DE1253868B - Verfahren zur Gewinnung von Heparin - Google Patents

Description

DEUTSCHES ^Ht PATENTAMT DeutscheKl.: 30 h-2/04

AUSLEGESCHRIFT

Nummer: I 253 868

Aktenzeichen: R 36742IV a/30 h

1 253 868 Anmeldetag: 7.Dezember 1963

Auslegetag: 9. November 1967

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Heparin, dem bekannten natürlich vorkommenden Antikoagulierungsmittel, welches durch Extraktion aus tierischen Geweben, wie beispielsweise Rinderdünndarm, Rinderlunge, Schweineduodenum, Schweineleber, Schweinedarmmucosa u. dgl., erhalten wird.

Bei den üblichen Verfahren zur Gewinnung von Heparin wird das tierische Gewebe in der Anfangsstufe mit einer heißen wässerigen Salzlösung in Berührung gebracht, um das Heparin aus den Zellen der Gewebe herauszulösen. Der Heparingehalt des anfallenden Mediums ist äußerst niedrig, und bisher bekannte Gewinnungsverfahren haben sich nicht als genügend wirksam erwiesen, um die Gewinnung hoher Prozentgehalte an Heparin zu gewährleisten. Außerdem fällt das Heparin mit verschiedener Reinheit an, so daß eine weitere Reinigung erwünscht ist.

Nach einem älteren Vorschlag gemäß der deutschen Patentschrift 1 195 010 hat man schon Heparin gereinigt, indem man es an Di- oder Triäthylaminoäthylcellulose adsorbierte und mit unter l,8n-Salzlösungen eluierte.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist nun dadurch gekennzeichnet, daß das Heparin aus wässerigen Lösungen bei pH 7 bis 9, die 0,1 bis 1,25 Mol/1 Alkali-, Erdalkali- oder Ammoniumsalze enthalten, an einen Anionenaustauscher, der aus 96 bis 99,9 Molprozent eines aromatischen Monovinylkohlenwasserstoffs und 4 bis 0,1 Molprozent eines aromatischen Divinylkohlenwasserstoffs mit organischen Ammoniumgruppen an den aromatischen Kernen erhalten wurde, adsorbiert wird und nach Waschen des mit Heparin beladenen Anionenaustauschers mit Wasser oder vorzugsweise mit einer 1- bis l,6molaren Salzlösung das Heparin mit einer 1,9- bis 2,3molaren Salzlösung eluiert wird.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann irgendein heparinhaltiges Material, wie tierisches Gewebe, ein Extrakt solcher Gewebe, oder wie es in irgendeiner Stufe eines Heparingewinnungsverfahrens anfällt, verwendet werden.

Die an die aromatischen Kerne des Copolymers gebundenen Ammoniumgruppen können die Formel

C_bH₂ η — N-R₂

haben, in welcher η 1 bis 4 ist, R₁, R₂ und R₃ Kohlenwasserstoffgruppen sind und Y ein Anion ist, wobei das Copolymer mindestens eine dieser Substituenten-Verfahren zur Gewinnung von Heparin

Anmelder:

Riker Laboratories, Inc.,
Northridge, Calif. (V. St. A.)

Vertreter:

Dipl.-Ing. K. Lengner, Patentanwalt,
Hamburg 26, Jordanstr. 7

Als Erfinder benannt:
Robert Ear Williams,
Sherman Oaks, Calif. (V. St. A.)

Beanspruchte Priorität:
V. St. ν. Amerika vom 10. Dezember 1962
(243 663)

gruppen auf je fünfzehn aromatische Kerne enthalten kann. Als KohlenwasserstofFgruppen kommen beispielsweise niederes Alkyl, hydroxyniederes Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl u. dgl. in Frage. Y kann ein von Heparin verschiedenes austauschbares Anion, beispielsweise Hydroxyl, Chlorid, Sulfat, Nitrat, Bicarbonat, Acetat u. dgl. sein. Quaternäre Ammoniumanionenaustauschharze dieses Typs sind in der USA.-Patentschrift 2 591 573 beschrieben und werden nach den dort angegebenen Verfahren hergestellt.

