystallisation fra ætanol havde smeltepunkt 158-161°C. Efter omkrystallisation var smeltepunktet 161,5-163°C. [a]D 5 (CHCl^) = -38°. Dette materiale var identisk med produktet fra eksempel 1 (c), og gav ved hydrogenering en prøve af 1g, 3/3-dihydroxy-5a-kolestan, der i enhver henseende var identisk med en autentisk prøve af dette stof.

10 f) 1a,3/3-Dibenzoyloxykolest-5-en 1,2 g 1a,3j3-dihydroxykolest-5-en behandledes i 10 ml pyridin indeholdende 20 mg dimetylaminopyridin med 5 ml benzoylklorid. Efter opbevaring natten over ved stuetemperatur udhældtes blandingen i vand og produktet ek-15 straheredes med æter og vaskedes med fortyndet vandig saltsyre, mættet bikarbonatopløsning og vand. Inddamp-ning af den æteriske portion gav 1,6 g af dibenzoatet med smeltepunkt 147-150°C. Efter omkrystallisation fra ætanol havde produktet smeltepunkt 151-153°C.[a]D = +24°.

20 Beregnet for C^H^O^: C 80,61 H 8,91

Fundet: C 80,43 H 8,74% g) 1a,3B-Dibenzoyloxykolesta-5,7-dien

En opløsning af 0,58 g af det under f) beskrevne 25 dibenzoat i 10 ml hexan behandledes med 0,15 g dibrom- dimetylhydantoin og opvarmedes under tilbagesvaling i 25 minutter. Efter afkøling filtreredes blandingen og filtratet koncentreredes til en lys olie. Denne olie opløstes i 3 ml tørt xylen og sattes dråbevis til en tilbage-30 svalingskogende opløsning af 0,4 ml trimetylfosfit i 5 ml xylen. Opvarmningen under tilbagevaling fortsattes i 1 3/4 time hvorefter opløsningsmidlerne fjernedes under nedsat tryk og remanensen krystalliseredes fra acetone/ metanol til den i overskriften angivne forbindelse. Ef-35 ter omkrystallisation fra ætanol/acetone havde produktet smeltepunktet 161-162°C, [cx]D = -8°.

13

DK 158786 B

Beregnet for C4iH52^4: C 80,88 H 8,61

Fundet: C 80,69 H 8,66% h) 1 g, 3<3-Dihydroxykolesta-5,7-dien 5 300 mg af dibenzoatet fra (g), opløst i 30 ml æta nol og 0,5 ml vand indeholdnde 0,6 mg KOH, opbevaredes ved 80°C under argon i \ time. Derefter afkøledes reaktionsblandingen og fortyndedes med vand og ekstraheredes med æter. Inddampning af den æteriske ekstrakt gav den i 10 overskriften angivne forbindelse som et krystallinsk fast stof. Omkrystallisation fra metanol gav et produkt med smeltepunkt 155-158°C, λ (ætanol) 263 (7700); 272 max (11000); 282 (11900); 295 (7000) nm.

15 B. Slutprodukt i) 1a-Hydroxyvitamin D, 95 mg af produktet fra h) i 200 ml deoxygeneret æter bestråledes i 12 minutter ved hjælp af en 200 watt Hanovia lampe omgivet af en filtreret opløsning af 24 20 ml toluen og 4 ml CS2 pr. liter metanol. Den kolde opløsning overførtes til en kolbe fyldt med argon og æteren fjernedes ved 0°C. Remanensen opløstes i 8 ml deoxygeneret absolut alkohol og opvarmedes under tilbagesvaling 25 i time. Biologisk bedømmelse udført på kyllinger med vitamin D-mangel viste at det 1g-hydroxy-vitamin D^, der var dannet (λ 264 (19000)) var karakteriseret ved en

ItlaX

meget hurtig indsætning af fysiologisk virkning (under 3 timer), hvilket tidligere kun var iagttaget for det 2Q naturlige produkt der forsøgsvis har været karakteriseret som 1g,25-dihydroxy-vitamin-D2.

