DE60004007T2 - Ein Verfahren zur Isolierung 2-Deoxyecdysteron aus Zoanthus sp und ihre Verwendung zur Herstellung eines Medikaments zur Geburtseinleitung oder zum Schwangerschaftsabbruch - Google Patents

Description

• Bereich
• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von 2-Deoxyecdysteron aus Zoanthus sp., das als wehenanregendes Agens nützlich ist.
• Hintergrund
• Das Tier Zoanthus sp. ist ein mariner Invertebrat der zu Phylum Coelenterata, Klasse Anthozoa und Ordnung Zoanthidea gehört. Verschiedene biologische Verbindungen wurden aus dieser Quelle isoliert. Das wichtigste davon ist das hochtoxische Palytoxin (LD₅₀ bei Mäusen = 0,15 mg/kg, R. E. Moore und P. J. Scheuer, 1971, Science, 172: 495), dies ist ebenfalls ein wirksames cardiovaskuläres Agens. Andere Verbindungen, die aus dieser Tiergruppe beschrieben worden sind: Homopalytoxin, Bishomopalytoxin, Neopalytoxin, Deoxypalytoxin (Quinn R J in Bioorganic Marine Chemistry, Band 2, herausgegeben von Scheuer P J, Seiten 25–57), zwei Pyrazinderivate: Palythazin und Isopalythazin und eine Gruppe von Stickstoffpigmenten, Paragracin I–VII (Bakus G J, Targett M M und Schulte B, 1986, J. Chem. Ecol, Band 12: 951–987), 3-Norpseudozoanthoxanthin (Cimino G, De Stefano S, Fenical W, Lin G H Y, Wing R M, Radick P und Sima J J, Am Chem Soc, 1973, 95: 4049) neben den Alkaloiden, Zoanthamin, Zoanthenamin und Zoanthamid (C. B. Rao, A S R Anjaneyulu, N S Sarma, Y. Venkateswarlu, R. M. Rosser, D. J. Faulkner, 1985. J Org Chem, 50: 3757–3760).
• Ecdysone und Ecdysterone sind in Crustacean und Insekten Verpuppungshormone (D J Tighe-Ford, 1977 Hormonal aspects of Barnacle antiflouling research. In Marine Natural Products Chemistry, D J Faulkner und W H Fenical (Eds), Plenum Press, 383). Der Zoanthid Gerardia savaglia stellte sich als eine Quelle heraus, die große Mengen des Crustacen-Häutungshormons, Ecdysteron enthält (Sturaro A, Guerriero A, De Clauser R und Pietra F, Experientia, 1982, 38: 1184–1185). Die verwandten Verbindungen Palythoalon A und B (Ecdysteroide) aus dem marinen Zoanthid Palythoa australiae wurden vor kurzem isoliert. (Shigemori H; Sato Y; Kagata T; Robayashi J, 1999. Palythoalones A and B, new Ecdysteroide from the marine zoanthid Palythoa australiae. J. Nat. Prods, 62(2): 373).
• Die Verbindung 2-Deoxyecdysteron, ist auch bekannt als 2-Deoxy-β-ecdyson oder 2-Deoxy-20-hydroxyecdyson, sie stellte sich als wirksam bei der Induktion von Rontraktionen im Meerschweinchen-Uterus heraus. Es wurde gefunden, dass der Prozentsatz der wirksamen Komponente Oxytocin in 50 μg/ml der Verbindung 80,8% ausmacht, bei 100 μg/ml 92,3%, dieser nimmt weiter auf 118,0% bei Konzentrationen von 200 μg/ml zu. Durch diese Verbindung hervorgerufene Uterus-Kontraktionen wurden verglichen mit der Standardkontraktion durch Prostaglandin (PGF_2α). Es wurde für die wirksame Verbindung beobachtet, dass der Prozentsatz der wirksamen Komponente PGF_2α in 50 μg/ml der Verbindung 69,4% beträgt, bei 100 μg/ml 82,3%, dieser nahm weiter zu auf 114,1% bei einer Konzentration von 200 μg/ml. Eine mögliche Verwendung der Verbindung in der Geburtshilfe kann die Induktion oder das Steigern der Wehen sein, die Kontrolle von Gebärmuttererschlaffung und Blutung nach der Geburt, das Hervorrufen einer Uterus-Kontraktion nach Kaiserschnitt oder während einer Gebärmutter-Operation oder das Einleiten eines therapeutischen Schwangerschaftsabbruchs.