Die erfindungsgemäß verwendeten Anionenaustauscher sind Copolymere aus aromatischen Monovinylkohlenwasserstoffen, wie Styrol, o-, m- und p-Methylstyrol, o-, m- und p-Äthylstyrol u. dgl., mit aromatischen Divinylkohlenwasserstoffen, wie Divinylbenzol, Divinyltoluolen, Divinylxylolen, Divinyläthylbenzolen u. dgl. Es werden Copolymere von Styrol und Divinylbenzol bevorzugt. Bei Aufarbeitung eines Homogenisats aus einer wässerigen Salzlösung und tierischem Gewebe wird vorzugsweise ein Copolymer aus einem Gemisch aus mindestens 98 Molprozent aromatischem MonovinylkohlenwasserstofF und nicht mehr als 2 Molprozent aromatischem DivinylkohlenwasserstofF verwendet.

Es wurde gefunden, daß Styrol-Divinylbenzol-Copolymere, welche Methylentrimethylammoniumchloridgruppen und Methylendimethylhydroxyäthylammoniumchloridgruppen enthalten, bevorzugt werden. Solche Harze mit Strukturen, welche durch

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Copohmerisation eines Gemisches aus 98 bis 99 Molprozent Styrol und 2 bis 1 Molprozent Divinylbenzol gebildet werden, sind besonders wirksam.

Gemäß der Erfindung wird ein heparinhaltiges Material zuerst in innige Berührung mit einem wässerigen Medium gebracht, um eine Lösung oder eine feinverteilte gleichmäßige Suspension zu bilden. Das pH des Mediums sollte in dem Bereich - on etwa 4 bis etwa 10 liegen, wobei ein pH-Bereich von 7 bis 9 besonders wirksam ist. E:> wu.de gefunden, daß das wässerige Medium ein wasserlösliches Alkalimetall-, Erdalkalimetall- oder Ammoniumsalz einer Säure oder Gemische solcher Salze enthalten muß, wobei brauchbare Salze die wasserlöslichen Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Barium- und Strontiumsalze von Mineralsäuren, wie beispielsweise Chlorwasserstoff-, Salpeter-, Schwefel-, Phosphor-, Kohlensäure u. dgl., und niederen Alkylcarbonsäuren, wie beispielsweise Essig-, Propionsäure u. dgl., umfassen. Es wurde gefunden, daß Alkalimetall- und Ammoniumnitrate und -chloride besonders wirksam sind. pH-Einstellung erfolgt am zweckmäßigsten durch Verwendung einer Säure oder Base, welche dasselbe Anion bzw. Kation wie das in dem wässerigen Medium vorhandene Salz hat. Es können aber auch andere saure oder basische Substanzen verwendet werden.

Das wässerige Medium muß eine wirksame Menge eines Salzes der oben beschriebenen Klasse oder Gemische solcher Salze enthalten, d. h. eine Menge gelöster Salze in dem Bereich, über welchem das Gleichgewicht zwischen Heparin, das an das Harz gebunden ist. und Heparin, das in Lösung bleibt, gewährleistet, daß mindestens 50% der Heparinaktivität an das Harz gebunden wird. Der Bereich von Salzkonzentrationen, über welchen mindestens 50% des in dem wässerigen Medium vorhandenen Heparins von dem Harz aufgenommen und daran gebunden werden, schwankt mit dem besonderen vorhandenen Salzsystem, aber kann durch ein einfaches Testverfahren leicht bestimmt werden, bei welchem eine Standardheparinlösung bekannter Konzentration in einem wässerigen Medium, welches gelöstes Salz enthält, mit einem Überschuß des quaternären Ammoniumanionenaustauschharzes, das bei dem Gewinnungsverfahren verwendet werden soll, bei pH-Bedingungen, die bei dem Verfahren verwendet werden sollen, im Verlaufe von 2 Stunden gerührt wird. Das Harz wird entfernt, und die Heparinstärke der überstehenden Flüssigkeit wird bestimmt. Wenn die überstehende Flüssigkeit weniger als 50% der ursprünglich in der Standardlösung vorhandenen Heparinaktivität enthält, ist eine wirksame Menge gelöstes Salz in dem wässerigen gelösten Medium, das bei dem Test verwendet wurde, vorhanden. Bei den besonders wirksamen Alkalimetall- und Ammoniumnitraten und -Chloriden wurde gefunden, daß mindestens 0,1 Mol gelöstes Salz pro Liter Lösung vorhanden sein sollte. Wenn ein Alkalimetall- oder Ammoniumnitrat verwendet wird, zieht man es vor, daß die Salzkonzentration etwa 1 Mol pro Liter nicht überschreitet, und bei Alkalimetalloder Ammoniumchloriden sollte die gelöste Salzkonzentration etwa 1,25 Mol pro Liter nicht überschreiten, um die beste Heparinaufnahme durch das Harz zu gewährleisten.