35

DK 158786 B

14

Eksempel 2 1a-Hydroxyvitamin A. Fremstilling af udgangsmateriale ved bestråling af 5 1 g,3ø-diacetoxykolesta-5,7-dien___________________ 50 mg 1cx,30-diacetoxykolesta-5,7-dien, smp. 118-119°C, fremstillet ved omsætning af 1a,30-dihydroxykolesta- 5,7-dien med eddikesyreanhydrid under anvendelse af en lignende metode som beskrevet i eksempel 1 f) bestråles 10 i 11 minutter i 200 ml deoxygeneret æter. Blandingens ul-traviolette spektrum viste den ønskede forøgelse i absorptionen i området 220-268 nm og aftagen i området 268-295 nm. Blandingen var i det væsentlige homogen på silikagel (CHC1-.), men adskilte sig i to rene pletter på 1%s AgNO.,-

15 J J

silikagel-kloroform, idet den nedre plet svarede til udgangsmaterialet med hensyn til Rf. Det mindst polære materiale (ca. 20 mg) havde et bredt ultraviolet absorptionsbånd med et "fladt" maximum omkring 262-272 nm (lille pukkel ved 282 og 295 nm) og et minimum ved 234 nm. Dette ma- 20 teriale indeholdt råt prævitamin. En ringe mængde af denne blanding opløstes i hexan og det ultraviolette spektrum opnoteredes (anslået koncentration ca. 20 mg pr. liter).

Blandingen behandledes derefter med en opløsning af jod i hexan således at den samlede koncentration af jod var 25 ca. 0,4 mg. pr. liter, og det hele holdtes i diffust lys i 45 minutter. Hexanopløsningen vaskedes med tyndt vandigt tiosulfat og derefter med vand, den tørredes og det ultraviolette spektrum genopnoteredes. Det viste absorptionskarakteristikker for et tachysterol-derivat (maximum 30 ved 282 nm og skuldre ved 272 og 292 nm), og absorptionen var steget med en faktor på 2,2.

B. Slutprodukt, 1α-hydroxyvitamin D^ 35 Hele mængden af det rå prævitamin opløstes i 10 ml deoxygeneret iso-oktan. Absorptionen ved 262 nm var 0,39 når en 30 μΐ stor prøve fortyndedes til 3 ml. Derefter op-

DK 158786 B

15 varmedes opløsningen til ca. 75°C under argon i ialt 2 1/4 timer, i løbet af hvilken periode absorptionen ved 262-265 nm steg til et maximum på 0,54 (for en opløsning af samme koncentration som ovenfor). Som ventet steg absorp-5 tionen først hurtigt og derefter langsomt efterhånden som blandingen nærmede sig ligevægttilstanden. Behandling af en prøve med jod i hexan som beskrevet ovenfor viste absorptionskarakteristikken for tachysterol, men stigningen i absorptionen var kun fra 0,43 til 0,47. Blandingen i 10 ligevægt var i det væsentlige homogen både på silikagel og 1%s AgNO^-silikagel (fremkaldt i kloroform).

Ca. 12 mg af blandingen opløstes i 1,0 ml deoxygene-ret metanol og opløsningen behandledes med 0,5 ml deoxyge-neret 1,5%s metanolisk KOH og holdtes under argon ved stue-15 temperatur i 1 1/2 time. Fortynding med vand og ekstraktion med æter gav 1a,33-diolerne, der viste sig som to meget tætbeliggende hovedpletter på silikagel (fremkaldt med 4%s metanol-CHCl^)· Den mindst polære fraktion (ca. 5 mg) udviste bred absorption i ultraviolet med et maximum ved 20 264 nm og et minimum ved 228 nm. Dette var 1a-hydroxy- vitamin D^. Behandling af en prøve med jod i hexan som beskrevet ovenfor frembragte ændring i maximet til 270 nm, hvilket skyldtes omdannelse til 5,6-trans-vitamin.

