DE2116377B2 - Verfahren zur gewinnung des kallikrein-trypsin-inhibitors aus rinderorganen - Google Patents
Verfahren zur gewinnung des kallikrein-trypsin-inhibitors aus rinderorganenInfo
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Description
Der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor aus Rinderorganen (Aprotinin) ist ein basisches Polypeptid mit dem
Molekulargewicht 6500, dessen chemische Struktur aufgeklärt worden ist (Anderer und Hörn Ie,
Naturforsch. 20b 457 [1965]; A η d e r e r, Z. Naturforsch.
20b 462 [1965]; A η d e r e r und H ö r η 1 e, J. Biol. Chem.
241 1568 [1965]). Er hemmt verschiedene Proteasen, von denen die wichtigsten das Kallikrein, das Trypsin, das
Chymotrypsin und das Plasmin sind. Der Inhibitor hat insbesondere in Form eines Injektionspräparates eine
breite therapeutische Anwendung gefunden (Goß und
Kroneberg, »Neue Aspekte der Trasylol-Therapie«, F. K. Schattauer Verlag Stuttgart 1965).
Selbstverständlich müssen für diesen Zweck an seine Reinheit höchste Anforderungen gestellt werden. Um
dies zu erreichen, wurde bisher die Reinigung des Rohextraktes in mehreren Stufen durch spezifische
Fällungsreagenzien, wie Sulfosalizylsäure, Metaphosphorsäure, Trichloressigsäure und schließlich durch
Kristallisation vorgenommen (Deutsche Patentschriften 9 54 284, 10 84 433, 1155 563, 1181371, 1193 200;
Schultz, Naturwiss. 54, 338 [1967]). Zwischen diesen
Stufen sind mehrere Entsalzungsschritte notwendig, die mit Ionenaustauschern vorgenommen wurden. Um
diese Entsalzung zu vereinfachen und um gleichzeitig eine Konzentrierung der Extrakte zu erreichen, wurde
das Verfahren gemäß DT-PS 12 74 128 geprüft, das die
Abscheidung von organischen Substanzen mit hydrophoben Bereichen, wie Netzmittel, Gallensäuren,
Trypsin, Polypeptide u.a. aus wäßriger Lösung an poröse Polystyrolharze beschreibt.
Hierbei hat sich nun überraschenderweise gezeigt, daß man aus Rohextrakten von Rinderorganen, z. B.
Lunge, die eine Vielzahl von Polypeptiden und sonstigen Zeilinhaltsstoffen enthalten, den Kallikrein-Trypsin-Inhibitor
an besonderen, porösen Polystyrolharzen mit großer innerer Oberfläche nicht nur adsorbieren,
sondern hierauf auch weitgehend selektiv wieder eluieren kann. Damit ist in einem Schritt nicht nur eine
Ausscheidung und Konzentrierung des Polypeptids aus einer verdünnten wäßrigen Lösung und eine Entfernung
von Salzen, sondern auch eine weitgehende Reinigung und Entfernung von Begleichstoffen erzielbar. Das
Verfahren läßt sich sowohl in Säuren als Chromatographie als auch portionsweise in Kesseln durchführen.
Es war, auch im Hinblick auf das Verfahren gemäß DT-PS 12 74 128 nicht zu erwarten und ist in hohem
Maße überraschend, daß es nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gelingt, den Kallikrein-Typsin-Inhibitor
aus einer Lösung, die zahlreiche verschiedene Polypep-
tide enthält, anzureichern bzw. abzutrennen.
Geeignete Adsorberharze sind poröse Copolymerisate aus Styrol und Divinylbenzol, wie sie in der DT-OS
17 45 717 beschrieben sind. Die Löslichkeitsparameter ö
der zur Erzeugung der Porosität verwendeten Inertmaterialien liegen in der DT-PS 12 74 128 angegebenen
Grenzen. Die Porendaten der erfindungsgemäßen Harze unterscheiden sich daher nicht von denen, die die
Harze der DT-PS 12 74 128 zeigen.
Für die Ausübung des Verfahrens ist dir Beschaffenheit des Rohextraktes wesentlich. Wird das Organ, z. B.
Lunge oder Parotis, nach dem Verfahren der Methanol-Extraktion (DT-PS 10 84 433) aufgearbeitet und das
Methanol aus dem Extrakt wieder vollständig entfernt, so ist der Extrakt nach der Klärung unmittelbar für das
Verfahren verwendbar. Die Spezifische Aktivität beträgt 70 bis 90 KIE pro mg Trockengewicht.
Erfolgt jedoch der Aufschluß unter Zusatz einer Carbon- oder Mineralsäure, so ist nach der Klärung die
Adsorption des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors an das Harz unvollständig. Sie wird jedoch durch eine
geeignete Vorbehandlung des Rohextraktes verbessert, z. B. durch Zugabe von Salzen, wie Ammoniumsulfat
oder indem man den Aufschluß direkt von Ammoniumsulfat durchführt. Die Adsorption wird durch eine
steigende Konzentration des Salzes verbessert, wobei als oberste Grenze die Konzentration der beginnenden
Ausfällung des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors nicht überschritten werden darf. Für Ammoniumsulfat ist der
günstigste Bereich eine Sättigung von 0,2 bis 0,5 bei einem pH-Wert von 1,0 bis 2,5.