Bei Ausführung des Verfahrens nach der vorliegenden Erfindung wird ein Überschuß des quater-

nären Ammoniumanionenaustauschharzes zu dem wässerigen Salzmedium, welches rohes heparinhaltiges Material in Lösung oder Suspension enthält, zugesetzt. Das Gemisch wird gerührt, um eine verhältnismäßig gleichmäßige Dispersion der Harzteilchen zu erhalten, bis zwei aufeinanderfolgende Proben der überstehenden Flüssigkeit bei der Prüfung im wesentlichen gleiche Werte der Heparinaktivität zeigen, wodurch angezeigt wird, daß Gleichgewicht

ίο erreicht worden ist. Wenn periodische Proben der überstehenden Flüssigkeit, wie oben beschrieben, zeigen, daß eine wesentliche Konzentration des Heparins in dem wässerigen Medium vorhanden ist, wird weiteres Harz zugesetzt, um sicher zu sein, daß ein Überschuß vorhanden ist.

Das wässerige Medium kann aber auch abwärts über eine Harzschicht in einer Kolonne geleitet werden. Die Technik abwechselnden Rührens und Absetzenlassens wird allgemein bevorzugt, da sie es einem ermöglicht, den Verlauf der Adsorption genau zu verfolgen, um eine im wesentlichen vollständige Gewinnung zu gewährleisten.

Am Ende der oben beschriebenen Adsorptionsstufe wird das Harz, welches gebundenes Heparin enthält, gewaschen und zwecks Gewinnung gereinigten Heparins daraus durch Elution mit einer wässerigen Lösung eines Alkalimetall- oder Ammoniumsalzes einer Mineralsäure aufgearbeitet, wobei Alkalimetalloder Ammoniumnitrate und -chloride bevorzugt werden, z. B. Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid, Natriumnitrat und Kaliumnitrat. Um die Wiederverwendung des Harzes bei folgenden Versuchen zur Gewinnung von Heparin zu erleichtern, sollte das in der Elutionslösung vorhandene Anion das gleiche sein wie das Anion (Y in der obigen Formel), das ursprünglich in dem quaternären Ammoniumanionenaustauschharz vorhanden ist. Um die optimale Gewinnung von Heparin zu sichern, ist es wünschenswert, daß die zur Elution verwendete wässerige Salzlösung genügend hohe Ionenstärke hat, um eine im wesentlichen vollständige Loslösung des Heparins von dem Harz zu gewährleisten.

Es wurde gefunden, daß die Verwendung einer wässerigen Lösung eines Alkalimetall- oder Ammoniumnitrats oder -chlorids mit einer Konzentration von mindestens 1,9 Mol gelöstes Salz pro Liter Lösung und bis herauf zur Sättigung wünschenswert ist, um zu gewährleisten, daß viel Heparin von dem Harz in die Elutionslösung geht.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann das Heparin beträchtlich weitergereinigt werden, indem mindestens zwei Elutionen bei verschiedenen Salzmolaritäten ausgeführt werden.

