DE2116377A1 - Verfahren zur Isolierung des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors aus Rinderorganen - Google Patents
Verfahren zur Isolierung des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors aus RinderorganenInfo
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Description
2116377 FARBENFABRIKEN BAYER AG
LEVERKUSEN-Bayemerk £ flnf{{
Patent-Abteilung Si/Wk
Verfahren zur Isolierung des Kallikrein-Trypsin-InhiMtors
aus Rinderorganen
Der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor aus Rinderorganen (Trasylol
<£ft) ) ist ein basisches Polypeptid mit dem Molekulargewicht
6500, dessen chemische Struktur aufgeklärt worden ist. /Änderer, P.A. und Hörnle, S., Z. Naturforsch, pt. b.20
457 (1965); Anderer, F.A., Z. Naturforsch, pt. b.20, 462 (1965);
Anderer, F.A. und Hörnle, S., J. Biolog. Chem. 241 1568
(196527· Er hemmt verschiedene Proteasen, von denen die
wichtigsten das Kallikrein, das Trypsin, das Chymotrypsin und das Plasmin sind. Der Inhibitor hat insbesondere in Form
eines Injektionspräparates eine breite therapeutische Anwendung gefunden /Sroß, R. und Kroneberg, G., "Neue Aspekte
der Trasylol-Therapie", F.K. Schattauer Verl. Stuttgart 1965,7·
Selbstverständlich müssen für diesen Zweck an seine Reinheit höchste Anforderungen gestellt werden. Um dies zu erreichen,
wurde bisher die Reinigung des Rohextraktes in mehreren Stufen durch spezifische Fällungsreagenzien, wie Sulfosalizylsäure,
Metaphosphorsäure, Trichloressigsäure und schließlich
durch Kristallisation vorgenommen /Deutsche Patentschriften 954 284, 1 084 433, 1 155 563, 1 181 371, 1 193 200; Schultz,
F., Naturwiss. 54 338 (1967J.7· Zwischen diesen Stufen sind
mehrere Entsalzungsschritte notwendig, die mit Ionenaustauschern
vorgenommen wurden. Um diese Entsalzung zu verein-
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fachen, und um gleichzeitig eine Konzentrierung der Extrakte zu erreichen, wurde das Verfahren von Gustafson /Sustafson,
R.L. (Rohm und Haas Comp. Philadelphia), (DBP 1 274 128), 22.2.667 geprüft, der die Abscheidung von organischen Substanzen
mit hydrophoben Bereichen, wie Netzmittel, Gallensäuren, Trypsin, Polypeptide u.a. aus wäßriger Lösung an poröse Polystyrolharze
beschreibt.
Hierbei hat sich nun überraschenderweise gezeigt, daß man aus
Rohextrakten von Rinderorganen, z. B. Lunge, die eine Vielzahl
von Polypeptiden und sonstigen Zeilinhaltsstoffe enthalten,
den Kallikrein-Trypsin-Inhibitor an besonderen, porösen Polystyrolharzen mit großer innerer Oberfläche nicht nur
adsorbieren, sondern hierauf auch weitgehend selektiv wieder eluieren kann. Damit ist in einem Schritt nicht nur eine Ausscheidung
und Konzentrierung des Polypeptids aus einer verdünnten wäßrigen Lösung und eine Entfernung von Salzen, sondern
auch eine weitgehende Reinigung und Entfernung von Begleitstoffen erzielbar. Das Verfahren läßt sich sowohl in
Säulen als Chromatographie als auch portionsweise in Kesseln durchführen.
Es war, auch im Hinblick auf das Verfahren des deutschen Patentes
1 274 128 nicht zu erwarten und ist in hohem Maße überraschend, daß es nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
gelingt, den Kallikrein-Trypsin-Inhibitor, aus einer Lösung, die zahlreiche verschiedene Polypeptide enthält, anzureichern
bzw. abzutrennen.
Geeignete Adsorberharze sind poröse Copolymerisate aus Styrol
und Divinylbenzol, wie sie in der Deutschen Offenlegungsschrift
1 745 717 beschrieben sind. Die Löslichkeitsparameter <J der zur Erzeugung der Porosität verwendeten Inertmaterialien
liegen in den im DBP 1. 274 128 angegebenen Grenzen. Die Porendaten der erfindungsgemäßen Harze unterscheiden sich
daher nicht von denen, die die Harz© des DBP 1 274 128 zeigen.