• Mittel, die den schwangeren Uterus stimulieren und bei der Geburtshilfe wichtig sind, sind:
  1-Oxytocics: Oxytocin und Ergometrin
  2. Prostaglandin E- und F-artige Verbindungen.
• Oxytocin verursacht normal-koordinierte Uterus-Kontraktionen, die jeweils von einer Relaxion gefolgt werden. Es ist das Arzneimittel der Wahl, um die Wehen einzuleiten oder zu erhöhen, wenn der Uterusmuskel nicht adäquat funktioniert (Rang H. P. Dale M. M; Ritter J. M., Pharmacology, 3. Auflage, Seite 470, Churchill Livingstone, 1995). Es wird insbesondere bei Fällen verwendet, wie Diabetes, Isoimmunisierung, Bluthochdruckzuständen, Intrauterin-Wachstumsrückstände, Placentainsuffizienz, bei der das Fortsetzen der Schwangerschaft als gefährlicher für die Mutter und/oder dem Foetus angesehen wird als das Risiko eines Austragens oder eines pharmakologischen Abborts (J. Andrew J. Nichols; Robert R Ruffolo, Jr., Uterine Pharmacology, in Principles of Pharmacology. Basic Concepts and clinical Applications. Ed. Paul L. Munson, Seite 202, 1995). Oxytocin kann auch zur Behandlung bei nachgeburtlichen Blutungen aufgrund der Uteruserschlaffung verwendet werden (Andrew J. Nichols; Robert R. Ruffolo, Jr., Uterine Pharmacology, in Principles of Pharmacology. Basic Concepts and Clinical Applications. Ed. Paul L. Munson. Seite 202, 1995). Historisch waren die Ergotalkaloide, die ersten Agentien, die verwendet wurden, um die Niederkunft einzuleiten. In moderner Geburtshilfe wird Oxytocin aufgrund dieser Eigenschaft verwendet und Ergotalkaloide werden häufig verwendet, um nachgeburtliche Blutungen zu behandeln (Cornelia R. Graves, Agents that cause contraction or relaxation of the uterus, in Goodman and Gilman's. The Pharmacological basis of therapeutics. Eds. Perry B. Molinoff und Raymond W. Ruddon, Seite 939, 1996). Spezifische Rezeptoren für Oxytocin im humanen Myometrum wurden identifiziert und Unterschiede in der Rezeptordichte in den verschiedenen Arbeitsphasen wurden ebenfalls gefunden (Bossmar T; Akerlund M; Fantoni G; Szamatowicz J; Melin P; und Maggi M.. Rezeptoren für und Myometrial responses to Oxytocin und Vasopressin in preterm and term human pregnancy: effects of the Oxytocin antagonist atosiban. Am. J. Obstet. Gynecol. 1994, 171: 1634–1642, 1994). Oxytocin hat duale Effekte auf den Uterus. Es reguliert die Kontraktionsmöglichkeiten der myometrialen Zellen und ruft eine Prostaglandin-Produktion durch die edometrialen/decidualen Zellen hervor.
• Prostaglandine, die zur Zeit in der Geburtshilfe verwendet werden, schließen PGE₂, PGF_2α und dem synthetischen Derivat 15-Methyl PGF_2α ein. Vor kurzem wurde das PGE₁-Analog, Misoprostol in klinischen Untersuchungen zur Verwendung als Abtreibungsmittel und zur Reifung des Gebärmutterhalses verwendet.