Die erste Elution wird bei einer Salzkonzentration ausgeführt, bei welcher im wesentlichen keine Heparinaktivität von dem Harz losgelöst wird. Das Harz, das gebundenes Heparin enthält, wird zuerst mit einer ersten wässerigen Elutionslösung eines Alkalimetall- oder Ammoniumnitrats bei einer Konzentration von etwa 1- bis etwa l,25molar oder eines Alkalimetall- oder Ammoniumchlorids bei einer Konzentration zwischen etwa 1,25- und etwa l,6molar in Berührung gebracht. Unter diesen Bedingungen ist das Material, welches von dem Harz eluiert wird, im wesentlichen frei von Heparinaktivität. Nach der Berührung mit einer ersten Elutionslösung, wie oben beschr'eben, wird das Harz mit einer wässerigen

Lösung eines Alkalimetail- oder Ammoniumnitrats oder -chlorids bei einer Konzentration, die größer als l,9molar ist, in Berührung gebracht, wodurch das an das Harz gebundene Heparin in die Elutionslösung geht, ohne daß es durch das inaktive Material, das durch die erste Lösung entfernt wurde, verunreinigt ist.

Gemäß noch einer weiteren Alisführungsform der Erfindung wird die Molarität der Salzlösung, die verwendet wird, um das an das Harz gebundene Heparin abzulösen, in dem Bereich von etwa 1,9-bis etwa 2,3molar gehalten. Es wurde gefunden, daß, wenn zuerst bei einer Molarität nicht über 2,3molar eluiert wird, das Material, welches danach durch Berührung mit einer Salzlösung von einer Konzentration über etwa 2,3molar von dem Harz lösgelöst wird, frei von jeglicher nennenswerten Heparinaktivität ist. Demgemäß ist das von dem Harz losgelöste Heparin nicht mit dem Material verunreinigt, welches bei dieser Molarität auf dem Harz verbleibt.

Das gemäß den verschiedenen oben beschriebenen Elutionsverfahren verbleibende Harz ist zur Wiederverwendung bei nachfolgenden Verfahren zur Gewinnung von Heparin ohne weitere Reinigung geeignet. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, ist es jedoch wünschenswert, das Harz einer »Clean-up«-Elutionsstufe zu unterwerfen, bei welcher das Harz mit einer wässerigen Salzlösung hoher Molarität, vorzugsweise über 3molar, in Berührung gebracht wird, welche dazu dient, an das Harz gebundenes inaktives Material zu entfernen. Dadurch wird ein reines Harz erhalten, das ideal zur Wiederverwendung bei nachfolgenden Verfahren zur Reinigung und Gewinnung von Heparin geeignet ist.

Die Elution kann auch stufenweise ausgeführt werden, wobei das Harz mit aufeinanderfolgenden kleinen Fraktionen von fortschreitend zunehmenden Molaritäten in Berührung gebracht wird. Die aufeinanderfolgenden Fraktionen können dann getrennt verarbeitet werden, um daraus Fraktionen- unterschiedlicher Heparinstärke zu gewinnen. Auf diese Weise können Heparinfraktionen erhalten werden, welche Stärken in der Größenordnung von 200 Einheiten pro Milligramm haben.

Nach Berührung des Harzes, welches gebundenes Heparin enthält, mit einer Salzlösung oder -lösungen, wie oben beschrieben, werden die Lösung oder die Lösungen, die Heparin enthalten, aufgearbeitet, um daraus Heparin zu gewinnen, und zwar nach üblichen Verfahren, z. B. Behandlung mit einem organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Methanol, Äthanol, Aceton u. dgl., welche zur Fällung von Heparin aus der Lösung führt.

