DE2323216A1

DE2323216A1 - Verfahren zur auftrennung von stereoisomerengemischen von steroiden

Info

Publication number: DE2323216A1
Application number: DE2323216A
Authority: DE
Inventors: Ralph Lennart Brattsand; Karl Goeran Claeson; Bo Th Son Af Dr Phil Ekenstam; Bror Arne Thalen
Original assignee: Bofors AB
Current assignee: Saab Bofors AB
Priority date: 1972-05-19
Filing date: 1973-05-09
Publication date: 1973-11-29
Also published as: FI50711B; GB1428416A; FI50711C; SE378110B; DK133249B; US3928326A; FR2185406A1; JPS547794B2; AU5525273A; NL175917C; KE2969A; HK49079A; JPS4941379A; NL175917B; DE2323216C3; DK133249C; IL42154A0; NL7306979A; SU468408A3; CY1012A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auftrennung eines Stereoisomerengemisches bestimmter Steroide, die man durch Synthese erhalten hat, in ihre Komponenten, die nachfolgend als Komponente A und Komponente B bezeichnet werden. Auch betrifft die Erfindung die stereoisomeren Komponenten A und B, die man dabei erhält.

Es ist eine bekannte Tatsache, daß Gemische von Stereoisomeren mit dem gleichen Molekulargewicht und in anderer Hinsicht mit praktisch identischen Löslichkeitseigenschaften extrem schwer aufzutrennen sind. Es ist daher äußerst überraschend, daß es nach der vorliegenden Erfindung möglich ist, die stereoisomeren

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Komponenten durch Gelfiltration zu trennen. Die Gelfiltrationsmethode wird normalerweise angewendet, um Moleküle mit einem niedrigeren Molekulargewicht von Molekülen mit einem höheren Molekulargewicht zu trennen. Von Stereoisomeren, deren Moleküle das gleiche Molekulargewicht besitzen, mußte man daher erwarten, daß sie bei der Gelfiltration das gleiche Zurückhaltevolumen haben würden, so daß sie im Hinblick darauf nicht nach diesem Verfahren trennbar sein würden. Daher war es äußerst überraschend, daß die stereoisomeren Komponenten A und B, die das gleiche Molekulargewicht besitzen, mit ausgezeichnetem Ergebnis unter Verwendung dieses Verfahrens getrennt werden können.

Das Trennverfahren nach der vorliegenden Erfindung machte es möglich, die physiologischen Eigenschaften der getrennten stereoisomeren Komponenten zu untersuchen. In dieser Verbindung fand man überraschenderweise, daß eine der stereoisomeren Komponenten, die Komponente B, physiologisch bessere Eigenschaften als die andere stereoisomere Komponente, die Komponente A, besitzt und daß sie in dieser Beziehung auch besser als das ursprüngliche Gemisch ist. Somit ist es nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung möglich, in einer reinen Form neue stereoisomere Komponenten herzustellen, die bestimmte Vorteile gegenüber den ursprünglichen synthetischen Stereoisomerengemischen besitzen.

Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung Steroide der allgemeinen Formel

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-OwH

worin die 1,2- und 4,5-Stellungen gesättigt sind oder in wenigstens einer dieser beiden Positionen sich eine Doppelbindung befindet, R eine geradkettige oder verzvreigtkettige Älkylgruppe niit 1 bis 10, vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, X, ein- Wasserstoffatom oder Fluoratom bedeutet, wenn X2 ein Wasserstoff atom ist, und X, ein Fluoratom bedeutet, wenn X, ein Fluoratoiti ist, und 2 eine gegebenenfalls veresterte Hydroxylgruppe bedeutet. Die einzelnen stereoisomeren Komponenten in einen Geir.isch eines Steroids der obigen Formel I können auf folgende *>7eise wiedergegeben werden:

HO

CH₂-Z C=O

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ΡΙΟ

In den obigen Formeln unterschieden sich die stereoisomaren Komponenten voneinander bezüglich der Raumorientierung um das 2'-Kohlenstoffatom in dem Dioxolanring.

