DE863249C

DE863249C - Verfahren zum Reinigen von Streptomycin

Info

Publication number: DE863249C
Application number: DESCH318A
Authority: DE
Inventors: Walter A Winsten
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1948-10-02
Filing date: 1949-11-01
Publication date: 1953-01-15

Description

Verfahren zum Reinigen von Streptomycin Die Erfindung betrifft ein neues und verbessertes Verfahren zum Rlzji.nigen von Streptomycin und ein neues und verbessertes Strel)tomycinpräparat.
Die Herstellung, Konzentrierung und Reinigung von Streptomycin sind bekannt und beispielsweise in »The Dispensatory of the United, States of America«, 24. Aufl. (1947), S. 1335/1336, veröffentlicht.
Wie aus dieser Veröffentlichung hervorgeht, muß Streptomycin so gereinigt -,verden, daß es weder Histamin noch histaminähnliche Stoffe, die den Blutdruck senken, enthiilt. Derartige histaminartige Stoffe werden gewöhnlich wäh#rend der Herstellung von Streptomycin durch Streptomyces griseus erzeugt.
Die übliche Prüfung (standard test) auf Beseiti-Z, Clung von Histamin und histaminartigen Stoffen besteht darin, daß eine Katze als Versuchstier mit Natriumpentobarbital narkotisiert und das Streptomycin oder ein Komplex davon der Katze in einer Menge von 3000 Einheiten je Kilogramm des Körpergewichtes des Versuchstieres eingespritzt wird. Diese Einheit entspricht der antilbiotischen Wirksamkeit eines Mikrogramms der Base von Streptomycin. Ein Streptomycinpräparat wird zur Injektion in den menschlichen Körper für geeignet angesehen, wenn sein Gehalt an histamina#rtigen Stoffen so weit verringert worden ist, daß die Injektion bei dem genannten Gehalt eine Erniedrigung des Blutdruckes in der behandelten Katze hervorruft, die gleich oder geringer ist als die Erniedrigung des Blutdruckes, die durch o,i Miikrogramm Histamin je Kilogramm des Körpergewichtes der behandelten Katze erzeugt wird. Es wurde gefunden, daß die Konzentration an Histain,in, oder histaminäbn#liohtn Stoffen, in Streptoni#C. ii#iäparat-en auf - oder unter den genannten Gehalt 1 - der - Eignungsprüfung verringert werden kann, indem eine Lösung von unreinem Streptomycin, vorzugsweise eine wäßrige Lösung, mit Brom, vorzugsweise bei einem pi-Wert unter 7, ..,zur Reaktion gebracht wird. Die Reaktion kann bei übl'icher. Zimmertemperatur von 2o bis 25' und bei üblichem Atmosphärendruck von 76o mm Quecksilbersäule durchgeführt werden. Die Rückgewinnung an Streptomycin aus der Reaktion ist hoch, und sie beträgt praktisch go bis ioo*CTewichtsprozent des Streptomycins im unreinen Ausgangs-.material.
DJe Erfindung wird iauf keine besondere Theorie der Reaktion beschränkt. Während des. Reaktionsverlaufes, der gewöhnlich 15 Min. beträgt, findet ein wesentlicher Abfa * 11 im pH-Wert des Reaktionsgemisches statt. Es wird angenommen, daß dieser Abfall sich aus der Oxydation des Histamins oder der histaminartigen Stoffe ergibt, wobei Bromwasserstoffsäure gebildet wird. Die Reaktion kann aber auch in einer Bromierung des Histamin-s oder der histaminartigen Verunreinigung bestehen.
Als Ausgangsmaterial wird vorzugsweise eine wäßrige - -Lösung von unreinem Streptomycin benutzt, die einen,'pii-Wert unter 7, wie beispielsweise 5,7, hat. Dies isst nicht notwendig, wenn Brom benutzt wird, da bei der Reaktion mit Brom der ursprüngliche p11-Wert, der 7 seki kann, schnell auf einen Wer't unter 7 erniediligt wird. Vorzu#gsweise wird- während id-"s ganzen Reaktionsverlaudes- in der Reaktionslösung ein PH-Wert unter 7 aufrecht-;erhalten oder damit eehr schnell- nach dem Beginn des Reaktionsablaufes begonnen.