• Die Hauptverwendung von PGE₂ (Dinoproston, Prostin E₂) und 15-Methyl PGF_2α (Carboprost, Hemabat), wie sie derzeit in den USA anerkannt ist, ist die Durchführung einer Abtreibung in der mittleren Schwangerschaftsphase. 15-Methyl PGF_2α wird ebenfalls verwendet als Alternative zu Ergonovin oder Oxytocin in der Behandlung der nachgeburtlichen Blutungen. Weiterhin haben verschiedene Studien die vorteilhafte Wirkung von lokal verabreichtem PGE₂ als Gebärmutterhals-Reifungsmittel gestützt (Buchanam D; Macer J und Yonekura M. L., Cervical Ripening with Prostaglandin E₂ Vaginal Suppositories. Obstet. Gynecol. 1984, 63: 659–663).
• Prostaglandine E₂ und F_2α, wie sie derzeit für die klinischen Zwecke verwendet werden, sind nicht stabil. Bei radioaktiv markiertem PGE₂ wird z. B. etwa 50% der Radioaktivität innerhalb von 5 Stunden mit dem Urin ausgeschieden, wenn es humanen Freiwilligen injiziert wird. Der entsprechende Wert für PGF_2α ist ca. 90% (W P Collins; E A Willman, 1978. Prostaglandins and uterine functions, In Topics in hormone chemistry, W R Butt (eds), Ellis Horwood Publishers, 183).
• Dünnschicht-Chromatographie von Ecdysteroiden wurden in Journal of Chromatography, 1985, 318, 373–377 beschrieben. Während der Artikel die Auflösung einer Mischung von Ecdysteroiden durch Dünnschicht-Chromatographie beschreibt, beschreibt er nicht die Isolierung von 2-Deoxyecdysteron aus einer sehr komplexen Mischung von Komponenten aus Zoanthus sp. gemäß dem Vier-Schritt-Verfahren der vorliegenden Erfindung.
• Ein Artikel in Experienta, 1982, 38(10), 1184–5 beschreibt die Isolierung von Ecdysteron aus Zoanthid Gerardia savaglia unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC. Der Artikel legt nicht das Vier-Schritt-Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung vor, dies beinhaltet eine aufeinanderfolgende Flash-Chromatographie auf Silikagel, gefolgt von einer Gel-Permeations-Chromatographie.
• Der Abstract in Khim.-Farm. Zh., 1989, 23(4), 441–5 (Russian) bezieht sich auf die Anti-Ulcerus-Aktivität von Phytoecdysteroiden, wobei die Phytoecdysteroide auf ihre Anti-Ulcerus-Aktivität in verschiedenen Rattenmodellen von Magengeschwüren getestet wurde. Die stärkste Aktivität wurde mit Ecdysteron und Turkesteron beobachtet, beide führten zu einer Erhöhung des RNA- und DNA-Gehalts im Magengewebe. Strukturelle Aktivitäts-Beziehungen sind hierin diskutiert. Wenigstens 15 Verbindungen wurden identifiziert in beiden Studien bei Massen-Spektrometrie.
• Aufgaben
• Eine Aufgabe der vorliegenden Untersuchung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Isolierung von 2-Deoxyecdysteron aus Zoanthus sp..
• Eine weitere Aufgabe der Untersuchung ist das Herausfinden der unbekannten Eigenschaft der Verbindung 2-Deoxyecdysteron, isoliert und aufreinigt aus Zoanthus sp, in der Induktion der Uterus-Kontraktion.
• Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer stabilen bioaktiven Verbindung, die bei der Geburtshilfe nützlich sein kann, um die Wehen einzuleiten oder zu verstärken, um nachgeburtliche Uterus-Erschlaffung und Blutung zu kontrollieren, um Uterus-Kontraktion nach Kaiserschnitt oder während einer Uterus-Operation zu verursachen oder um einen therapeutischen Schwangerschafts-Abbruch zu induzieren.
• Ausführliche Beschreibung
• Die vorliegenden Untersuchungen, durchgeführt durch die Erfinder, führten zu der Entwicklung und Standardisierung eines einfachen Verfahrens zur Isolierung und Aufreinigung von 2-Deoxyecdysteron aus einer neuen Quelle, Zoanthus sp.