Wie eingangs erwähnt wurde, besteht das Verfahren nach der Erfindung darin, ein Stereoisomerengemisch oder ein Stereoisomerenpaar von Steroiden der obigen Formel I der Gelfiltration zu unterziehen, wobei die stereoisomeren Komponenten A und B im Hinblick auf ihre unterschiedlichen Zurückhaltevolumina voneinander getrennt und getrennt gewonnen werden. Die Gelfiltration kann auf zahlreichen unterschiedlichen Typen von Gelmaterialien durchgeführt werden. Eine Type solcher Materialien sind hydroxynropylierte vernetzte Dextrangele des Tyras Sephadex^ LH, wie beispielsweise Sephadex^ LH 20, die von der Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden vertrieben werden und zu einer guten Fraktionierung innerhalb des Molekulargewichtsbereiches 100 bis 4000 führen. Eine andere brauchbare Geltype besteht aus Mischpolymeren von Vinylacetat mit solchen Trenngrenzen, wie sie brauchbar im Molekulargewichtsbereich zu etwa 1000 sind. Ein solches Vinylacetatgel, das in diesem Zusammenhang brauchbar ist,

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ist MerckogerS/ Typ OR PVA 2000 der E. Merck AG, Darmstadt, Westdeutschland. Das Gelmaterial wird im Gleichgewicht mit einem geeigneten Lösungsmittel verwendet. Als ein Eluiermittel können halogenierte Kohlenwasserstoffe, Sther oder Ester oder Gemische hiervon verwendet werden, und es wurden Chloroform, Methylenchlorid, ftthylenchlorid. Tetrahydrofuran, Dioxan und Äthylacetat erfolgreich benutzt. Dabei erhält man eine ausgezeichnete Trennung des Stereoisomers A von dem Stereoisomer B, und das Stereoisomerengemisch A, B kann natürlich auch in ausgezeichneter Weise von Nebenprodukten entfernt werden, die sich bei der Steroidsynthese gebildet haben.

In der obigen Formel I kann die Hydroxylgruppe in der 21-Stellung mit einer Fettsäure verestert werden. Eine solche Fettsäure kann eine geradkettige oder verzweigtkettige Kohlenwasserstoffkette haben und vorzugsweise 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten. Beispielsweise können als geeignete Säuren Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Valeriansäure, Isovaleriansäure, Trimethylessigsäure, Hexansäure, Tertiärbutylessigsäure oder Octansäure verwendet werden. Die Hydroxylgruppe kann auch mit einer heterozyklischen Carbonsäure verestert werden, wie beispielsweise mit Pyridin-3-, Pyridin-4- oder Benzofuran-2-carbonsäure oder mit Menthoxymethy!carbonsäure. Zur Herstellung wasserlöslicher Derivate kann die Veresterung mit Dicarbonsäuren mit vorzugsweise 2 bis 12 Kohlenstoffatomen oder mit Phosphorsäure oder Schwefelsäure durchgeführt werden.

Die Steroide I in der Form zyklischer Acetale können in an sich bekannter Weise synthetisiert werden, indem man von den 16d,

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17A-Dihydrqxysteroiden und einem Aldehyd in Gegenwart eines Säurekatalysators, wie beispielsweise Perchlorsäure, p-Toluolsulfonsäure, Chlorwasserstoffsäure usw., in Dioxan oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel ausgeht. Die Reaktion führt zu einem Gemisch von Stereoisomeren A und B mit dem gleichen Molekulargewicht und praktisch identischen Löslichkeitseigenschaften, und die Stereoisomeren erwiesen sich als extrem schwierig nach herkömmlichen Methoden zur Trennung von Stereoisomeren, wie beispielsweise durch Umkristallisation,zu trennen.

Die Erfindung wird nunmehr anhand von Beispielen v/eiter erläutert. In den Beispielen wird für die Chromatographie eine Säule mit einer Länge von 85 cm und einem Innendurchmesser von 2,5 cm verwendet, wobei die Fließgeschwindigkeit 1 ml/f5in. beträgt. Die Zurückhaltevolumina, die in den Beispielen angegeben sind, beziehen sich auf Chloroform als Eluiermittel.

