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Verfahren zur Reinigung des .Antibiotikums 106-7 Die Erfindung bezieht
sich auf die Reinigung des Antibiotikums io6-7.
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Antibiotikum io6-7 ist ein neues Antibiotikum, welches das Wachstum
verschiedener pathogener Bakterien hemmt und in der Patentschrift 933
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beschrieben ist.
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Die Erfindung zielt auf ein Verfahren zur Reinigung dieses Antibiotikums
sowie auf die Herstellung von Konzentraten dieses Antibiotikums ab, die eine erheblich
höhere Aktivität besitzen. Weitere Ziele und Zweckangaben der Erfindung gehen aus
der nachfolgenden Beschreibung hervor.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung reinigt man Antibiotikum io6-7, indem
man eine wäßrige Lösung von rohem Antibiotikum io6-7 mit einem stark saunen Kationenaustauschharz
behandelt. Hierbei wird das Antibiotikum adsorbiert, worauf man es mit einer Base
eluiert. Aus den so gewonnenen Eluaben kann man Produkte von erheblich höherer Aktivität
gewinnen, die :etwa die 3ofache Aktivität des Ausgangsmaterials besitzen.
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Zur Durchführung dieser ausgezeichnet wirkenden Adsozption bringt
man nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung eine angesäuerte wäßrige
Lösung des rohen Antibiotikums genügend lange in innigen Kontakt mit einem Salz
eines stark sauren Kationenaustauschers, um das Antibiotikum zu adsorbieren. Um
unter optimalen Bedingungen maximale Ausbeuten zuerhalten, empfiehlt es sich, eine
wäßrige Lösung des Antibiotikums zu verwenden, die ein pH von etwa i bis 5,5 besitzt.
Gewöhnlich findet man je nach dem jeweils verwenderen
Harz, daß
besonders gute Resultate erzielt werden, -wenn man das pH der Lösung auf etwa 2
einstellt.
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Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Ver-£ahmens sind als Adsorptionsmitbel
die stark sauren Kationenaustauschbarze besonders gut verwendbar, die kerngebundene
Sulfonsäuregruppen oder Methylensuüfonsäuregrupp,en enthalten. So sind beispielsweise
Phenolformaldehydharze mit kerngebundenen Sulfonsäuregruppen oder sulfonierte aromatische
Kohlenwas.serstoffpolymiere, wie sulfonierte Polystyrolharze, gut geeignet. Im Handel
erhältliche Harze dieser Art sind heispielswewse »Ambarlibe IR 12o«, »Dowex 5o«
und »Duolite C- i o«.
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Salze dieser stark sauren Kationenaustauschharze sind recht :gute
Adsorptionsmittel für Antibiotikum -o6-7. Die Haxze werden für ihre Verwendung zur
Adsorption von Antibiotikum 1o6-7 zweckmäßig vorbereitet, indem man sie mit einer
Base behandelt, wie einem Alkali- oder Erdalkalihydroxyd, und dann das überschüssige
Alkali mit Wasser herauswäscht. Gewöhnlich @empfiehlt es sich, diese stark sauren
Harze in Natriumform zu verwenden.
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Die Adsorption von Antibiotikum -o6-7 -kann auf verschiedene, an sich
bekannte Weise bewirkt werden. 'So kann die Adsorption durch bloßes. Rühren, des
Adsorptionsmitbels mit einer angesäuerten Lösung des Antibiotikums durchgeführt
werden., bis das Antibiotikum adsorbiert ist. Das Harz kann dann von der Lösung
abgetrennt und mit Wasser ausgewaschen werden, -worauf man das Antibiotikum basisch
@eluiert. Es ist indessen im allgemeinen zu !empfehlen, die Adsorption so durchzuführen,
daß man die angesäuerte Lösung des Antibiotikums durch seine Säule des Adsorptionsmittels
hindurchleitet. Das Säulenverfahren ist deshalb vorteilhaft, weil @es so leicht
möglich ist, durch überwachu.ng der abströmenden. Flüssigkeit die zur Erreichung
einer vollständigen Adsorption notwendige Kontaktzeit sowie die Durchbruchsbeladung
zu bestimmen. Nachdem die Harzsäule -gesättigt ist, wird sie zweckmäßig mit Wasser
ausgewaschen, um irgendwelche schwach adsorbierte oder nicht adsorbierbe wasserlösliche
Verunreinigungen- zu entfernen und dann zur Gewinnung des Antibiotikums basisch
elucert.