Die Beschaffenheit des Harzes ist ebenfalls von Bedeutung. Es wurden poröse Polymerisate aus Styrol
und Divinylbenzol verwendet, die im Handel erhältlich sind. Insbesondere waren Harze mit großer innerer
Oberfläche für das Verfahren geeignet (Tabelle).
Adsorption des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors aus Rohlösungen
an porösen Polystyrolharzen
Oberfläche | Adsorbierte Inhibitormenge | mg Rein |
KIE/m! Harz | substanz | |
pro ml Harz | ||
m2/g | 4,3 | |
330 | 30 300 | 3,0 |
150 | 21000 | 3,3 |
115 | 23 000 | 0,54 |
70 | 3 800 |
Die Adsorption des Inhibitors an das Harz wurde vorteilhaft aus sauren Lösungen bei pH-Werten von 1
bis 3 vorgenommen. Im Neutralbereich war die Adsorption weniger vollständig, aus alkalischem Medium
wurde zwar gut adsorbiert, jedoch war die Elution erschwert.
Nach erfolgter Adsorption des inhibitors wird das Harz mit wäßrigen Lösungen gewaschen. Neben reinem
Wasser wurde auch mit Vorteil 0,01 N-Salzsäure und anschließend eine 0,02-M-Lösung des Na-Salzes der
Äthylendiamintetraessigsäure verwendet. Hierdurch war eine Entfernung von Begieitstoffen möglich.
Die Elution des Inhibitors vom Harz kann mit organischen Lösungsmitteln erfolgen, die mit Wasser
mischbar sind, wie z. B. Methanol, Äthanol, Isopropanol, Aceton und ähnliche. Führt man das Verfahren in einer
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Säule durch, so kann man den Inhibitor besonders rein dadurch eluieren, indem man die Konzentration des
organischen Lösungsmittels langsam ansteigen läßt und das Eluat fraktioniert auffängt. Selbstverständlich ist,
wie auch im Batch-Verfahren, eine Elution mit s stufenweisen Erhöhungen der Konzentration des
organischen Lösungsmittels möglich.
Die Konzentration, bei der der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor
eluiert wird, ist abhängig von der Art des Lösungsmittels. Verwendet man Methanol, so wird der
Inhibitor bei 40 bis 60% abgelöst, im Falle von Isopropanol ist die Hauptmenge schon bei 20% eluiert.
Der auf diese Weise gewonnene Kallikrein-Trypsin-Inhibitor ist, wie man durch Elektrophorese in
Polyacrylamid oder auf Acetylcellulosestreifen zeigen kann, weitgehend frei von anderen Begleitpolypeptiden
und frei von Salzen. Die spezifische Aktivität beträgt 3000 bis 4000 KIE pro mg Trockengewicht. Die
Ausbeute beträgt 60 bis 80% der Hemmkapazität des Rohextraktes bei einer Anreicherung um das 30- bis
40fache.
700 g Rinderlunge, von Bindegewebe befreit und fein gemahlen, wurden mit Methanol unter Zusatz von
Calciumchlorid nach dem Verfahren der DT-PS 10 84 433 aufgeschlossen. Die Suspension wurde abzentrifugiert
und im Vakuum im Rotationsverdampfer auf 275 ml eingeengt. Das Methanol muß vollständig
entfernt sein. Das pH der Lösung wurde durch Zugabe von 2N-Salzsäure auf 1,5 eingestellt und nochmals
zentrifugiert. Der Überstand enthielt 880 000 KIE. Diese Lösung wurde auf folgende Säule gegeben:
50 g poröses Polystyrolharz mit 330 m2 Oberfläche pro g wurden in Methanol aufgenommen und so lange
gewaschen, bis das Methanol praktisch frei von im UV (280 nm) absorbierenden Substanzen war. Das Methanol
wurde hierauf dekantiert und durch ausgekochtes, destilliertes Wasser ersetzt. Die wäßrige Suspension des
Harzes (etwa 100 ml) wurde in eine Glassäule mit 3 cm Durchmesser und 30 cm Höhe luftblasenfrei gegeben
und mit 200 ml Wasser gewaschen.
Der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor-haltige Rohextrakt wurde mit einer Durchlaßgeschwindigkeit von 100 ml/h
auf die Säule gegeben. Hierauf wurde mit 200 ml 0,01 N-Salzsäure und anschließend mit 200 ml 0,02-M-Äthylendiamintetraessigsäure-Na-Salzund
100 ml Wasser gewaschen. Der Inhibitor wurde hierauf mit einem linearen Gradienten von 1 I Wasser zu 1 1 80%igem
Methanol eluiert und fraktioniert aufgefangen. Die Inhibitor-haltigen Fraktionen wurden vereinigt, das
Methanol im Vakuum abgedampft und die wäßrige Lösung gefriergetrocknet.
