PL83395B1 - - Google Patents

Description

Uprawniony z patentu: Bayer Aktiengesellschaft, Leverkusen (Republi¬ ka Federalna Niemiec) Sposób wyodrebniania inhibitora kalikreiny-trypsyny Przedmiotem wynalazku jest sposób wyodreb¬ niania inhibitora kalikreiny- trypsyny z organów bydlecych.Inhibitor kalikreiny-trypsyny z organów bydle¬ cych (Trasylol R) jest zasadowym polipeptydem o ciezarze czasteczkowym 6500, którego budowa chemiczna juz zostala wyjasniona. (Anderer, F. A. i Hornie, S., Z. Naturforsch. pt. tom 20, 457 (1965); Anderer, F. A., Z. Naturforsch. pt. tom 20 462 (1965); Anderer, F. A. i Hornie, S., J. Biolog, Chem. 241 1568 (1967). Hamuje on rozmaite pro- teazy, sposród których do najwazniejszych naleza kalifereina, trypsyna, chymotrypsyna i plazmina.Inhibitor, zwlaszcza w postaci preparatu do za¬ strzyków, znalazl szerokie zastosowanie w lecznic¬ twie (Gross, R. i Kroneberg, G., „Neue. Aspekte der Trasylol-Therapie". Wydawnictwo F. K.Schattauer, Stuttgart 1965).Jest oczywiste, ze wymagania dotyczace czy¬ stosci preparatu musza byc, w zwiazku z jego za¬ stosowaniem, najwyzsze. W celu osiagniecia tego stosowano dotychczas oczyszczanie surowego eks¬ traktu w szeregu etapów za pomoca specyficznych odczynników wytracajacych takich, jak kwas sul- fosalicylowy, kwas metafosforowy, kwas trójchlo- x rooctowy i w koncu za pomoca krystalizacji (nie¬ mieckie opisy patentowe nr nr 954 284, 1084433, 1155 553, 1181371, 1193 200; Schultz, F., Natur- wiss. 14 338 (1967)). Pomiedzy tymi etapami ko¬ nieczne sa liczne etapy odsalania, przeprowadzane w 10 15 20 za pomoca wymieniaczy jonowych. W celu uprosz¬ czenia tych procesów odsalania i jednoczesnego za- tezania ekstraktów, zbadano metody Gustafsona Gustafson, R. L. (Rohmi Haas Comp. Philadelphia), (DBP 1274 128), 22.2.66, jak równiez Blessinga, H.W i La Roche de Beneyille^ P. (Rohm i Haas Comp.Philadelphia), (DOS 2 040107), podajace sposoby oddzielania na zywicach polistyrenowych z roz¬ tworów wodnych substancji organicznych o wlas¬ nosciach hydrofobowych takich, jak srodki zwil¬ zajace, kwasy zólciowe, trypsyna, polipeptydy i inne.Stwierdzono przy tym nieoczekiwanie, ze z su¬ rowych ekstraktów z organów bydlecych, na przy¬ klad z pluc, zawierajacych znaczna ilosc polipep- tydcw i innych cial, zawartych w komórkach, moz¬ na zaadsorbowac inhibitor kalikreiny-trypsyny na specjalnych, porowatych zywicach polistyre¬ nowych o duzej powierzchni wewnetrznej 10— 1000 mVg, jak równiez eluowac go ponownie z duza selektywnoscia. W ten sposób osiaga sie w jednym etapie nie tylko wydzielenie i skoncentro¬ wanie tego polipeptydu z rozcienczonego roztworu wodnego oraz usuniecie soli, lecz równiez znaczne oczyszczenie i usuniecie substancji towarzysza¬ cych. Sposób ten mozna przeprowadzic zarówno n? kolumnach jako proces chromatograficzny, jak tez partiami w kotlach.Uwzgledniajac sposób opisany w niemieckim opisie patentowym nr 1174128 i DOS 1040107 83 3t53 83 395 4 bylo równiez nieoczekiwane i w wysokim stopniu zaskakujace, ze mozna sposobem wedlug wynalaz¬ ku inhibitor kalikreiny-trypsyny selektywnie wzbogacic, wzglednie wydzielic z roztworu, zawie¬ rajacego inne liczne polipeptydy.Jako zywice adsorbujace stosuje sie porowate kopolimery ze styrenu i dwuwinyiobenzenu, opisa¬ ne w niemieckim opisie wylozeniowym nr 1745 717.Parametry rozpuszczalnosci 8 