Bei der Gelfiltration auf der Säule wurde gezeigt, daß es leichter ist, die Nebenprodukte von dem Isomerengeraisch in dem Rohprodukt als die Isomeren voneinander zu trennen, da die ersteren größere Unterschiede hinsichtlich der Zurückhaltevolumina als letztere besitzen. Es zeigt sich auch, daß die Löslichkeit des Rohproduktes sowie die Löslichkeit des gereinigten Isomerengemisches mit abnehmender Po-larität der verwendeten Lösungsmittel abnimmt, während der Trennungsgrad gleichzeitig steigt. Dies trifft besonders für die Derivate zu, die mit einer kürzeren Seitenkette an dem 2'-Kohlenstoffatom des Dioxolanringes substituiert sind. In der chromatographischen Trennung der nachfolgenden Beispiele wurde es daher als vorteilhaft herausgestellt,

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zunächst das Isomerengemisch von den Nebenprodukten des Rohproduktes ir.it Hilfe eines etwas polareren Lösungsmittels zu trennen und sodann die Isomeren voneinander mit Hilfe eines Lösungsmittels mit geringerer Polarität zu trennen. Dies führt zu verschiedenen Vorteilen. Erstens kann die gesamte Kapazität der Säule benutzt werden, und große Mengen von Rohprodukt können bei jeder Aufbringung von Nebenprodukten befreit werden. Zweitens kann eine mögliche Teilverwendung der Säulenkapazität, die aus den Begrenzungen der Löslichkeit des Isomerengemisches mit Lösungsmittels mit einer niedrigeren Polarität resultiert, kompensiert werden, indem man neue Testaufbringungen auf die Säule in relativ kurzen Zeitabständen bei Tag und Nacht macht, ohne zu warten, bis die vorausgehende Aufbringung die Säule verlassen hat. Die Lösungsmittel, die sich als hoch aktiv bei der Vortrennung erwiesen, wie Methylenchlorid, Äthylenchlorid, Tetrahydrofuran und Kthylacetat, ergaben auch eine vollständig zufriedenstellende Isomerentrennung, während Chloroform und Dioxan ein besseres Ergebnis bezüglich der am schwierigsten zu trennenden Isomeren ergaben.

In allen Beispielen wurden die Molekulargewichte durch Massenspektroskopie bestimmt, und bei allen NMR-Bestimmungen wurde Tetramethylsilan als innere Bezugssubstanz verwendet. Alle Schmelzpunkte wurden mit Hilfe eines Reichert-Schmelzpunktmikroskopes bestimmt.

Beispiel 1

1 €. 4., 17d- (2 ' -Wasser stoff-2 ' -methyl) -methylendioxy-9-f luorpregna-l,4-dien-llß, 21-diol-3,20-dion

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Zu einer Lösung von 112,0 mg frisch destillierten Paraldehyds · und 0,2 ml 72 %-iger Perchlorsäure in 75 ml gut gereinigtem und getrocknetem Dioxan wurden 500,0 mg Triamcinolon in Portionen während 40 Minuten zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 5,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann mit 200 ml Methylenchlorid verdünnt. Die Lösung wurde zweimal mit einer 15 %-igen Natriumbicarbonatlösung und dreimal mit Wasser gewaschen und getrocknet. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum verdampft,.und der Rückstand wurde in Äther aufgenommen und mit Petroläther ausgefällt. Das getrocknete Rohprodukt (533,0 mg) wurde auf einer Säule chromatographiert, die mit hydroxypropyliertem vernetztem Dextrangel (Sephadejc—' LH-20, Molekulargewichtsbereich 100 bis 4000; Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) gepackt war, wobei als Eluiermittel Methylenchlorid verwendet wurde. Dies führte zu 431,7 mg (81 %) reinen Isomerengemisches mit den folgenden Eigenschaften: Schmelzpunkt etwa 207 bis 222° C; /j&j ²⁵ _D =+107,2° (c = 0,3 in CH₂Cl₂) , Molekulargewicht= 420 (theoretisch 420,5).

Das Isomerengemisch (338,2 mg) wurde erneut auf einer Säule chromatographiert, die mit Sephadex^ LH 20 gepackt war, wobei als Eluiermittel Chloroform verwendet wurde. Es wurden zwei verschiedene Isomere A und B von 16<A, 17d>-(2'-Wasserstoff-2'-methyl)-methylendioxy-9-fluorpregna-1,4-dien-llß-diol-3,20-dion in den folgenden Ausbeuten und mit den folgenden Eigenschaften erhalten: A: 123,4 mg (37 %); F. « 217 bis 219° C; ^oL/²⁵ _β +87,5° (c = 0,3 in CH₂Cl₂); Molekulargewicht - 420 ~ (theoretisch 420,5); Zurückhaltevolumen 920 bis 990 ml. B: 194,7 mg (58 %) ; F. - 224 bis 228° C; /"«1/²⁵ _D - +120,8° (c -

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0,3 in CH₂Cl₂); Molekulargewicht = 420 (theoretisch 420,5);
Zuruckhaltevolumen 1O2O bis 1100 ml. Die Isomerenreinheit
(>98 %) von A und B wurde durch NMR-Spektroskopie bestimit\t, indem das Signal für I8-CH3 bei 6 = 1,00 ppm (CDCl₃) für A und bei £ = 0,92 ppm (CDCl₃) für B studiert wurde.