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Der Löslichkeitsparameter ef ist definiert durch die Wurzel
aus dem Quotienten Verdampfungsenergie Δ E und dem Molvolumen V der entsprechenden Flüssigkeit:
,{ = (ΔΕ / V)1^
Das Molvolumen V ist definiert nach
Das Molvolumen V ist definiert nach
v _ Molgewicht
~ Dichte
~ Dichte
Die Verdampfungsenergie Δ. E ist zugänglich aus der experimentell
leicht bestimmbaren Verdampfungswärme Δ H (Verdampfungsenthalpie),
die sich vonΔE durch die für die Volumenänderung
benötigte Arbeit R . T unterscheidet, also
Δ Ε =ΔΗ - RT
(R = Gaskonstante T = absolute Temperatur in 0K)
Die in der Literatur angegebenen Werte für A.H beziehen sich auf
eine bestimmte Arbeitstemperatur. Da man zur Berechnung von
ο auch die Dichte benötigt, muß man den Wert für die Dichte einsetzen, der der obigen Arbeitstemperatur entspricht.
Für die Ausübung des Verfahrens ist die Beschaffenheit des Rohextraktes wesentlich. Wird das Organ, z.B. Lunge oder
Parotis, nach dem Verfahren der Methanol-Extraktion (DBP 1 084 433) aufgearbeitet und das Methanol aus dem
Extrakt wieder vollständig entfernt, so ist der Extrakt nach der Klärung unmittelbar für das Verfahren verwendbar. Die
spezifische Aktivität beträgt 70 bis 90 KIE pro mg Trockengewicht
.
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Erfolgt jedoch der Aufschluß unter Zusatz einer Carbon- oder ■
Mineralsäure, so ist nach der Klärung die Adsorption des Inhibitors an das Harz unvollständig. Sie wird jedoch durch eine«
geeignete Vorbehandlung des Rohextraktes verbessert, z. B. durch Zugabe von Salzen, wie Ammoniumsulfat oder indem man
den Aufschluß direkt in Anwesenheit von Ammoniumsulfat durchführt. Die Adsorption wird durch eine steigende Konzentration
des Salzes verbessert, wobei als oberste Grenze die Konzentration der beginnenden Ausfällung des Inhibitors nicht überschritten·
werden darf. Für Ammoniumsulfat ist der günstigste Bereich eine Sättigung von 0,2 - 0,5 bei einem pH-Wert von
1,0 bis 2,5.
Die Beschaffenheit des Harzes ist ebenfalls von Bedeutung. Es wurden poröse Polymerisate aus Styrol und Divinylbenzol
/Τ5Λ
verwendet, die unter dem Handelsnamen Lewapol ^ (Farbenfabriken
Bayer AG, Leverkusen) im Handel erhältlich sind. Insbesondere waren Harze mit großer innerer Oberfläche für das
Verfahren geeignet. (Tabelle).
Tabelle Adsorption des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors aus Rohlösungen an porösen Polystyrolharzen
Harztyp Oberfläche Adsorbierte Inhibitormenge
mg Reinsubs pro ml Harz
m / g KIE/ml Harz mg Reinsubstenz
Ca 9221 330 30300 4,3
Ca 9255 150 ' 21000 3,0
Do 18/65 115 23000 3,3
Do 8/60 70 3800 0,54
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Die Adsorption des Inhibitors an das Harz wurde vorteilhaft aus sauren Lösungen bei pH-Werten von 1-2 vorgenommen. Im
Neutralbereich war die Adsorption weniger vollständig, aus alkalischem Medium wurde zwar gut adsorbiert, jedoch war die
Elution erschwert.
Nach erfolgter Adsorption des Inhibitors wird das Harz mit wäßrigen Lösungen gewaschen. Neben reinem Wasser wurde auch
mit Vorteil 0,01 M Salzsäure und anschließend eine 0,02 M Lösung des Na-Salzes der Äthylendiamintetraessigsäure verwendet.
Hierdurch war eine Entfernung von Begleitstoffen möglich.