Es wurden 180 mg Inhibitor mit 714 000 KIE erhalten, das sind 81% der eingesetzten Hemmkapazität. Die
spezifische Aktivität betrug 3960 KiE/mg.
4 kg gemahlene Rinderlunge wurden in 7,2 1 dest. H2O
eingerührt. Nach 10 Minuten Rühren wurden 350 ml (>o 10%ige(v/v) H2SO4 zugegeben bis zum pH-Wert 1,9. Es
wurde auf 12,0 I aufgefüllt, 200 ml Toluol zugesetzt und über Nacht hei Raumtemperatur gerührt. Die Suspension
wurde 10 Minuten bai 4800 UpM zentrifugiert. Gesamtaktivität im Überstand: 8,15 χ 106KlE. Unter
Rühren wurde innerhalb von 30 Minuten (NH^SO4 bis
zur Sättigung 0,45 zugegeben. Der pH-Wert wurde mit konz. H2SO4 auf 1,5 eingestellt, es wurden 320 g
Kieselgur als Filterhilfsmitiel zugegeben und sofort filtriert.
7,0 1 dieser Lösung (Gesamtaktivität 4,38 χ 106 KlE)
wurden auf eine Säule mit ca. 2 I porösem Polystyrolharz mit 150 m2 Oberfläche pro g aufgebracht. Die Säule
wurde vorher mit 1 N methanolischer HCl, Methanol und Wasser gewaschen. Nach dem Auftragen des
Extraktes wurde die Säule mit 4 I 0,01 N HCl, 41 0,02 M EDTA (Natriumsalz der Äthylendiamintetraessigsäure)
und 2 1 dest. H2O gewaschen, anschließend wurde mit einem linaren Gradienten aus 51 dest. H2O
und 51 80%igem Methanol eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt, das Methanol im Vakuum
abdestilliert und die Lösung lyophilisiert. Es wurden 1,3 g Substanz mit einer spez. Aktivität von
2500KlE/mg erhalten (Gesamtaktivität:
3,22 χ 10" KIE), was einer Ausbeute von 73,5%
entspricht.
120 kg Rinderlunge wurde mit Methanol/CaCI2 nach
Beispiel 1 aufgeschlossen. Aus 4001 des erhaltenen Klarfiltrats wurde das Methanol sorgfältig abdestilliert.
Die wäßrige, den Kallikrein-Trypsin-Inhibitor in roher Form enthaltende Lösung wurde mit HCl auf einen
pH-Weri von 1,5 angesäuert und auf eine Säule mit 8 1 porösem Polystyrolharz mit 150 m2 Oberfläche pro g
aufgebracht. Gesamtaktivität: 152 χ 106 KIE. Die Säule wurde mit 161 0,01 N HCl, 16 1 0,02 M EDTA und 101
dest. H2O gewaschen. Danach wurde der Wirkstoff mit einem linearen Gradienten aus 201 dest. H2O und 20 1
80%igem Methanol eluiert. Die Fraktionen, die den Wirkstoff enthalten, wurden vereinigt, das Methanol
abdestilliert und die Lösung lyophilisiert. Es wurden 25,7 g Festsubstanz mit einer spez. Aktivität von
4200 KlE/mg erhalten (Gesamtaktivität
108 χ 106KIE), was einer Ausbeute von 71% entspricht.
120 g Rinderlunge, nach Beispiel 1 mit Methanol/Calciumchlorid
aufgeschlossen, ergab nach Entfernung des Methanols, Einstellung des pH-Wertes auf 1,5 und
Zentrifugation 67 ml Überstand mit 150 000 KIE.
In diese Rohlösung des Inhibitors wurden 10 ml poröses Polystyrolharz mit 150 m2 Oberfläche pro g
eingerührt. Nach 30 Minuten wurde das Harz auf der Nutsche abgesaugt und mit 100 ml Wasser gewaschen.
Hierauf wurde das Harz in eine Lösung von 20 ml Isopropanol, mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt, suspendiert
und 30 Minuten ger'ihrt. Das Harz wurde durch Absaugen entfernt und im Filtrat der Inhibitor nach
Abdestillieren des Isopropanols im Vakuum bestimmt. Ausbeute 123 000 KIE, das sind 82% der eingesetzten
Hemmkapazität.
Nach der Gefriertrocknung der Lösung wurden 44 mg Inhibitor mit einer spezifischen Aktivität von
2750 KIE pro mg Einwaage erhalten.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Gewinnung des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors aus Rinderorganen, aus diesen enthaltenden wäßrigen Lösungen mit Hilfe von Adsorptionsmitteln und anschließender Desorption, dadurch gekennzeichnet, daß man die Adsorption an Teilchen von nichtionogenen, wasserunlöslichen, vernetzten Polymerisaten poröser Struktur aus Styrol und Divinylbenzol, die eine aktive Oberfläche von 10 bis 100Om2Zg besitzen, vornimmt und mit organischen Lösungsmitteln eluiert, die mit Wasser mischbar sind.
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