Ähnliche Trennergebnisse erhielt man bei Verwendung eines Gels von Mischpolymeren von Vinylacetat (MerckogeJS^OR-PVA 2OOO mit einem Molekulargewichtsbereich bis zu 1000; E. Merck AG, Darmstadt, Westdeutschland) sowie unter Verwendung von Äthylenchlorid, Äthylacetat, Tetrahydrofuran und Dioxan außer Chloroform
und Methylenchlorid als Eluiermittel der beiden Typen von Gelmaterialien.

Beispiele 2 bis 15

Analog dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden unterschiedliche Isomerengemische hergestellt, wobei die in der Tabelle I aufgeführten Isomeren mit Hilfe der Trennung nach Beispiel 1 erhalten wurden. Die NMR-Untersuchungen wurden in
CDCl₃ durchgeführt, wenn nichts anderes ausdrücklich angegeben ist.

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Tabelle I

4

16<*,17<*-Deri vat

mit

n-Caproaldehyd

•Isomer'

A

(c=0.2 in .

Mp

gef.

her.

18-CH-.

99",

Zurückhalte·
volumen (m|

von

Propionaldehyd

' · \ ;

B ■

CH₂CIg) ' .

ψ.

" 4J4.iT"

B (ppm)

933

Beg

5

Triamcinolon

n-Caprylaldehyd

A

+ b5.1° "

448

' 448.5

00

'■" ti4o-bi!)2

^SP<\|

n-Butyraldehyd

B ' .

+112.7°

(^UC) Molekulargewicht

Il

Ö".

93

924-990"

β

1!

n-Decylalclehyd

A ·■

+77.5° ,

462 '

462.6

0.

99

'822-876

cn

n-Valeraldehyd

B

+105.5 .

£64-7 ■.

It

1.

93

• 912-984

7

Il

A

+ 73.7°

189-92

476

476,6

0.

00

780-801

n-Caproaldehyd

B ·.

+ 93.6°·

150-5

Il

0.

93

864-924

O

ti

A

+ 70.1° .

147-50

532

552.7

0.

⁹?

702-738

n-Decylaldehyd

B '

+ 97.9° ,

123-7

It

■438.5

1.

768-828 ■

9

. A

+ 63.6°

102-6

438

ti

0.

88¹I

540-85

Acetaldehyd

B

+ 91.3

172-9

It

466.5

0.

,83¹^

595-648

10·'

Fluocinolon

A '

+ 71.1°

I80-5

466

11

0.

■ 98

1200-1250

n-Butyraldehyd

B

+110.8°

I61-4

Il

494.6

0.

.93

1260-1350

11

ti

A

+ 69.0°

147-52

494

It

Q·.

.98

1130-1.190

n-Caproaldehyd

B

+ 94.5

232-5

Il

522.6

0.

■ 92

1225-1320

!I

A

+ 65.9° ■

224-7

522

Il

0.

.98

870-930'

n-Caprylaldehyd

B

+ 92.7°

196-200

Il

404.5

0.

.93

960-1015 ,

:i

A

+ 61,0°

169-72

404

0.

.98

735-765 *

12

Acetaldehyd

+ 88.2°

2.43-7

0,

790-850 _t

llß,160\,17<rf,

+144.8°.

I67-70

0,

396-414

13

21-Tetrahy-

<

I66-9 ·

ti

0,

droxy-4-

B

124-7

' It

430.5

.91

14

precnen-

A

177-85 '

430

It

• 99

3,20-dion

Prednacinolon n-Butyraldehyd

B

+164.6°·

Il

458.6

• 93

432-453

15

A

+85.6° ·

458

Il

0

.-99

450-63

•i

B

+105.3 ' .

It

486.7

0

•93

510-20

A

M?*⁹o

202-10 ■

486

.ti .

0

• 99

414-32 K

!I

B

+104.5

• 225-28

ti

514.7

0

.93

462-98 ,f3

Λ

+ 67.6⁰

259-6Ο

514

It

0

• 99

355-"56¹S^ω

1

B

+ 96.3°

I98-2OI

·· 0

• 93

- 385-400^

+ 66.0°

I67-7I

0

+ 93.2° .