Das Verfahren nach der Erfindung ist ideal geeignet für die Gewinnung von Heparin aus wässerigen Salzextrakten von tierischem Gewebe. Der Schlamm aus tierischem Gewebe und wässeriger Alkalisalzlösung kann beispielsweise filtriert oder zentrifugiert werden, und das anfallende Filtrat oder Zentrifugat ist dann, falls nötig, nach Einstellung des pH und der Salzkonzentration, zur Behandlung mit dem quaternären Ammoniumanionenaustauschharz geeignet, wie oben beschrieben wurde. Der Schlamm kann aber auch homogenisiert werden und das Homogenisat mit dem Harz gemäß der Erfindung behandelt werden. Insofern als wirksame Extraktion von Heparin aus Geweben in wässerigen Salzlösungen unter Bedingungen, welche für das Verfahren nach der vor-

liegenden Erfindung besonders wirksam sind, erzielt werden kann, ist es offensichtlich, daß bei solchen Extraktionsbedingungen Behandlung mit dem quaternären Ammoniumanionenaustauschharz bequem bewirkt werden kann ohne weitere Einstellung des pH oder der Salzkonzentration. Die Behandlung eines Homogenisats aus einem wässerigen Gewebeextrakt mit Harz ist besonders wünschenswert, da die Filtrationsstufe des Gewebeschlammes entfällt. Das ίο Harz, welches in Form einzelner Teilchen vorliegt, trennt sich leicht von dem Homogenisat und wird, wie oben beschrieben, behandelt, um Heparin daraus zu gewinnen.

Das Verfahren nach der Erfindung ist auch für die Gewinnung von gereinigtem Heparin aus irgendeinem heparinhaltigen Material, das bei einem Verfahren zur Gewinnung von Heparin erhalten wird, geeignet. Wenn das Material ein Feststoff ist, wird es in eine wässerige Salzlösung gebracht, und die ao anfallende Lösung wird, wie oben beschrieben, mit einem quaternären Ammoniumanionenaustauschharz behandelt. Wenn das Material eine wässerige Lösung ist, kann die Lösung, falls erforderlich, nach Einstellung des pH und der Salzkonzentration, leicht mit Harz behandelt werden.

Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung ist durch ausgezeichnete Heparinausbeuten gekennzeichnet. Das quaternäre Ammoniumanionenaustauschharz wird leicht nach der Behandlungsstufe aus dem wässerigen Medium wiedergewonnen und ist nach Abtrennung des Heparins zur Wiederverwendung in folgenden Verfahren geeignet. So stellt das Verfahren eine bedeutende Verbesserung gegenüber bekannten Verfahren dar, bei denen das Mittel zur Vereinigung mit Heparin nicht wiedergewonnen werden kann außer mit Kosten, welche das Verfahren unwirtschaftlich machen.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung.

Beispiel 1

Es werden 3720 kg Hüllmucosa vom Schwein, 757 1 Wasser und 159 kg Ammoniumchlorid in einen mit Rührer versehenen Mantelbehälter gegeben. Das pH wird durch den Zusatz von Ammoniak auf 9,0 eingestellt. Das Gemisch wird unter kontinuierlichem Rühren mit Dampf erhitzt, bis die Temperatur 78^CC erreicht. Zu dem Zeitpunkt tritt Koagulation des proteinhaltigen Materials ein.

Ein aliquoter Teil von 3501 des obigen, durch Wärme koagulierten Gemisches, das einen pH von 8 bis 8,5 und einen Ammoniumchloridgehalt von 0,5molar hat, wird zweimal homogenisiert. Zu 320 1 des anfallenden Homogenisats (Heparinstärke=37 Einheiten je Milliliter) werden 61 Harz zugesetzt. Das Harz ist ein Copolymer eines Gemisches aus 99 Molprozent Styrol und 1 Molprozent Divinylbenzol, welches an den aromatischen Kernen Methylentrimethylammoniumchloridgruppen (annähernd eine solche Gruppe auf je 1,7 atomatische Kerne) trägt und ist unter dem geschützten Warenzeichen Dowex I-Xl im Handel erhältlich.