• Somit betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung von 2-Deoxyecdysteron aus Zoanthus sp., umfassend die aufeinanderfolgenden Schritte:
• (a) Herstellen eines Methanol-Rohextrakts aus Zoanthus sp.,
• (b) Unterwerfen des Methanol-Rohextrakts mindestens einer Fraktionierung mit mindestens einem organischen Lösungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Petrolether, Ethylacetat, Chloroform, n-Butanol und Mischungen davon, um mindestens eine aktive Lösungsmittelfraktion zu erhalten,
• (c) Unterwerfen der mindestens einen aktiven Lösungsmittelfraktion einer Flash-Chromatografie über Silicagel, um eine teilweise aufgereinigte aktive Subfraktion zu erhalten, und
• (d) Unterwerfen der aktiven Subfraktion, erhalten in Schritt (c), einer Gelpermeationschromatografie über Sephadex^® LH-20, um ein im wesentlichen reines Produkt, identifiziert als 2-Desoxyecdysteron, zu erhalten.
• Bevorzugte Ausführungsformen dieser Erfindung sind in den untergeordneten Ansprüchen aufgeführt, diese werden insgesamt mit Bezugnahme darauf hierin aufgenommen.
• In einer bevorzugten Ausführungsform stellt das erfindungsgemäße Verfahren eine Isolierung von 2-Deoxyecdysteron aus Zoanthus sp. unter Verwendung von Flash-Chromatographie über Silikagel und Gel-Permemtation-Chromatographie über Sephadex^® LH-20 bereit. Die Erfindung stellt diese Verbindung bereit, eine neue biomedizinische Verwendung davon ist die eines potenten wehenanregenden Agens. Die Erfindung hat begründet, dass diese Verbindung wirksamer ist als Standard-Oxytocin und PGF_2α bei einer Konzentration von 200 μg/ml. Die Verbindung 2-Deoxyecdysteron ist ebenfalls sehr stabil und in wässrigen Lösungsmitteln löslich und kann einen breiteren therapeutischen Anwendungsbereich aufweisen.
• Gemäß einer bestimmten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung von 2-Deoxyecdysteron aus Zoanthus sp. bereit, dieses Verfahren umfaßt die Schritte:
• (a) Herstellen eines Methanol-Rohextrakts aus Zoanthus sp., durch herkömmliche Verfahren,
• (b) Unterwerfen des Methanol-Rohextrakts mindestens einer Fraktionierung mit mindestens einem organischen Petrolether,Lösungsmittel, ausgewählt aus Ethylacetat, Chloroform, n-Butanol und Mischungen davon, um mindestens eine aktive Lösungsmittelfraktion zu erhalten,
• (c) Unterwerfen der mindestens einen aktiven Fraktion einer Flash-Chromatographie über Silicagel (Partikelgröße 125 bis 250 μm) (60 bis 120 mesh), mit einem Aceton-Petrolether-Gradienten (30 : 70 bis 100 : 0) als Eluent, um eine teilweise auf gereinigte aktive Subfraktion zu erhalten, und
• (d) Unterwerfen der aktiven Subfraktion, erhalten in Schritt (c), einer Gel-Permeations-Chromatografie über Sephadex^® LH-20, unter Verwendung von Aceton als Eluent, um die aktive reine Verbindung zu erhalten.
• In einer Ausführungsform wird die aktive reine Verbindung als 2-Deoxyecdysteron mit Hilfe seiner IR, ¹H-NMR, ¹³C-NMR und Massenspektrum-Daten identifiziert.
• In einer weiteren Ausführungsform ist die Verbindung 2-Deoxyecdysteron mit 80,8, 92,3 bzw. 118,0% bei Konzentrationen von 50, 100 bzw. 200 μg/ml im Vergleich zu Standard-Oxytocin aktiv.
• In einer weiteren Ausführungsform ist die Verbindung 2-Deoxyecdysteron mit 69,4, 82,3 bzw. 114,1% bei Konzentrationen von 50, 100 bzw. 200 μg/ml im Vergleich zum Standard PGF_2α aktiv.
• Die Verbindung kann die folgenden potentiellen Verwendungen in der Geburtshilfe aufzeigen, Induzieren oder Steigerung der Wehen, Kontrolle der nachgeburtlichen Uterus-Erschlaffung und Blutung, Hervorrufen der Uterus-Kontraktion nach Kaiserschnitt oder während einer Uterus-Operation oder zur Induktion von therapeutischem Schwangerschafts-Abbruch.