Weitere Ziele und Merkmale sowie Abänderungen der Erfindung werden in der nachstehenden. Beschreibung angegeben, in der die Erfindung durch einige Ausführungsbeispiele, auf die sie jedbch nicht beschränkt ist, näher veranschaulicht wird. Ausgangsmateria1 i Wenn Streptomy_cin durch Fermentierung eines geeigneten Mediums mit S. griseus hergestellt wird, so sind in der schließlIch erhaltenen rohen Gärbrühe auch die histaminartigen Substanzen vorhanden. Um aus einer derartigen Brühe Strt#ptornycin praktisch frei von histaminartigen Verunreinigungen zu erhalten, ist es zweckmäßig, durch eine Reihe bekannter Maßnahmen, die jedoffi selbst nicht dazu dienen, das Streptomycin von h#staminartigenVerunreinigungen zu befreien, ein Streptomycidkonzentrat herzustellen. Nach der Herstellung eines derartigen Streptomyr-inkonzentrates wird es erfindungsgemäß behandelt, um die histaminartigen \Terunrei,iiigungen zu entfernen und/oder zu zerstören-, ahne jedoch in einem wesentlichen Ausmaß das Streptomycin sellyst schädlich zu beeinflussen oder zu -zerstören.
Für #di-, Konzentration der ursprünglichen, unreinen oder re-hen Kulturbrühe sind verschiedene Verfahren bekannt. Nach einem beispielsweisen Verfahren kann das Streptomycin aus-der ursprünglichen rohen-Brühe auf Silicagel adgdibiert werden. Das 'Gef Wild dann abgeschieden und mit Wasser, das mit Salzsäure oder -einer anderen geeigneten Säure angesäuert worden isti-ge-was,#hen, wodurch das adsorbierte Streptomycin als Hydr.oc-hloridsalz ausgezogen wird, wenn Salzsäure benutzt worden. ist. Die ierhaltene Eluierflüssigkeit wird neutralisiert, das Streptomycin aus der neutralen. Eluierflüssig# keitauf Aktivkohle adsorbiert und die Aktivkohle durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgeschieden. Das - Streptomycin wird von der Aktivkohle mit wäßrigem Aceton, das mit Salzsäure oder einer anderen, geeigneten Säure angtsäuert worden, ist, eluiert. Die Elu.ie#rflüs-siglzeit wird dann neutralisiert und- schlidlich durch irgendein geeignetes Verfahren 'konzentriert,. um ein Präparat zu erhalt-en, das je Xubikzentinieter 68ooo Einheiten -Streptomycin enthält. - Das erhaltene neutrale Konzentrat kann als eines der Reaktionsmittel benutzt werden, oder es kann auch vor der Reaktion angesäuert werden, wie beispielsweise auf einen pII-Wert von 5,7- Wenn, es erwünscht ist, das genannte neutrale Konzentrat vor der Reaktion anzusäuern, so kann- es mit Salzsäure erfolgen. Ausgangsmateria:1 2 Nach eine'r anderen Ausführungsform kann das Streptotnycin aus der ursprünglichen rohen Gärbrühe durch Silicagel adsorbiert, das abgeschiedene Crel mir angesäuertern,- Wasser- el*uiert,- -die--E-I#iiierflüssigkeii neutralisiert und auf etwa iooo bis io ooo Einheiten je I#-,ubikzentimeter konzentriert werden. Dieses Ausgangsmaterial. kann angesäuert werden-, ehe es als eines der Reaktionsmittel be- nutzt wird. Bromreaktionsmittel i Dies ist Brornwasser, wie es als Bromprüflösung benutzt wird. Es enthält 2 ccm Brom, gelöst in iooccm destilliertem Wasser.