I69-73

0

36^!j-^v;vV'^

143-46

0

157-66

1^1-7

- 11 -

Beispiel 16

Auftrennung von 16rt, 17Λ-(2'-Wasserstoff-2'-methyl)-methylendioxy-llß-hydroxy-2l-(benzofuran-2-carbonyloxy)-9-fluorprena-1,4-dien-3,20-dion in Isomere

Eine Lösung von 60 mg reinem Isomerengemisch von Ι6<λ, ΐ7(λ-(2'-Wasserstoff-2'-methyl)-methylendioxy-9-fluorpregna-1,4-dien-ll<A, 21-diol-3,20-dion in 2 ml trockenem Pyridin wurde zu 72,2 mg Benzofuran-2-carbonsäurechlorid, gelöst in 1 ml trockenem Dioxan, zugesetzt. Das Reaktionsgemisch ließ man unter Rühren bei Raumtemperatur über Nacht stehen, der größere Teil der Lösungsmittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand in 30 ml einer 3 %-igen Ammoniumchloridlösung gegossen. Der erhaltene Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und in 1OO ml Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung wurde einmal mit 5 %-iger Natriumcarbonatlösung und dreimal mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde auf Sephadex^ LH-20 unter Verwendung von Chloroform als Eluiermittel chromatographiert. Die beiden Isomeren A und B von 164, I7ti-(2'-Wasserstoff-2'-methyl)-methylendioxy-llß- ■ hydroxy-21-(benzofurän-2-carbonyloxy)-9-fluorpregna-1_r4-dien-3,20-dion wurden in den folgenden Ausbeuten und mit den folgenden Eigenschaften erhalten: A: 28,1 mg (35 %); F. = 250 bis 256° C; Z<*7²⁵ _D » +158,9° (c = 0,2 in CH₃Cl₂); Molekulargewicht = 564 (theoretisch 564,6)? Zurückhaltevolumen 270 bis 290 ml. B: 24,2 mg (30 %■) ; F. - 247- 250° C? ßiJ²⁵ _O ^s +168,3° (c « 0,2 in CH₂Cl₂); Molekulargewicht = 564 (theoretisch 564,6)? Zurückhaltevolumen 300 bis 360 ml.

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Die Isomerenreinheit (?98 %) von A und B wurde durch NMR-Spektroskopie bestimmt, wobei das Signal für 18-CH₃ bei 0 =1,06 ppm (CDCl₃) für A und bei 6 = 1,03 ppm (CDCl₃) für B studiert wurde.

Ähnliche Trennergebnisse erhielt man bei Verwendung von

Merckogeis-^y OR-OVA 2000 sowie bei Verwendung von Methylenchlorid, Äthylenchlorid, Äthylacetat, Tetrahydrofuran und Dioxan außer Chloroform als TCluiermittel bei beiden Gelmaterialtypen.

Beispiele 17 bis 27

Verschiedene 21-Ester der Isomerengemische, die nach den Beispielen 1 bis .1 5 hergestellt worden waren, wurden analog dem in Beispiel 16 beschriebenen Verfahren bereitet. Durch analoge Reinigung und Trennung erhielt man die in der nachfolgenden Tabelle II aufgeführten Isomeren. Die NMR-Untersuchungen wurden in CDCl₃ durchgeführt.

Die für die Veresterung verwendeten Säurechloride sind in der Tabelle II in der folgenden Weise abgekürzt: NAC = Nicotinsäurechlorid, AAC = Acetylchlorid, VAC = Valeriansäurechlorid, BAC = Benzofuran-2-carbonsäurechlorid.

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- ετ -

Nachfolgend sind Beispiele galenischer Präparate aufgeführt,, die in herkömmlicher Weise hergestellt wurden:

Beispiel 28 Wasserfreie Salbe

Steroid ' 0,0Ol - 0,2

Cetanol 5

Flüssiges Paraffin 20

Vaseline auf 100 g

Beispiel 29

Steroid 0,001 - 0,2

Monolein 2,5

Wollfett 5

Vaseline 42

Zitronensäure O,3

Natriumeitrat 0,9

Wasser auf 100 g

Beispiel 30 Einreibemittel

Steroid 0,001 - 0,2

Cetanol 3,2

Stearol 0,2

Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat 2

Sorbitanmonopalmitat 0,5

Propylenglycol 4,8

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- 1Ξ -

Metagin	0,08	500 mg'
Propagin	O,O2	ml
Wasser	auf 1OO g
Beispiel 31
Tinktur		- 10 mg
Steroid	3 -	mg
Ethanol, 60 %-ig	auf 100	mg
Beispiel 32		mg
Suspension für Injektionen		mg
Steroid	0,05	mg
latriumcarboxymethylcellulose	7
Natriumchlorid	7
Tween 8o^a*	0,5
Phenylcarbinol	8
Wasser, steril	auf 1

a) Polyoxyäthylen-(20)-sorbitanmonooleat

Beispiel Schaumaerosol

Steroid Glycerin Natriumcetylstearylalkohol Cetylstearylalkohol Isopropylmyristat Hetagin Wasser

Tetrafluordichloräthan/ Difluordichlormethan 40 :

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0	,OO1 - 0,2
4
0	,2
3
2
0	,1
80
auf 100

Wie aus den folgenden experimentellen Ergebnissen klar ersichtlich ist, besitzt eine der stereoisomeren Komponenten, die Komponente B, eindeutig physiologisch bessere Eigenschaften im Vergleich mit der anderen stereoisomeren Komponente und dem Stereoisomerengemisch. Die stereoisomere Komponente B, die die aktivere der beiden Komponenten A und B in dem Stereoisomerenpaar ist, kann als die stereoisomere Komponente definiert werden, die die höchste relative Drehwirkung besitzt. In Verbindung mit der Gelfiltration kann diese Komponente auch als das Stereoisomer definiert werden, das bei der Gelfiltration das größte Zurückhaltevolumen besitzt, d.h. die als letzte zusammen mit dem Eluat die Gelfiltrationssäule verläßt. Schließlich kann diese aktive stereoisomere Komponente auch als die Komponente definiert werden, die bei NMR-Messungen den niedrigsten O-Wert für 18-CH₃ zeigt. Im folgenden wird diese aktive stereoisomere

in Komponente immer mit B bezeichnet. Was die/Verbindung mit der vorliegenden Erfindung zu sehenden Steroide betrifft, so wurden das Stereoisomerengemisch wie auch die einzelnen stereoisomeren Komponenten A und B bezüglich ihrer entzündungshemmenden Aktivität im Granulomtest bei Ratten untersucht, die der Adrenalectomie unterzogen wurden. Das angewendete experimentelle Verfahren entspricht weitgehend dem, das von G. Engelhardt in "Arzneimittel-Forschung", 13, Seite 588, 1963 beschrieben wurde. Nach diesem Verfahren werden die Testsubstanzen örtlich in den eingepflanzten Wattebäuschen verabreicht. Es ist daher möglich, die lokale entzündungshemmende Wirkung in Granulomen und auch die Systemwirkungen in der Form des Thymusrückganges und einer Hemmung des Körpergewichtswachstums zu studieren.

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Junge männliche Ratten des Spargue-Dawley-Stammes mit einem Gewicht von etwa Ho bis 13Og wurden unter einer Äthernarkose der Adrenalectomie unterzogen. Zwei sterilisierte Wattebäusche von jeweils etwa 6 mg wurden gleichzeitig subkutan an der Seite des Rückgrates eingepflanzt. Nach dem Aufwachen der Tiere wurden diese zu jeweils fünfen pro Käfig untergebracht und mit normalem Futter und 1 % Natriumchloridlösung als Trinkwasser gefüttert. Am achten Testtag wurden die Tiere unter Äthernarkose getötet. Die um die Wattebäusche gebildeten Granulome wurden sorgfältig entfernt,, und Thymus und Körpergewicht wurden gemessen. Die beiden Granulome von jedem Tier wurden über Nacht bei 30 C getrocknet und gewogen. Nach Abziehen des ursprünglichen Gewichts der Wattebäusche wurde die Gewichtszunahme als ein Maß für das Granulomwachstum genommen.