• Kurze Beschreibung der beigefügten Abbildungen
• In den der Beschreibung beigefügten Abbildungen stellt die 1 die Bioassay-geführte Fraktionierung gefolgt von der Aufreinigung der Verbindung 2-Deoxyecdysteron aus der rohen Chloroform-Fraktion des Methanol-Extrakts von Zoanthus sp. dar.
• In der 2 wird das IR-Spektrum des weißen Festoffs isoliert aus der Chloroform-Fraktion von Zoanthus sp. dargestellt.
• In der 3 wird ¹H-NMR-Spektrum der Verbindung dargestellt, dies zeigt, dass dessen Struktur ein Polyhydroxystyrol-Derivat ist.
• in der 4 ist das ¹³C-NMR-Spektrum der Verbindung dargestellt, dies zeigt, dass dessen Struktur 2-Deoxyecdysteron ist.
• In der 5 wird die Struktur der aufgereinigten Verbindung, 2-Deoxyecdysteron, dargestellt.
• In der 6 wird das Kymograph gezeigt, erhalten während des Testens der Verbindung auf dessen Wehen einleitende Eigenschaft an isolierter Meerschweinchen-Gebärmutter.
• Die Erfindung wird mit Hilfe der folgenden Beispiele weiter erklärt, die Erfindung ist aber nicht darauf beschränkt.
• Beispiel I
• Zoanthus sp, gesammelt vom Anjucha-Strand (Goa) wurde für diese Erfindung verwendet. Die Tiere wurden vorsichtig von den Felsen in der Gezeitenzone, während der Ebbe unter Verwendung eines Metallspatels abgekratzt. Etwa 2 kg Nassgewicht der Proben wurden für diese Studie verwendet. Die Proben wurden kräftig mit frischem Seewasser gewaschen und in Methanol für eine Woche getaucht, um ein Rohextrakt-Präparat zu erhalten. Die Extrakte wurden aus dem Gesamt-Körpergewebe erhalten. Der Lösungsmittel-Extrakt wurde dekantiert, durch Whatman Filterpapier I filtriert und bei 40°C vakuumevaporiert, um den Rohextrakt zu konzentrieren. Ca. 30 g des Rohextrakts wurden so erhalten. Dieses Beispiel zeigt die Methode, wie sie zur Präparation des Roh-Methanol-Extrakts aus Zoanthus sp. verwendet wird.
• Beispiel II
• Ein weibliches jungfräuliches Meerschweinchen, das seinen Zyklus hatte und ca. 400 bis 500 g wog, wurde für diesen Test verwendet. Das Tier wurde durch einen betäubenden Schlag auf den Kopf getötet. Der Bauchraum wurde sofort geöffnet. Die Uterus wurde herausgeschnitten und in eine Petri-Schale, enthaltend mit Luft versetzte De Jalon's Lösung, placiert (M. N Ghosh, in fundamentals of Experimental Pharmacology, 1984, 2. Auflage, Scientific book agency, Calcutta). Die Uterus wurde von Fett befreit und die zwei Uterus-Hörner wurden durch Durchschneiden des unteren Endes abgetrennt. Nur ein Horn wurde für dieses Experiment verwendet. Zwei schmale Schlaufen eines Fadens wurden an jedem Ende der Uterus gemacht und dieser wurde in einem Gewebebad mit 10 ml Kapazität, enthaltend mit Luft versetzte De Jalon's Lösung aufbewahrt. Das untere Ende wurde an dem Gewebehalter festgemacht und das obere Ende am Schreibhebel. Der Hebel wurde so ausbalanciert, dass er einen Zug von 1 g mit Plasticen hatte. Das Gewebe wurde in dem Bad für eine halbe Stunde zur Stabilisierung belassen, bevor das Experiment begonnen wurde und die physiologische Lösung (De Jalon's-Lösung) wurde alle 10 Minuten erneuert. Dieses Beispiel stellt das Verfahren dar, das zur Präparation der Meerschweinchen-Uterus zum Testen der Wehen einleitenden Eigenschaft des reinen weißen Feststoffs, 2-Deoxyecdysteron, verwendet wurde.