Das anfallende Gemisch wird über Nacht gerührt und das Harz nach dem Zusatz von Wasser zwecks Herabsetzung der Viskosität abgetrennt. Die Stärke des überstehenden Homogenisats ist nach Entfernung des Harzes 5 Heparineinheiten je Milliliter, was zeigt, daß das Harz über 85% des in dem Ausgangsmaterial vorhandenen Heparins aufgenommen hat.

Das abgetrennte Harz, welches gebundenes Heparin enthält, wird zweimal mit jeweils 121 20%iger Natriumchloridlösung (etwa 3,9molar) in Berührung gebracht. Die beiden Lösungen werden vereinigt und mit 1,5 Volumen Methanol gefällt. Der erhaltene Niederschlag wird gesammelt und getrocknet, um 107 g Rohheparin mit einer Stärke von 76 Einheiten je Milligramm zu liefern. Das bedeutet eine Gewinnung von 73% der in dem Ausgangsmaterial vorhandenen Heparinaktivität und kommt einer Gewinnung von 15 500 Heparineinheiten je 0,454 kg Schweinemucosaausgangsmaterial gleich, das ist weit über den 9500 bis 11 000 Einheiten je 0,454 kg bei den bekannten Verfahren.

Die in dem vorstehenden Beispiel angegebenen Ergebnisse zeigen, daß das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung gut geeignet ist, Heparin mit hohen Ausbeuten aus einem Homogenisat aus einem Gewebe und Extraktionsmittel zu gewinnen. Die Stufe der Filtration des Geweberestes von dem Extrakt ist ausgeschaltet, was eine beträchtliche Vereinfachung des Verfahrens bedeutet.

Beispiel 2

25

Ein filtrierter heparinhaltiger Extrakt mit pH 8,0 bis 8,5, dessen Prüfung 29 Einheiten je Milliliter ergab und der Ammoniumchlorid (0,5m olar) enthielt, wird in eine Kolonne gebracht, welche Harz enthält, das mit dem im Beispiel 1 beschriebenen Harz bis auf den Unterschied identisch ist, daß das Copolymer aus einem Gemisch von 98 Molprozent

Styrol und 2 Molprozent Divinylbenzol gebildet wird und das unter dem geschützten Warenzeichen Dowex I-X 2 im Handel erhältlich ist. Elution mit einer 25%ig^en Natriumchloridlösung (etwa 5,lmolar) führt zur Gewinnung von 88,3 % des in dem Extrakt vorhandenen Heparins.

Nach der oben beschriebenen Elution wird das Harz noch für zwei nachfolgende Verfahren zur Gewinnung von Heparin aus einem filtrierten Gewebeextrakt, der Heparin enthält, verwendet. Es werden 93 bzw. 87% Heparin gewonnen, ein Zeichen dafür, daß das Harz nach Elution ohne Verringerung der Ausbeute wieder verwendet werden kann.

Beispiel 3

Es wird eine Menge von 100 ml des im Beispiel 1 verwendeten Harzes in eine Glaskolonne von 32 mm Durchmesser gebracht, und 3 1 eines heparinhaltigen Extrakts (Ammoniumchlorid 0,5molar, pH = 8 bis 8,3) werden abwärts durch die Kolonne bei einer konstanten Geschwindigkeit von 40 ml/Std. geleitet. Danach wird die Kolonne bei einer Geschwindigkeit von 700 ml/Std. mit 41 0,5molarer Natriumchloridlösung bei einem pH von 8,0 gewaschen.

Dann wird das Harz, das gebundenes Heparin enthält, mit einer Natriumchloridlösung bei einer fortschreitend zunehmenden Salzkonzentration von 0,5- bis 2,7molar eluiert. Fraktionen des abfließenden Eluats wurden gesammelt, mit Methanol gefällt, die Niederschläge gewogen und der Heparingehalt bestimmt. Die Ergebnisse sind unten zusammengestellt.