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Nacheiner weiteren Ausführungsform der Erfindung wird Antibiotikum
-o6-7 leicht von dem Adsorptionsmitbel abgetrennt, indem. man dieses in innigen
Kontakt mit der wäßrig-en Lösung einer Base bringt. Obgleich als Eluierungsmitbal
verschiedene lorganische oder anorganische Basen ge-.ei:grnet sind, empfiehlt sich
insbesondere die Verwendung von Ammoniumhydroxyd. Beim Eluieren des Antibiotikums
beobachtet man, daß dieses erst elulert wird, wenn das pjq des Eluntes auf etwa
5,5 !bis 6 angestiegen ist. Im wesentlichen die gesamte Aktivität wird bei einem
pH. zwischen etwa 6 und t9 @eluiert. Diejenigen Anteile des Eluates, die das Antibiotikum
-enthalten, können. dann durch Gefriertrocknung in feste Form übergeführt werden.
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Die weitere Reinigung des Antibiotikums erreicht man durch Wiederholung
der Adsorptions- und Eluationsstufe, wobei man angesäuerte Eluate als Ausgangsmaterial
verwendet. Auf diese Weise kann man ein Produkt von einer Aktivität von etwa 170
:Stneptomycineinheiten je Milligramm gewinnen, bestimmt unter Vierwendung von Micrococcus
pyogenes ;war. aureus.
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Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der praktischen Ausführung
der Erfindung. Beispiel 1 Das PH von i oo ccm der filtrierten Brühe, welche das
Antibiotikum -o6-7 enthält, wurde durch Zusatz von q. ccm 2, 5n H Cl lauf pH 1,
5 reingestellt. Die Brühe wurde mit einer Geschwindigkeit von 25 ccm/Stun-de durch
eine Säule geleitet; die etwa 6 g Amberlibe IR-I20 (Sulfonsäureharz) in Natriumform
enthält. Das Antibiotikum blieb in der Säule zurück, die mit 50 ccm Wasser
ausgewaschen wurde. Eine Eluation der Aktivität erfolgte mit o, i n-N H4 O H. Wenn
q.5 ccm Flüssigkeit durch die Säule hindurchgeströmt waren, stieg das pi von 5 auf
'6, und es fand sich im Eluat Aktivität. Im wesientlichen die ,gesamte Aktivität
wurde zwischen pH '6 und io in -etwa 2o ccm Flüssigkeit eluiert. Die lyophyliAerben
Feststoffe aus den einzelnen Schnitten in diesem PH-Bereich hatten Aktivitäten .von
5o bis 1222 (Die Aktivitäten wurden nach ,der Zylinderplatbenmethode unter Verwendung
von M. pyoganes war. aureus und eines StreptomycinstandaTds bestimmt.) Die oben
verwendete Fermentationsbrühe kann wie folgt hergestellt werden: 3,21 eines wäßrigen
Mediums, welches 3% Sojabohnenmehl, 2% Dextrose, 0,750/0 lösliche Schlempiebiestandteile
und o,25% NaCl enthielt, wurden meinen 5-1-Ferm@enber eingebracht. Das Medium wurde
bei 12o° in. 112 Stunden sterilisiert und nach dein Abkühlen mit Zoo ccm eines vegetativen
Wachstums von Streptomyoes 1o6-7 beimpft. Das Medium wurde 96 Stunden unter Beleben
und Rührren bei 28,5° bebrütet. Die Aktivität der filtrierten Brühe (2,571) wurde
mittels -der Zyhnd@explatteaimethode unter Verwendung von M. pyogenes war. aureus
und eines Streptomycinstandards bestimmt. Diese Brühe hatte eine Aktivität von ioo
Streptomycin-Einheiten je Kubikzentimeter, wenn man zur Bestimmung M. pyogenes war.
aureus verwendete (etwa 5 Einheiten/mg Trockenstoff der Brühe).