• Beispiel III
• Nach Stabilisierung wurden 2 bis 3 Dosen Oxytocin (Parke Davis Ltd., Hyderabad) als Standard zu der physiologischen Lösung hinzugegeben, die Dosis hing von der Amplitude der Kontraktion ab, um einheitliche Kontraktionen zu erhalten. Der Extrakt wurde dann zu dem Bad gegeben (50 und 250 μg/ml) und konnte für eine Minute wirken. Wenn eine Kontraktion während dieser einminütigen Phase beobachtet wurde, wurde der Extrakt als ein Oxytocin-artiger, mit einer Wehen einleitenden Eigenschaft angesehen. Nach jeder Kontraktion wurde das Gewebe sofort zweimal mit physiologischer Lösung gewaschen und für 10 Minuten entspannt. Das gleiche Verfahren wurde bei dem Rohextrakt, den Fraktionen und dem aufgereinigten weißen Feststoff, identifiziert als 2-Deoxyecdysteron, durchgeführt.
• Die Wehen einleitende Aktivität des Rohextrakts, der Fraktionen und der reinen Verbindung wurde an der Meerschweinchen-Uterus aufgrund deren Fähigkeit, die entspannte Uterus zu kontrahieren, getestet. Das Gewebe wurde mit einem Standard-Wehen-Mittel, das eine Kontraktion des Gewebes hervorruft, beimpft. Die Wirksamkeit des zu testenden Agens wurde gemessen als dessen Fähigkeit, die Uterus zu kontrahieren durch Vergleich der Höhe der Kontraktion mit Standard-Oxytoxin (Tabelle 1). Dieses Beispiel zeigt das Verfahren, das zum Testen des Rohextrakts und den sich anschließenden Präparaten, durchgeführt wurde. Tabelle 1 Wehen einleitende Aktivität des Methanol-Extrakts gegenüber Standard-Oxytocin

  
• Beispiel IV
• Der Rohextrakt wurde in verschiedene Fraktionen mit Hilfe von Lösungsmitteln zur Erhöhung der Polarität fraktioniert, wie Petrolether, Chloroform, n-Butanol und der wässrigen Fraktion des Rests. Alle vier Fraktionen wurden wieder dem Aktivitätstest unterworfen. Obwohl die ersten drei Fraktionen sich als wirksam herausstellten, wurde bei der 50 als auch bei der 250 μg/l Konzentration (Tabelle 2) die Chloroform-Fraktion für die anschließenden Studien ausgewählt. Dieses Beispiel zeigt den Aktivitätstest mit allen vier Fraktionen des Roh-Methanol-Extrakts. Tabelle 2 Wehen einleitende Aktivität der Fraktionen gegenüber Standard-Oxytocin (%)

  
• Beispiel V
• Die obige Chloroform-Fraktion wurde durch Chromatographie über Silikagel (Partikelgröße 125 bis 250 μm (60 bis 120 mesh), Aceton-Hexan-Gradienten-System) und Sephadex^® LH-20 (Acetoneluent) Säulen aufgereinigt.