Den mest polære fraktion havde et glat absorptions-25 bånd i det ultraviolette med maximum ved 260 nm og minimum ved 235 nm. Dette var prævitaminet. Behandling af dette med jod som ovenfor gav et komplekst UV-spektrum med maxima ved 268, 276, 286, 298, 312 og 327 nm.

30 Eksempel 3 1a-Hydroxyvitamin D^

Bestråling af 135 mg 1a,30-diacetoxykolesta-5,7-dien (fremstillet som i eksempel 2) i deoxygeneret æter 35 (200 ml) i 15 minutter og adskillelse af produkterne på 1% AgNO^-silikagel (CHCl^) (præparativ tyndtlagskromatogra-

DK 158786B

16 fi) gav 68 mg udgangsmateriale (mest polære fraktion) og det rå prævitamin (54 mgf mindst polære fraktion).

Det således vundne prævitamin opvarmedes ved 75°C

1 2 timer i deoxygeneret isooktan (15 ml) under argon.

5 Den resulterende blanding af vitamin og prævitamin opløstes i 4 ml metanol og opløsningen behandledes med 1 ml 2,5%s metanolisk KOH og holdtes ved stuetemperatur i 2 timer. Fortynding med vand og ekstraktion med æter gav vitamin- og prævitamindiolerne, som adskiltes på silika- 10 gel (præparativ tyndtlagskromatografi) (8% MeOH-CHCl^)» hvorved der vandtes 13 mg vitamin (R^ 0,35) og 8 mg prævitamin (R^ 0,31). Omkrystallisation af vitaminet fra æter-pentan gav fine farveløse nåle med smp. 132-133°C (opvarmningshastighed 1°C/4 sekunder), og smp. 128-129°C (opvarm-15 ningshastighed 1°C/25 sek.). UV-spektrum (æter) λ χ 264 nm (20200), λ . 229 nm (10800). Der er 9% usikkerhed i min . max ekstinktionsværdier, men forholdet ^-=— er 1,87 + 10%.

__o λ min „x [a]p (æter, c^0,3%) = +26° + 2°. Produktet [cx]D x ekstinktion ved 264 nm v 5,2 x 10^ + 10%. (CHCl^) 1 - max 3 20 3700, 3500, 1600-1650, 1040 cm" . NMR (dg-acetone) Hg+H^ AB kvartet ved δ 6,20 (tilsyneladende J=11,5 Hz). H^g, to smalle én-proton-multipletter ved 6 4,92 og δ 5,37 ppm.

11 mg af prævitaminet (λ max 260 nm, λ min 232 nm) fra to særskilte bestrålinger opløstes i 8 ml deoxygeneret 25 isooktan og opvarmedes til 75°C i 1 1/2 time. Isolering ved præparativ tic som foran gav yderligere 4,6 mg af vitaminet. Der indtrådte sønderdeling her, og der var praktisk talt ikke noget prævitamin tilbage. Analyse for 1a-hydroxy-vitamin D^: 30 Beregnet for C 80,9 H 11,07

Fundet: C 80,6 H 11,04% 35

Claims (4)

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af 1ct-hydroxy-vitamin med formlen ChJ ' OH ^h3 i L J__ J5I

10 HO χ eller diacetatet deraf, kendetegnet ved at man isomeriserer 1a-hydroxyprævitamin D3 med formlen 15 chJ CH^ OH -3 II 20 eller diacetatet deraf ved opvarmning til dannelse af den ønskede vitamin D^-forbindelse.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 25 ved at prævitamin D^-forbindelsen er 1a-hydroxyprævitamin D^-1 a, 3/3-diacetat.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at 1a-hydroxyvitamin udvindes i krystallinsk form.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at 1α-hydroxyprævitamin D^-forbindelsen isomeriseres ved opvarmning i et alkohol- eller kulbrinte-opløsningsmiddel . 35