substancji stosowa¬ nych do wytworzenia porowatosci mieszcza sie w granicach, podanych w niemieckim opisie .paten¬ towym nr 1 274128. Dane dotyczace porów zywic stosowanych w sposobie wedlug wynalazku nie róznia sie od opisanych w niemieckim opisie pa¬ tentowym nr 1 274 128.Parametr rozpuszczalnosci 8 jest zdefiniowany za- pomoca pierwiastka z ilorazu energii parowa¬ na A E i objetosci molowej V danej cieczy: 8 = (A E/V)1/2. Objetosc molowa V jest zdefinio¬ wana wzorem: V = ciezar czasteczkowy/gestosc.Energie parowania AE mozna ustalic z dajace¬ go sie latwo oznaczyc doswiadczalnie ciepla paro¬ wania AH (entalpia parowania), rózniacego sie od AE praca R • T, potrzebna do zmiany objetosci a wiec AE = AH —RT, przy czym R oznacza stala gazowa, a T = ozna¬ cza temperature bezwzgledna w °K.Wartosci AH podane w literaturze dotycza okreslonej temperatury pracy. Poniewaz do obli¬ czenia 8 potrzebna jest równiez gestosc, nalezy wstawic wartosc gestosci, odpowiadajaca powyz¬ szej temperaturze pracy.Przy prowadzeniu procesu istotne znaczenie ma¬ ja wlasnosci surowego ekstraktu. Jezeli organ, na przyklad pluca lub gruczoly przyuszne przerabia sie droga ekstrakcji metanolem (niemiecki opis patentowy nr 1 084 433) i metanol zupelnie usuwa z ekstraktu, wtedy ekstrakt po sklarowaniu na¬ daje sie bezposrednio do uzycia w sposobie we¬ dlug wynalazku. Aktywnosc wlasciwa wynosi 70—90 KIE na mg suchej masy. Jezeli natomiast przeróbke prowadzi sie przy dodatku kwasu kar- boksylowego lub mineralnego, wtedy po sklarowa¬ niu adsorpcja inhibitora na zywicy nie jest zupel¬ na. Mozna ja jednak poprawic przez odpowiednie przygotowanie surowego ekstraktu, na przyklad przez dodatek soli takiej, jak siarczan amonowy, lub tez prowadzac przeróbke bezposrednio w obecnosci siarczanu amonowego. Adsorpcja ulega poprawieniu przy wzrastajacym stezeniu soli, przy czym nie wolno przekroczyc jako górnej granicy stezenia, przy którym rozpoczyna sie wytracanie inhibitora. Dla siarczanu amonowego najkorzyst¬ niejszy zakres nasycenia lezy w granicach 0,2—0,5 przy wartosci pH = 1,0—2,5.Równiez struktura zywicy posiada znaczenie.Stosowano porowate polimery ze styrenu i dwu¬ winyiobenzenu, znajdujace sie w handlu pod nazwa handlowa Lewapol R (Farbenfabriken Bayer AG, Leverkusen). Zwlaszcza zywice o duzej we¬ wnetrznej powierzchni nadaja sie dla tego sposo¬ bu.W ponizszej tablicy ilustruje sie adsorpcje in¬ hibitora kalikreiny-trypsyny z surowych roztwo¬ rów na porowatych zywicach polistyrenowych.Tablica Typ zywicy Ca 9221 Ca 9255 Do 18/65 Do 8/60 Powierzch¬ nia m2/g 330 150 115 70 Adsorbowana ilosc inhibitora KIE/ml zywicy 30300 21000 23000 3800 mg czystej substancji na ml zywicy 4,3 3,0 3,3 0,54 Adsorpcje inhibitora na zywicy prowadzi sie korzystnie z kwasnych roztworów przy war¬ tosciach pH = 1—3. W zakresie obojetnym ad¬ sorpcja byla mniej zupelna, ze srodowiska alka¬ licznego adsorpcja byla wprawdzie dobra, lecz eluowanie bylo utrudnione.Po zakonczonej adsorpcji inhibitora przemywa sie zywice wodnymi roztworami. Poza czysta wo¬ da stosowano równiez korzystnie 0,01 m kwas sol¬ ny i nastepnie 0,02 m roztwór soli sodowej kwasu etylenodwuaminoczterooctowego. Umozliwia to u- suniecie substancji towarzyszacych.Inhibitor z zywicy mozna eluowac za pomoca organicznych rozpuszczalników mieszajacych sie z woda takich, jak na przyklad