• Dies führte zu der Isolierung der wirksamen Verbindung als weißen Feststoff in reiner Form (50 mg, 1), [α]_D ²⁵ = 75,11, c = 1,2, MeOH. Die Verbindung hatte einen Rf-Wert von 0,72 in der TLC-Analyse (SiO₂, mobile Phase 50% Aceton: Petrolether). Das IR-Spektrum zeigte Peaks bei 3350, 2933, 2874, 1649 und 1447 (2). FABMS zeigte ein molekulares Gewicht dieser Verbindung von 464. Die Fragment-Ionen bei m/z 447(M + H – H₂O)⁺, 429(M + H – 2H₂O)⁺, 411(M + H – 3H₂O) waren indikativ für den aufeinanderfolgenden Verlust von Wasserelementen. HRMS zeigte, dass die molekulare Formel C₂₇H₄₄O₆ ist (beobachtet m/z 465,3229 gegenüber dem berechneten Wert von 465,3216 für das [M + H]⁺ – Ion). Der Vergleich der ¹H und ¹³C NMR-Werte (3 und 4) der Verbindung mit denen von Ecdyson, Ecdysteron und verwandten Verbindungen zeigte, dass dessen Struktur 2-Deoxyecdysteron ist (5) (Galbraith M N. Horn D H S. Middleton E J und Hackney R J. Structure of Deoxy ecdysterone, a second crustacean moulting hormone, Chem commun. 83, 1968, Chong Y. R., Galbraith M N und Horn D H S, Isolation of Deoxycrustecdysone, Deoxyecdysone and α-Ecdysone from the fern Blechnum minus, Chem comm. 1217, 1970). Es wurde gefunden, daß der Prozentsatz an aktiver Komponente Oxytocin enthaltenden 50 μg/ml der Verbindung 80,8% ausmachte, bei 100 μg/ml 92,3%, dies nahm weiter auf 118,0% bei einer Konzentration von 200 μg/ml zu (6, Tabelle 3). Die Uterus-Kontraktionen, hervorgerufen durch diese Verbindung, wurden verglichen mit der Standard-Kontraktion, hervorgerufen durch Prostaglandin (PGF_2α). Es stellte sich für die wirksame Verbindung heraus, dass der Prozentsatz an aktiver Komponente PGF_2α enthalten in 50 μg/ml der Verbindung 69,4% ausmachte, bei 100 μg/ml 82,3%, dies nahm weiter auf 114,1% bei einer Konzentration von 200 μg/ml zu (6 und Tabelle 3).
• Diese Beispiele zeigen die Aufreinigung, Identifizierung und die Wehen einleitende Aktivität beim Test der Verbindung 2-Deoxyecdystyron auf. Tabelle 3 Antwort von 2-Deoxyecdysteron im Vergleich zu Oxytocin und OGF_2α

  

Claims (6)

1. Verfahren zur Isolierung von 2-Desoxyecdysteron aus Zoanthus sp., umfassend die aufeinanderfolgenden Schritte: (a) Herstellen eines Methanol-Rohextrakts aus Zoanthus sp., (b) Unterwerfen des Methanol-Rohextrakts mindestens einer Fraktionierung mit mindestens einem organischen Lösungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Petrolether, Ethylacetat, Chloroform, n-Butanol und Mischungen davon, um mindestens eine aktive Lösungsmittelfraktion zu erhalten, (c) Unterwerfen der mindestens einen aktiven Lösungsmittelfraktion einer Flash-Chromatografie über Silicagel, um eine teilweise auf gereinigte aktive Subfraktion zu erhalten, und (d) Unterwerfen der aktiven Subfraktion, erhalten in Schritt (c), einer Gelpermeationschromatografie über Sephadex^® LH-20, um ein im wesentlichen reines Produkt, identifiziert als 2-Desoxyecdysteron, zu erhalten.
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei die Flash-Chromatografie über Silicagel (Partikelgrösse: 125 bis 250 μm) (60 bis 120 Mesh) durchgeführt wird unter Verwendung eines Aceton-Petrolethergradienten (30 : 70 bis 100 : 0 V/V) als Eluent.
3. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, wobei der in der Gelpermeationschromatografie mit Sephadex^® LH-20 verwendete Eluent Aceton ist.
4. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die wirksame reine Verbindung identifiziert ist als 2-Desoxyecdysteron über die IR-, ¹H-NMR-, ¹³C-NMR- und Massenspektraldaten.
5. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei ein jeder Petroletherextrakt, Chloroformextrakt oder n-Butanolextrakt verarbeitet wird, um eine im wesentlichen reine Verbindung, identifiziert als 2-Desoxyecdysteron, zu erhalten.
6. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei sich die Verbindung 2-Desoxyecdysteron als aktiv mit 80,9, 92,3 bzw. 118,0%, bei Konzentrationen von 50, 100 bzw. 200 μg/ml in einer wässrigen Lösung, im Vergleich zu Standard-Oxytocin herausstellte; oder sich als aktiv mit 69,4, 82,3 bzw. 114,1% bei Konzentrationen von 50, 100 bzw. 200 μg/ml in einer wässrigen Lösung, im Vergleich zum Standard-PGF_2α, herausstellte.