Die Elution des Inhibitors vom Harz kann mit organischen Lösungsmitteln erfolgen, die mit Wasser mischbar sind, wie
z.B. Methanol, Äthanol, Isopropanol, Aceton und ähnliche. Führt man das Verfahren in einer Säule durch, so kann man
den Inhibitor besonders rein dadurch eluieren, indem man die Konzentration des organischen Lösungsmittels langsam
ansteigen läßt und das Eluat fraktioniert auffängt. Selbstverständlich
ist, wie auch im Batch-Verfahren, eine Elution
mit stufenweisen Erhöhungen der Konzentration des organischen Lösungsmittels möglich.
Die Konzentration, bei der der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor
eluiert wird, ist abhängig von der Art des Lösungsmittels. Verwendet man Methanol, so wird der Inhibitor bei 40 - 60 % abgelöst,
im Falle von Isopropanol ist die Hauptmenge schon bei 20 % eluiert. Zusätze zum Lösungsmittel können ebenfalls das
Desorptionsverhalten verändern. So bewirkt eine Zugabe von
Ammoniak eine beschleunigte Elution, wobei jedoch färbende Bestandteile mit abgelöst werden. Eine Elution ohne organische
Lösungsmittel durch Verdrängung mit einer anderen Substanz, z. B. Triäthylamin, ist ebenfalls möglich.
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Der auf diese Weise gewonnene Kallikrein-Trypsin-lnhibitor ist,
wie man durch Elektrophorese in Polyacrylamid oder auf Acetylcellulosestreifen
zeigen kann, weitgehend frei von anderen Be- » gleitpolypeptiden und frei von Salzen. Die spezifische Aktivität
beträgt 3000 - 4000 KIE pro mg Trockengewicht. Die Ausbeute beträgt 60 - 80 % der Hemmkapazität des Rohextraktes bei
einer Anreicherung um das 30- bis 40-fache.
700 g Rinderlunge, von Bindegewebe befreit und feingemahlen, wurden mit Methanol unter Zusatz von Calciumchlorid nach dem
Verfahren des DBP 1 084 433 aufgeschlossen. Die Suspension wurde abzentrifugiert und im Vakuum im Rotationsverdampfer
auf 275 ml eingeengt. Das Methanol muß vollständig entfernt sein. Das pH der Lösung wurde durch Zugabe von 2N-Salzsäure
auf 1,5 eingestellt und nochmals zentrifugiert. Der Überstand enthielt 380 000 KIE. Diese Lösung wurde auf folgende Säule
gegeben:
50 g poröses Polystyrolharz (Lewapol®'Ca 9221) mit 330 m
Oberfläche pro g wurden in Methanol aufgenommen und solange gewaschen bis das Methanol praktisch frei von im UV (280 nm)
adsorbierenden Substanzen war. Das Methanol wurde hierauf dekantiert und durch ausgekochtes, destilliertes Wasser ersetzt.
Die wäßrige Suspension des Harzes (etwa 100 ml) wurde
in eine Glassäule mit 3 cm Durchmesser und 30 cm Höhe luftblasenfrei gegeben und mit 200 ml Wasser gewaschen.
Der Inhibitor-haltige Rohextrakt wurde mit einer Durchlaßgeschwindigkeit
von 100 ml/h auf die Säule gegeben. Hierauf wurde mit 200 ml 0,01 M-Salzsäure und anschließend mit 200 ml 0,02-M
Äthylendiamintetraessigsäure-Na-Salz und 100 ml Wasser
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gewaschen. Der Inhibitor wurde hierauf mit einem linearen Gradienten von 1 1 Wasser zu 1 1 80 %igem Methanol
eluiert und fraktioniert aufgefangen. Die Inhibitor-haltigen Fraktionen wurden vereinigt, das Methanol im Vakuum abgedampft
und die wäßrige Lösung gefriergetrocknet.
Es wurden 180 mg Inhibitor mit 714 000 KIE erhalten, das sind 81 % der eingesetzten Hemmkapazität. Die spezifische Aktivität
betrug 3960 KIE/mg.
4 kg gemahlene Rinderlunge wurden in 7,2 1 dest. H2O eingerührt.
Nach 10 Min. Rühren wurden 350 ml 10 %ige (v/v) H2SO^
zugegeben bis zum pH-Wert 1,9. Es wurde auf 12,0 1 aufgefüllt, 200 ml Toluol zugesetzt und Über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Die Suspension wurde 10 Min. bei 4800 UpM zentrifugiert. Gesamtaktivität im Überstand: 8,15 x 10 KIE= Unter Rühren
wurde innerhalb von 30 Minuten (NH^)2S0^ bis zur Sättigung
0,45 zugegeben. Der pH-Wert wurde mit konz. H2SO^ auf 1,5 eingestellt,
es wurden 320 g Kieselgur als Filterhilfsmittel zugegeben und sofort filtriert.