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Beispiel 2 Eine das Antibiotikum io6-7enthaltende Fermentationsbrühe
wurde fltiert, um das Mycel zu entfernen, darauf mit Aktivkohle behandelt, filtriert
und der Gefriertrocknung unterworfen. Die so erhaltenen Feststoffe hatten eine Aktivität
von etwa io Streptomycin-Einheiten je Milligramm (bestimmt mittels M. pyogenes war.
aureus).
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io2g dieses Materials wurden in 25ooccm desr;llierbeni Wasser gelöst
und durch Zusatz von i oo ccm 2, 5 -H Cl auf sein: PH von 1, 5 gebracht. Eine schwache
Ausfällung, welche sich beim Ansäuern bildete, wurde ,abfiltriert.
2400
ccm des Filtrates mit etwa 949 Feststoff wurden durch eine Säule geleitet, die etwa
i oo g Amberlite IR-i2o (Sulfonsäureharz) in Natriumform enthielt. Die antibiotische
Substanz wurde auf der Säule zurückgehalten und mit i 1 destilliertem Wasser ;gewaschen.
Dann wurde die Säule mit o,2n-NH40H @eluiert. Wenn etwa 6ooccm Flüssigkeit aus der
Säure abgeströmt waren, war das pl.j von 5 auf etwa 7 angestiegen und fand sich
im Eluat antibiotische Aktivität. Etwa 68% der ursprünglichen Aktivität wurden zwischen
PH 7 und 8 in etwa 25o ccm Lösung @eluiert. Die einzelnen El=tfraktiainien (von
je 5o ccm) in diesem Bereich wurden lyophylisiert und ihre antibiotische Aktivität
bestimmt. Die Aktivitäten in Einheiten vom M. pyogenes var. aureus mit einem Streptomycin-Standard
waren folgende:
| Feststoffe Aktivität 'in |
| Eluat Nr. PH Streptomycin- |
| g einheiten/mg |
| 6 7 0,9 42 |
| 7 7 1,1 145 |
| 8 7 =,z5 155 |
| 9 7 1,0 170 |
| =o 8 0,95 95 |
Beispiel 3 Ausgangsmaterial für diesen Versuch war Antibiotikum io6-7 von geringerer
Wirksamkeit, welches eine Aktivität von 27 Streptomycin-Einheäten je Milligramm
(bestimmt mittels M. pyogenes var. aureus) hatte.
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5
g dieses Materials wurden in 25o ccm destilliertem Wasser
gelöst und mit 5 ccm
2,5 n-H Cl auf ein pH von 3,7 angesäuert. Die filtrierte
Lösung wurde mit einer Geschwindigkeit von
30 ccm/Stunde durch leine Säule
geleitet, die 25 g Amberlite IR-I20 (Sulfans,äureharz) in Natriumformenthielt. Die
Säule wurde mit 25o ccm destilliertem Wasser gewaschen. Die Eluation erfolgte mit
in-NH40H. Wenn
50 ccm Flüssigkeit .aus der Säule abgeströmt wamen, war das
p,1 von 7 auf 7,6 gestiegen und fand sich antibiotische Aktivität im Eluat. Im wesentlichen
,die gesamte Aktivität strömte aus der Säule in etwa
7 0 ccm Eluat ab, welches
ein pH von etwa 7,6 hatte. Die einzelnen Eluatfraktionen wurden lyophylisvert und
ihre antibiotische Aktivität bestimmt (unter Verwendung von M. pyogenes var. aureus).
| Volumen Feststoffe Aktivität in |
| Eluat Nr. PH Streptomycin- |
| ccm mg einheiten/mg |
| 6 1o 7,6 52 140 |
| 7 10 7,6 55 140 |
| 8 25 7,6 16o 170 |
| 9 25 7,6 Igo 153 |
| 10 25 8 - zo 220 <Ioo |
| 1z 50 >=O - keine |