Bromreaktionsmittel 2 Dies ist eine Lösung von Brom in Chloroform oder einem anderen organischen Lösungsmittel. Beispiel I Die Reäktionsmit-t-el bestehen aus dem Ausgangsmateriial i und dem genannten.Bromwasser im Verhältnis von 5 eL-m des Ansgangsmaterials 1 (68 ooo Einheiten je Kubikzentimeter Streptomycin,) -zu 15 ccm des genannten Bromwassers. Wie bereits oben bemerkt, - kann das genannte - Ausgangsmaterial i neutral sein oder einen pli-Wert unter 7, wie einen pH-Wert- von 5-,7, haben, wenn- es als Reaktionsmittel benutzt wird.
Diese Reaktionsmittel -werden miteinander gemischt und 15 Min- bei normaler Zimmertemperatur von 2o bis 25' bei normalem Atmosphärendruck aufeinander zur- Einwirkung gebracht. Das Gemisch kann gegebenenfalls während dieser Reaktionszeit von 15 Min. auch fortlaufend mechanisch durchgerührt werden.
Während der Reaktion fällt, -,venn der ursprünliche PH-Wert des Ausgangsmaterilals i der b 5,7 ist, pH-Wert der Reaktionsmasse oder des Reaktionsgernisches auf 2,1.
Die Reaktionsmasse wird dann mit Natriumlivdroxyd neutralisiert.
Nach der Neutralisation ist oft eine vergängliche purpurrote Farbe zu beobachten, die bald in eine trübe Farbe umschlägt.
Das überschüssige freie Brom wird dann aus der neutralen wäßrigen Lösung des gereinigten, Streptomycin,s durch Extraktion mit Chloroform im Verhältnis Von 20 ccm Chloroform je 15 ccm Bromwas-ser entfernt, was bei normaler Zimmertemperatur und, normalem Druck durchgeführt werden kann. Die Lösung des Broms in dem Chloroform wird von der wäßrigen Streptomycinlösung durch übliche Mittel bei normaler Zimmertemperatur und normalem Druck getrennt.
Etwaige Spuren von ChIoroform in der wäßrigen Str-eptomycinlösun '- werden durch Verdampfen bei verringertem Druck von 2o mm Ouecksilbersäule bei 5o' oder darunter entfernt.* Die wäßrige Streptomycinlösung wird dann zum Absetzen 24 Stunden bei 5' zur Seite gestellt. Hierbei scheiden sich Schwebestoffe ab, die aus der neutralen wäßrigen Lösung des gereinigten Streptomycins entfernt werden.
Das so behandelte Streptoimycin besteht,die obenerwähnte Prüfung auf histaminartige Substanzen und kann für Injelztions#zwcck-e oder zur Herstellung von Komplexverbindungen usw. benutzt werden.
Durch Versuche wurde festgestellt, daß 93 bis ioo Gewichtsprozent des in dem ursprünglichen unreinen Ausgan-smaterial vorhandenen Streptomycins in der wäßrigen Lösung des gereinigten Strept,omycin,s unzz,5rsetzt zurückbleiben, -,venn nach diesem Beispiel gearbeitet wird. Bei spiel 2 Das Ausgangsmaterial i wird fortlaufend mechanisch mit einer Lösung von Brom in, Chloroform durchgerührt, wobei die oben im Beispiel i erwähnten Teilmengen des genaAnten, Ausgangsmaterials i und des Broms benutzt werden. Die Real,tionszeit und Temperatur sind dieselben wie im Beispiel i.