Die Testsubstanzen wurden in Äthylacetat gelöst. Unter asepti- . sehen Bedingungen wurden 0,05 ml dieser Lösungen in jeden der Wattebäusche eingespritzt, wonach man das Lösungsmittel in einem Exsiccator verdampfen ließ. Normalerweise wurden drei Konzentrationen jeder Testsubstanz mit den Standarddosierungen von 3,3, 30 und 270 Jf/Tier untersucht. Jede Testgruppe umfaßte normalerweise IO Ratten. In die Wattebäusche der Kontrollgruppe wurde lediglich Äthylacetat eingespritzt, doch wurde die Behandlung im übrigen auf die gleiche Weise vorgenommen. Bei der Betrachtung der Wirkungen der Testsubstanzen wurden die mittleren Werte des Granulomwachstums, des Thymusgewichtes und der Körpergewichtszunahme vom Tag 0 bis zum Tag 8 in jeder Gruppe absolut und in Prozenten des entsprechenden Wertes der Kontrollgruppe bestimmt. Kurven, in denen die Dosis gegen die Wirkung

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aufgetragen wurde, wurden zur Bestimmung der Dosen verwendet, die eine 50 %-ige Verminderung des Granulomwachstums und des Thymusgewichtes und eine 25 %-ige Verminderung der Körpergewichtszunahme ergeben.

Die Ergebnisse der mit den fraglichen Steroiden durchgeführten Experimente sind in der nachfolgenden Tabelle III zusammengestellt. Aus der Tabelle ist klar ersichtlich, daß ein Aktivitätsunterschied zwischen den stereoisomeren Komponenten in jedem Isomerenpaar vorliegt und daß jeweils das zuletzt aus der Gelsäule eluierte Isomer die höchste Aktivität zeigt. Mit Hilfe des Trennverfahrens nach der vorliegenden Erfindung war es also möglich, zu zeigen, daß eine der stereoisomeren Komponenten, nämlich die Komponente B, eine eindeutig stärkere entzündungshemmende Wirkung besitzt als das entsprechende Stereoisomerengemisch.

Ungeachtet des Interesses an der Aufwendung von Steroidstrukturen mit einer hohen Aktivität besteht ein großer Bedarf an neuen Verbindungen mit einem besseren Verhältnis zwischen entzündungshemmender Wirkung und den nicht erwünschten Systemwirkungen, die nach der Resorption der Verbindungen beobachtet werden können. Thymusrückgang und Hemmung des Körperwachstums können als Beispiele solcher nicht erwünschter Effekte angesehen werden. Aus der Tabelle ist klar ersichtlich, daß es, um eine gute entzündungshemmende Wirkung (50 % Hemmung des Granulomwachstums) zu erhalten, bei den Bezugssubstanzen Triamcinolonacetonid und Fluocinolonacetonid erforderlich ist, solche Dosierungen (etwa 125 bzw. 50 f/Tier) zu verabreichen, daß diese gleichzeitig

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eine starke Abnahme des Thymusgewichtes und der Körpergewichtszunahme bei den Testtieren verursachen. Bei den Verbindungen nach der Erfindung sind die Dosen, die zu einer 50 %-igen Hemmung des Granülomwachstums erforderlich sind, jedoch geringer oder möglicherweise gleich wie jene,die einen Thymusrtickgang und eine Körpergewichtsheinmung ergeben.

Selbst wenn die Komponente A keine so starke entzündungshemmende Wirkung wie die entsprechende Komponente B aufweist, kann es in bestimmten Fällen vorteilhafter sein, die Komponente A anstelle des Isomerengemisches zu verwenden, und zwar im Hinblick auf die besseren Eigenschaften bezüglich der nicht erwünschten Systemeffekte. Daher fallen unter den Erfindungsgedanken auch die voneinander getrennten Komponenten A und B, wobei die Komponente B jenes Isomer des Isomerenpaares ist, das die größere relative drehende Wirkung bzw. das größte Zurückhalte- oder Verweilvolumen bei der Gelfiltration aufweist, während die Komponente A das Isomer des Isomerenpaares ist, das die geringere Drehwirkung und das kleinere Zurückhalte- oder Verweilvolumen bei der Gelfiltration besitzt.