metanol, etanol, izopropanol, aceton i tym podobne. Jezeli wy¬ odrebnianie prowadzi sie w kolumnie, wtedy moz¬ na inhibitor eluowac w stanie szczególnie czystym, podnoszac powoli stezenie organicznego roz¬ puszczalnika i odbierajac eluat frakcjami. Oczy¬ wiscie mozna eluowanie prowadzic, podnoszac ste¬ zenie organicznego rozpuszczalnika stopniowo.Stezenie, przy którym zostaje eluowany inhibi¬ tor kalikreiny-trypsyny, zalezy od rodzaju roz¬ puszczalnika. Jezeli stosuje sie metanol, wtedy inhibitor zostaje uwolniony przy 40% —60%, w przypadku izopropanolu glówna partia ulega eluowaniu juz przy 20%. Równiez dodatki roz¬ puszczalników moga zmienic warunki desorpcji.Tak wiec dodatek amoniaku przyspiesza elucje, przy czym jednak zostaja równiez eluowane bar¬ wiace skladniki. Mozliwa jest równiez elucja bez organicznych rozpuszczalników, przez wypieranie inna substancja, na przyklad trójetyloamina.Uzyskany w ten sposób inhibitor kalikreiny- -trypsyny jest w znacznym stopniu pozbawiony innych towarzyszacych polipeptydów i nie zawie¬ ra soli, jak to mozna wykazac za pomoca elektro¬ forezy w poliakryloamidzie lub na paskach ace¬ tylocelulozy. Czynnosc wlasciwa wynosi 3000— 4000 KIE na mg suchej substancji. Wydajnosc wynosi 60—80% zdolnosci hamujacej surowego ekstraktu przy wzbogaceniu 30—40-krotnym.Ponizsze przyklady wyjasniaja blizej sposób wedlug wynalazku.Przyklad I. 700 g pluc bydlecych uwolnio¬ nych od tkanki lacznej drobno zmielonych przera- 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6083395 5 6 bia sie za pomoca metanolu przy dodatku chlorku wapniowego wedlug sposobu opisanego w niemiec¬ kim opisie patentowym nr 1 084 433. Zawiesine od¬ wirowuje sie i zageszcza pod zmniejszonym cisnie¬ niem w wyparce obrotowej do 275 ml. Metanol nalezy usunac zupelnie. Wartosc pH roztworu na¬ stawia sie za pomoca dodatku 2 n kwasu solnego na wartosc 1,5. Nastepnie odwirowuje sie po¬ nownie .Roztwór nad osadem zawiera 880 000 KIE. Roz¬ twór ten wprowadzono na nastepujaca kolumne: 50 g ' porowatej zywicy polistyrenowej (Lewa¬ pol1* Ca 9221) o powierzchni 330 m2 na g, zadaje sie metanolem i przemywa tak dlugo, az metanol praktycznie nie zawiera juz substancji absorbuja¬ cych w nadfiolecie (280 nm). Nastepnie dekantuje sie metanol i w jego miejsce dodaje wygotowana destylowana wode. Wodna zawiesine zywicy w ilosci okolo 100 ml wprowadza sie bez banie- czek powietrza do szklanej kolumny o srednicy 3 cm i wysokosci 30 cm i przemywa 200 ml wody.Surowy ekstrakt, zawierajacy inhibitor, nanosi sie na kolumne przy szybkosci przeplywu 100 ml/godzine. Nastepnie przemywa sie 200 ml 0,01 m kwasu solnego i nastepnie 200 ml 0,02 m soli sodowej kwasu etylenodwuaminoczterooctowe- go i 100 ml wody. Nastepnie eluuje sie inhibitor przy liniowym gradiencie od 1 litra wody do 1 li¬ tra 80% metanolu i odbiera frakcje. Frakcje za¬ wierajace inhibitor laczy sie, odparowuje metanol pod zmniejszonym cisnieniem, a roztwór wodny liofilizuje.Otrzymuje sie 180 mg inhibitora o 714 000 KIE, to jest o 81% wyjsciowej zdolnosci hamujacej.Czynnosc wlasciwa wynosi 3960 KIE na mg.Przyklad II. 4 kg zmielonych pluc bydle¬ cych wprowadza sie, mieszajac, do 7,2 litra desty¬ lowanej wody. Po 10 minutach mieszania dodaje sie 350 ml 10% objetosciowych H2S04 do wartosci pH=l,9. Dopelnia sie do objetosci 12,0 litrów, do¬ daje 200 ml toluenu i miesza przez noc w tempe¬ raturze pokojowej. Zawiesine wiruje sie przez 10 minut przy 4800 obrotach na minute. Calko¬ wita czynnosc w cieczy nad osadem wynosi 8,15X106 KIE. Nastepnie dodaje sie," mieszajac, w eiagu 30 minut (NH4)2S04 do nasycenia 0,45. War¬ tosc pH nastawia sie za pomoca stezonego H2S04 na 1,5, dodaje 320 g ziemi okrzemkowej jako po¬ mocniczy srodek filtracyjny i natychmiast saczy. 