		Gewicht der Fällung	Heparinstärke	Gesamtaktivität	/0
Fraktion	Salzmolarität	Einheiten		eluierte Aktivität
mg	je Milligramm	Einheiten	in Fraktion
1	0,51 bis 1,25	94,6	1,0	95	0,2
2	1,25 bis 1,62	149,1	20,8	3 100	6,3
3	1,62 bis 1,74	134,0	120,0	16 050	32,7
4	1,74 bis 2,02	186,5	138,0	25 500	51,8
5	2,02 bis 2,28	41,9	89,0	3 730	7,6
6	2,28 bis 2,6	33,0	20,2	665	1,4
49 140	100,0

Das vorstehende Beispiel zeigt die Ergebnisse, die bei stufenweiser oder allmählicher Elution gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erhalten wurden.

Beispiel4

Es wird eine Reihe von Versuchen ausgeführt, um die Verwendung anderer Salze als Ammoniumchlorid in dem wässerigen heparinhaltigen Medium, das gemäß der Erfindung mit quaternärem Ammoniumanionenaustauschharz in Berührung gebracht wird, zu untersuchen. Bei jedem Versuch werden 250 ml einer wässerigen Heparinlösung (Aktivität = 28,2 Einheiten je Milliliter) bei pH = 7 und einer Salzkonzentration von 0,5normal 2 Stunden mit 2 ml Harz (wie im Beispiel 2 beschrieben) gerührt. Es werden Proben von der überstehenden Flüssigkeit entnommen und untersucht.

Die Versuchsergebnisse sind wie folgt:

% Heparinaktivität, Salz durch Harz absorbiert

Natriumchlorid größer als 95%

Natriumnitrat größer als 95 %

Natriumphosphat 88 %

Natriumacetat 71 %

Ammoniumsulfat 62%

Die Ergebnisse zeigen, daß Natriumchlorid und Natriumnitrat Ammoniumchlorid insofern gleichwertig sind, als im wesentlichen quantitative Absorption von Heparin an dem Harz erfolgt. Bei den anderen Salzen erfolgt wesentliche Heparinabsorption.

Die Erfindung umfaßt auch die Herstellung quaternärer Ammoniumsalze von Heparin, in denen der

Claims (1)

1. kationische Anteil das Kation eines quaternären Ammoniumanionenaustauschharzes, wie oben beschrieben, und das Anion ein Heparinion ist. Solche Heparinsalze werden, wie oben beschrieben, erhalten, indem ein heparinhaltiges Material mit dem Harz behandelt wird, und sind brauchbare Zwischenprodukte bei der Reinigung von Heparin in Übereinstimmung mit dem Verfahrensgesichtspunkt der Erfindung. Sie können nach Herstellung aufbewahrt werden bis zur späteren Elution, um gereinigtes Heparin herzustellen.

   Das Verfahren nach der Erfindung ist unter Bezugnahme auf das spezifische sulfatierte Polysaccharid Heparin beschrieben worden. Andere sulfatierte Polysaccharide, beispielsweise Chitinsulfat, Xylansulfat, Chondroitinsulfat, Hyaluronsäuresulfat u. dgl., sind bei dem oben beschriebenen Verfahren volle Äquivalente von Heparin und können durch das Verfahren nach der Erfindung wirksam gereinigt werden.

   Patentanspruch:

   Verfahren zur Gewinnung von Heparin, dadurch gekennzeichnet, daß das Heparin aus wässerigen Lösungen bei pH 7 bis 9, die 0,1 bis 1,25 Mol/1 Alkali-, Erdalkali- oder Ammoniumsalze enthalten, an einen Anionenaustauscher, der aus 96 bis 99,9 Molprozent eines aromatischen Monovinylkohlenwasserstoffs und 4 bis 0,1 Molprozent eines aromatischen Divinylkohlenwasserstoffs mit organischen Ammoniumgruppen an den aromatischen Kernen erhalten wurde, adsorbiert wird und nach Waschen des mit Heparin beladenen Anionenaustauschers mit Wasser oder vorzugsweise mit einer 1- bis 1,6-molaren Salzlösung das Heparin mit einer 1,9-bis 2,3molaren Salzlösung eluiert wird.

   In Betracht gezogene ältere Patente:
   Deutsches Patent Nr. 1 195 010.

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