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	Isomer	Dosis ι	70	25 %-ige Hem mung von Körperge wichts zunähme
Γ			270	100
rabelle III	A H		115	>27O
	A	if/Tier), erforderlich für	50	60
Zusammenstellung der biologischen Wir kungen der untersuchten Verbindungen	B	50 %-ige Hemmung von . Granulom- Thymusge- wachstum wicht	100	30
	A H	125	130	140
Verbindung, herge stellt nach Beispiel Nr.	A	120	60	90
Triamcinolon- acetonid	B	270	>30	100
1	A H	30	>30	^30
1	A	35	17	•730
1	B	25	70	100
2	A ■{	10	100	170
2	A	10	50	170
2	B	25	130	100
3	A H	3	90	>27O
3	A	<3	90	>27O
3	B	<3	14	>27O
4		<3	12	20
4	A	17	6	20
4	B	30	10	15
5	A H	10	13	50
5	A	50	10	50
5	B	15	105	50
Fluocinolon- acetonid		10	80	>27O
7	A H	5	125	80
7	A	6	70	>27O
8	B	4	175	50
8	A H	270	90
8		1OO
Prednacinolon- acetonid	h B	125
12		40
12		10
12	h B
13

	h B


h B


-- B





h B



h B


h B

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	- 2	A	¹1 ■-	8	^27O	2323216
13	B	5	210	100
13	A	5	70	>27O
16	B	3	10	>45
16	A	7	45	10
17	B	3	13	20
17	A	<3	70	20
18	B	<3	10	33
18	A + B	<3	25	10
20	A.	<3	90	20
20	B	<3	20	50
20	A + B	7	35	5
21	A	<3	70	10
21	B	<3	10	70
21	A + B	10	50	5
22	A	<3	90	30
22	B	< 3	35	33
22	A + B	< 3	10	5
25	A	<3	15	10
25	B	<3	7 ·	20
25	A + B	<3	60	20
27	A	<3	100	40
27	B	<3	60	100
27		35

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Claims

_r Verfahren zur Auftrennung von stereoisonieren Gemischen oder Isomerenpaaren von Steroiden dar allgemeinen Forrcel"

C=O

(I)

worin die I₇2- und 4,5-Stellungen gesättigt sind oder sich in v/enigstens einer der zwei Stellungen eine Doppelbindung befindet, X, ein Wasserstoffatom oder Fluoratom bedeutet, wann X-ein Wasserstoffatom ist und X. ein Fluoratom bedeutet, wenn X₂ ein Fluoratom ist, Z eine Hydroxylgruppe oder veresterte Hydroxylgruppe bedeutet und R eine geradkettige oder verzweigtkattige Alky!gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet, in ihre stereoisomeren Komponenten bezüglich der Rauir.orientierung der Substituenten an 2'-Kohlenstoffatom des Dioxolanringes, dadurch gekennzeichnet, daß man das Stereoisoinerengernisch der Gelfiltration unterzieht und die stereoisömeren Komponenten dabei getrennt gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gelfiltration auf einen vernetzten Dextrangel oder einen flischpolyrr.er von Vinylacetat durchführt.

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3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Eluiermittel bei der Gelfiltration halogenierte Kohlenwasserstoffe, .^ther und/oder Ester verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Eluiermittel bei der Gelfiltration Äthylacetat, Acetonitril, "ethylenchlorid und/oder Chloroform verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man der Gelfiltration ein Stereoisomerengemisch von Steroiden unterzieht, in denen R eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man der Gelfiltration ein Stereoisomerengemisch von Steroiden unterzieht, in denen Z eine mit Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Valeriansäure, Isovaleriansäure, Trimethylessigsäure, Hexansäure, Tertiärbutylessigsäure, Octansäure, Pyridin-3-carbonsäure, Pyridin-4-carbonsäure, Benzofuran-2-carbonsäure, Methoxymethy!carbonsäure, einer Dicarbonsäure, vorzugsweise mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, Phosphorsäure oder Schwefelsäure veresterte Hydroxylgruppe bedeutet.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man der Gelfiltration ein Stereoisomerengemisch von 16«(, l7öi-(2'-^Masserstoff-2'-methyl)-methylendioxy-9-fluorpregna-1,4-dien-llß, 21-diol-3,20-dien, 16<*, 17<*- (2 '-!»Tasserstof f-2 '-n-propyl) -methylendioxy-9-f luorpregna-1,4-dien-llß, 21-diol-3 ,20-dion, 16o^, 17c^- (2'-Wasserstoff-2'-methyl)-methylendioxy-6 ,9-difluorpregna-1,4-dien-11 ß, 21-diol-3 ,20-dion, 16<A, 1 l<k- (2 ■ -Nasserstoff-2 · -n-propyl) -

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methylendioxy-6 ,9-difluorpregna-1,4-dien-llß,21-diol-3,20-dion oder 16o^, ildr (2 '-X'Jasserstof f-2 '-n-propyl) -methylendioxypregna-1_/4-dien-llß,21-diol-3,20-dion unterzieht.

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