Das Chloroform und das darin. gelöste, nicht in Reaktion getretene Brom werden entfernt -und di"-Reste des Chloroforrns in der wäßrigen Lösung des gereinigten Str-eptomycilis wie im Beispiel i beseitigt; auch die Maßnahme des Absetzenlassens gemäß Beispiel i wird angewendet und das erhaltene Sediment entfernt. Beispiel 3 Es wird das Ausgangsmaterial 2 benutzt; im b el übrigen ist das Verfahren dasselbe wie in Beispiel i oder 2. Das Streptomycin wird dann aus der neutralen wäßrigen Lösung des gereinigten Streptomycins auf Aktivkohle, adsorbiert. Diese Aktivkohl-e wird abgetrennt und mit an,--esäuertem wäßrigern Aoeton eluiert, und die Eluierflüssigkeit kann als Endprodukt neutralisiert werden, das konzentriert oder in anderer Weise behandelt werden kann. Auf diese Weise wird ein reineres Endprodukt erzeugt. Auch verschieden-, Verunreinigungen, wie anorganische Bromide und bromierte Verunreinigungen, werden auf der Aktivkohle nicht adsorbiert.
Es ist somit vorteilhaft, die Aktivkohle als Adsorptionsmittel nach der Reaktion mit dem Brom zu verwenden.
Wie bben angegeben, kann das Ausgangsmaterial eine wäßrig-- Lösung von StreptQmycin beliebiger Konzentration und Reinheit sein.
Das Brom hat für die Zwecke vorliegender Erfind'ung eine äußerst vort-eiffiafte und selektive Wirkung.
Jod reagiert nicht mit den histaminartigen Stoffen.
Natrin-mhypochlorit (NiaOCI) ist nicht wirksam,er als Brom, und es bewirkt einen größeren Verlust an. Streptomycin.
Wenn Natriumhypochlorit benutzt wird, wird das Ausgangsmaterial vorzugsweise angesäuert, z. B. mit Salzsäure, wodurch in dem Reaktionsgernisch unterchlorige Säure gebildet wird. Die oxydierenide, Wirkung von Natriumhypochlorit in wäßriger Lösung, insbesondere in angesäuerter wäßriger Lösung, ist bekannt.
Vorstehen,d sind einig-, bevorzugte AusfÜhrungsformen der Erfindung beschrieben, doch sind-ziahlreiche Abänderungen, Weglassungen und Zusätze möglich, so daß die- Erfindung nicht auf die angeführten Einzelheiten beschränkt ist.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: i. Verfahren zum Reinigen von histaminr artige Stoffe enthaltendem Streptomvcin, da-!durch -gekennzeichnet, idaß das Strcptomvcin, insbesondere in Form ein-er wäßrigen Lösung, mit Brom gemischt und die, hi#staminartigen Stoffe in dem erhaltenen Gemisch mit dem Brom zur Reaktian# gebracht -werden.
2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion, des Broms mit den histaminartigen Stoffen bei etwa 2o bis 251 durchgeführt, nach beendeter Reaktion# das Regl-,tionsgernisch zur Bildung eines Sedimentes, zweckmäßig bei tieferen Temperaturen von ,beispielsweise 5', zur Seite gestielIt und,der flüssi-e Teil des Reaktionsgemisches, der das gereinigte Streptomvci#n# enthält, von, dem Sediment getrennt wird.. 3. Verfahren nach Anspruch i, insbesondere zwecks HerstellunIg von für Injektion,szwecke geeignetem Streptomycin, dadurch gekennzeichriet, daß die wäßriO#e, histaminartige Stoffe entb haltende Streptomycinlösung mit Brom im Überschuß behandelt wird, das überschüssige Brom nach Beendigung ider Reaktion entfernt, ,der erhaltene Rückstanddes Reaktionsgemilsches zwecks Bildung eines Sedimentes zur Seite gestellt undder flüssige- Teil dier erhaltenen Rückstan'des von dein Sediment getrennt wird. 4. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekenn-zeichnet, daß aus der wäßrigen, histaminartige Stoffe enthaltenden Strept6myoinlösung das Streptomycin zunächst auf Silicagel a,6-sorbiert, das adsorbierte Streptomycin mittels einer angesäuerteen was,serhaltigen Ffüssigkeit extrahiert und eine erste Extraktions- oder Eluierflüssigkeit erzeugt, dann das Streptomycin aus dieser ersten EluierflüssIgkeit quf Aktivk-ohle adsorbiert, das auf ider Aktivkohle adsorbierte, Strepto-mycin mittels 44ner angesäuerten wasserhaltigen Flüssigkeit -eluiert und eine zweite Eluierflüssigkeit gebildet, idie zweite Elu;ierflü,sisiiigkeit mit Brom #,gemischt und #die histaminartIgen Stoffe idieses Gemisches mit dem Brom zur Reaktiongebracht wer-den. 5. Verfahren nach Ansprach i, dadurch gekennmichnet, daß aus der wäßrigen, histaminartige Stoffe enthaltenden Streptomycinlös-ung das Streptomycin auf Silicagel adsorbiert, das auf dem Silicagel adsorbierte Streptomycin mittels einer wäßrigen Flüssigkeit eluiert und eine Elinierflüssigkeitgehädet"die Eluierflüssigkeit -mit Brom gemischt und icke histaminartigen Stoffe dieser Eluierflüg.sIgkeit miftdem genannten Brom zur Reaktion gebracht werden und ,dann das Streptomyoin ans dem erhaltenen Reaktionsgemitscli Kauf Aktivkohle adsürbiert wird. 6. Verfahren nach Anspruch i, dadu-rch gekennzeichnet, daß d-ie wäßrige, histaminartige Stoffe enthaltende. Streptomycinlösung mit Brom gemischt wird und in dem erhaltenen Gemisch die histaminartigen Stoffe mit dem BToin zur Reaktion gebracht werden und aus dem genannten Reaktionsgemisch das Streptomycin, auf Aktivkohle adsorbiert wird. 7. Verfahren nach Anspruch i bis 6, dädurch gekennzeichnet, daß für die Reaktion mit den histaminartigen, StoAen deT S'treptomycinlö,sting an Stelle von Brom ein anderes Oxydationsmittel benutzt wird, demgegenüber das Streptomycin praktisch inert oder zumindest weniger reaktionsfähig ist - als die histaminattigen Stoffe. 8. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, #daß ein wäßriges Konzentrat des histaminartige Stoffe enthaltenden Streptomycin,s mit Brom gemischt und mit diesem zur Reaktion gebracht und hier-bei ein Konzentrat benutzt wird, das praktisch wenigstens iooo Einheiten an Streptomycin je Kuhikzentimeter enthält, die genannten Reaktionsmittel etwa in einem Mengenverhältnis von 5 ccm des genannten Konzentrates zu 0,3 ccm Brom angewendet werden, die Reaktion bei etwa :2o bis 25' durchgeführt wird, das Reaktionsgemisch neutralisiert, das überschüssige Brom aus dem Reaktionsgemisch entfernt, das Reaktionsgemisch zwecks Erzeugung eines Sedirnentes beispielsweist 24 Stunden bei beispielsweise 5" zur Seite gestellt und dann der flüssige Teil des Reaktionsgemisches von, dem Sediment abgeüennt g. Verfahren Wird. ' nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß das Streptomycin aus der rohen Gärbrühe auf Silicagel adsorbiert, das Silicagel von der Gärbrühe getrennt, das abgetrennte Gel mit angesäuertem Wasser elulert und eine Eluierflüssigkeit gebildet, die Eluierflüssigkeit neutralisiert und-, diese auf wenige stens ic)oo Streptomycineinheiten je Kubikzentimeter konzentriert, die genannte EluierflüsisIgkeit bei etwa :2o bis :25' mit Brom gemischt und zur Reaktion gebracht und hierbei das Brom im Überschuß angewendet wird, das Reaktionsgemisch neutralisiert, das überschüssIge Brom entfernt, dann das Streptiomycin aus dem bromfreien Reaktionsgemisch auf Aktivkohle adsorbiert, von letzterer das Streptomycin durch eine anges#äuerte wäßrige Flüssigkeit eluiert und die erhaltene Eluierflüssigkeit neutralisiert wird.