7,0 litrów tego roztworu (o calkowitej czynnosci 4,38 X106 KIE) nanosi sie ma kolumne, zawierajaca okolo 2 litrów porowatej zywicy polistyrenowej o powierzchni 150 m2 na g (LewapolR Ca 9255).Kolumne przemywa sie uprzednio 1 n metanolo¬ wym roztworem HC1, metanolem i woda. Po wprowadzeniu ekstraktu przemywa sie kolumne 4 litrami 0,01 n HC1, 4 litrami 0,02 m EDTA (sól sodowa kwasu etylenodwuaminoczterooctowego) i 2 litrami destylowanej wody, nastepnie eluuje przy gradiencie liniowym od 5 litrów destylowa¬ nej H20 do 5 litrów 80% metanolu. Frakcje ak¬ tywne laczy sie, metanol oddestylowuje pod 5 zmniejszonym cisnieniem, a roztwór liofilizuje.Otrzymuje sie 1,3 g substancji o czynnosci wlasci¬ wej 2500 KIE (czynnosc calkowita 3,22 X10« KIE), co odpowiada wydajnosci 73,5%.Przyklad III. 120 kg pluc bydlecych przera¬ bia sie z metanolem i CaCl2 wedlug przykladu I.Z 400 litrów otrzymanego klarownego przesaczu oddestylowuje sie dokladnie metanol. Wodny roz¬ twór zawierajacy inhibitor kalikreiny-trypsyny w surowej postaci zakwasza sie za pomoca HO do wartosci pH=l,5 i wprowadza na kolumne zawie¬ rajaca 8 litrów zywicy 'polistyrenowej o powierzch¬ ni 150 m2 na g {Lewapol R Ca 9255). Czynnosc calkowita 152 X108 KIE. Kolumne przemywa sie 16 litrami 0,01 n HO, 16 litrami 0,02 m EDTA i 10 litrami destylowanej wody. Nastepnie eluuje sie substancje czynna przy gradiencie liniowym od 20 litrów destylowanej wody do 20 litrów 80% metanolu. Frakcje, zawierajace substancje czynna, laczy sie, oddestylowuje metanol, a roztwór liofi¬ lizuje. Otrzymuje sie 25,7 g substancji stalej o czynnosci wlasciwej 4200 KIE/mg (czynnosc cal¬ kowita 108X106 KIE), co odpowiada wydajnosci 71%.Przyklad IV. 120 g pluc bydlecych przerabia sie wedlug przykladu I z metanolem i chlorkiem wapniowym i otrzymuje po usunieciu metanolu, nastawieniu wartosci pH na 1,5 i odwirowaniu 67 ml cieczy nad osadem zawierajacej 150 000 KIE.Do tego surowego roztworu inhibitora wprowa¬ dza sie, mieszajac, 10 ml porowatej zywicy poli¬ styrenowej (Lewapol R Ca 9255 o 150 m2 po¬ wierzchni na g). Po 30 minutach odsacza sie zy¬ wice na nuczy i przemywa 100 ml wody. Na¬ stepnie zawiesza sie zywice w roztworze 20 ml izopropanolu, dopelnia woda do 100 ml i miesza przez 30 minut. Zywice usuwa sie za pomoca od¬ sysania i oznacza w przesaczu inhibitor po od¬ destylowaniu izopropanolu pod zmniejszonym cis¬ nieniem. Wydajnosc wynosi 123 000 KIE, co odpo¬ wiada 82% wyjsciowej zdolnosci hamujacej. PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wyodrebniania inhibitora kalikreiny- -trypsyny z wodnych* roztworów zawierajacych ten inhibitor, za pomoca srodków adsorpcyjnych i nastepujacej desorpcji, znamienny tym, ze jako srodek adsorpcyjny stosuje sie czastki niejono- twórczych, nierozpuszczalnych w wodzie, usiecio- wanych polimerów o strukturze porowatej ze sty¬ renu i dwuwinylobenzenu, posiadajacych po¬ wierzchnie czynna 10—1000 m2/g. 15 30 25 30 35 40 45 50 PL PL