7,0 1 dieser Lösung (Gesamtaktivität 4,38 χ 1O6 KIE) wurden
ρ auf eine Säule mit ca. 2 lporösem Polystyrolharz mit 150 m
Oberfläche pro g (Lewapol^Ca 9255) aufgezogen. Die Säure wurde vorher mit 1N methanolischer HCl, Methanol und Wasser
gewaschen. Nach dem Auftragen des Extraktes wurde die Säure mit 4 1 0,01 N HCl, 4 1 0,02 M EDTA (Natriumsalz der Äthylen-
diamintetraessigsäure) und 2 1 dest. H2O gewaschen, anschließend
wurde mit einem linearen Gradienten aus 5 1 dest. H2O lind 5 1 80 tigern Methanol eluiert. Die aktiven Fraktionen
wurden vereinigt, das Methanol im Vakuum abdestilliert und die
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Lösung lyophilisiert. Es wurden 1,3 g Substanz mit einer
spez. Aktivität von 2500 KIE/mg erhalten (Gesamtaktivität: 3,22 χ 10 KIE), was einer Ausbeute von 73,5 % entspricht.
120 kg Rinderlunge wurde mit Methanol/CaC^ nach Beispiel 1
aufgeschlossen. Aus 400. 1 des erhaltenen Klarfiltrats wurde das Methanol sorgfältig abdestilliert. Die wäßrige, den
Kallikrein-Trypsin-Inhibitor in roher Form enthaltende Lösung,
wurde mit HCl auf einen pH-Wert von 1,5 angesäuert und auf
ρ eine Säule mit 8 1 porösem Polystyrolharz mit 150 m Oberfläche
pro g (Lewapol 101Ca 9255) aufgebracht. Gesamtaktivität:
152 χ 106 KIE. Die Säule wurde mit 16 1 0,01 N HCl, 16 1 0,02 M EDTA und 10 1 dest. H2O gewaschen. Danach wurde der
Wirkstoff mit einem linearen Gradienten aus 20 1 dest. HpO
und 20 1 80 tigern Methanol eluiert. Die Fraktionen, die den Wirkstoff enthalten, wurden vereinigt, das Methanol abdestilliert
und die Lösung lyophilisiert. Es wurden 25,7 g Festsubstanz mit einer spez. Aktivität von 4200 KIE/mg erhalten (Gesamtaktivität
108 χ 10 KIE), was einer Ausbeute von 71 %
entspricht.
120 g Rinderlunge, nach Beispiel 1 mit Methanol/Calciumchlorid aufgeschlossen, ergab nach Entfernung des.Methanols, Einstellung
des pH-Wertes auf 1,5 und Zentrifugation 67 ml Überstand mit 150 000 KIE.
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ORiGfNAL INSPECTED
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In diese Rohlösung des Inhibitors wurden 10 ml poröses Polystyrolharz
(Lewapol ^Ca 9255 mit 150 m Oberfläche pro g)
eingerührt. Nach 30 Min. wurde das Harz auf der Nutsche abgesaugt und mit 100 ml ¥asser gewaschen. Hierauf wurde das
Harz in eine Lösung von 20 ml Isopropanol, mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt, suspendiert und 30 Min. gerührt. Das Harz wurde
durch Absaugen entfernt und im Filtrat der Inhibitor nach AbdestLlLieren des Isopropanols im Vakuum bestimmt. Ausbeute
123 000 KIE d.s. 82 % der eingesetzten Hemmkapazität.
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Claims (1)
- PatentanspruchVerfahren zum Anreichern bzw. Abtrennen des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors aus diesen enthaltende wäßrigen Lösungen mit Hilfe von Adsorptlonsmitteln und anschließender Desorption, dadurch gekennzeichnet, daß man als Adsorptionsmittel Teilchen von nichtionogenen, wasserunlöslichen« vernetzten Polymerisaten poröser Struktur aus Styrol und Divinylbenzol verwendet« die eine aktive Oberfläche von 10 bis 1000 /g besitzen.Le A 13 622 - 10 -209843/1086
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