DE3877641T2

DE3877641T2 - Isolierung von neutralen aminosaeuren bei hohen ph-werten.

Info

Publication number: DE3877641T2
Application number: DE8888111146T
Authority: DE
Inventors: Mark Darius C O Eastma Jaffari
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1987-07-17
Filing date: 1988-07-12
Publication date: 1993-08-12
Anticipated expiration: 2008-07-13
Also published as: EP0299434A3; KR890002412A; EP0299434A2; ATE84782T1; JPS6490159A; DE3877641D1; EP0299434B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung einer neutralen Arninosäure aus einer wäßrigen Lösung. Das Verfahren eignet sich zur leichten Erzeugung von hochreinen Säuren ohne Notwendigkeit der Verwendung organischer Lösungsmittel oder teurer Verfahrensstufen.
ia In der folgenden Beschreibung wird auf die neutrale Aminosäure Tryptophan Bezug genommen. Obgleich Tryptophan ein wichtiges Beispiel der Erfindung ist, treten doch auch bei anderen neutralen Aminosäuren wie Threonin und Phenylalanin ähnliche Probleme bei der Gewinnung auf, d.h. Probleme, die durch das Verfahren der Erfindung gelöst werden. Diesen Säuren gemein ist eine charakteristische Löslichkeit/pH- Wert-Kurve (Löslichkeitsanstieg mit steigendem pH-Wert), wie im folgenden näher beschrieben werden wird.
Tryptophan ist eine der essentiellen Aminosäuren. Es wird in geeigneter Weise hergestellt in kommerziellen Mengen durch Fermentation wie auch nach chemischen Verfahren. Das so hergestellte Tryptophan eignet sich als Additiv für Nahrungsmittel für den Menschen wie auch für Tierfutter.
Gleichgültig, ob durch Fermentation oder auf chemischem Wege erzeugt, liegt Tryptophan in der Endlösung gemeinsam mit anderen Stoffen vor. Das üblichste Verfahren zur Entfernung dieser anderen Stoffe besteht darin, den pH-Wert der Fermentationsbrühe auf einen niedrigen pH-Wert einzustellen, die Zelltrümmer durch Zentrifugieren zu entfernen, falls eine Fermentation dazu verwendet wurde, um das Tryptophan zu erzeugen, und das Tryptophan in einer stark kationischen Ionenaustauschsäule zu adsorbieren. Das Tryptophan wird dann eluiert und aus der Eluierungslösung gewonnen. Bei einem üblichen Gewinnungsverfahren wird die Lösung neutralisiert und dann abgekühlt, zu welchem Zeitpunkt das gewünschte Produkt aus der Lösung ausfällt. Obgleich bei diesem Verfahren die meisten Verunreinigungen entfernt werden, bleiben doch viele zurück. Es ist infolgedessen übliche Praxis, die ausgefällten Feststoffe wieder in einem organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Ethanol, zu lösen und die Lösung dann mit aktivierter Kohle zu behandeln. Verwiesen wird auf die US-PS 3 450 712 vom 17. Juni 1969, die ein Verfahren dieses Typs beschreibt.
Die Verwendung eines organischen Lösungsmittels ist aus mehreren Gründen unerwünscht. Zunächst sind organische Lösungsmittel kostspielig. Da das Tryptophanprodukt normalerweise für den menschlichen oder tierischen Verbrauch bestimmt ist, sollte die Verwendung organischer Lösungsmittel auch vermieden werden, da sogar Spurenmengen hiervon schädlich sein können.
Wie bereits erwähnt, wird im Rahmen eines typischen Verfahrens eine Fermentationsbrühe oder eine andere Lösung zunächst über eine Ionenaustauschkolonne geführt. Die zu reinigende Lösung wird zunächst auf einen pH-Wert von etwa 2 angesäuert, bevor die Lösung durch die Ionenaustauschkolonne geführt wird. Die Eluierungslösung ist im Falle eines kationischen Harzes eine stark basische Lösung, z.B. eine Ammoniumhydroxidlösung mit einem pH-Wert von etwa 11. Das anfallende Eluat weist einen ähnlichen pH-Wert auf und ist bezüglich Tryptophan relativ verdünnt, d.h. es enthält beispielsweise etwa 10 g/l. Aufgrund der Löslichkeitscharakteristika von Tryptophan, kann eine Gewinnung durch Ansäuern der Lösung erreicht werden entweder durch Zusatz von Säure zur Lösung oder durch Entfernung der Base. Die Base kann entfernt werden, wenn eine flüchtige Base wie Ammoniak verwendet wird. In der '712-Patentschrift wird Ammoniak entfernt, wenn die verdünnte Lösung des Tryptophans bei vermindertem Druck konzentriert wird. Es ist der Niederschlag, der bei diesem Verfahren erzeugt wird, der weiter gereinigt werden muß mittels aktivierter Kohle aus einer methanolischen Lösung.
Ein weiteres Verfahren zur Gewinnung von Tryptophan wird in der US-PS 4 588 818 beschrieben. In dieser Patentschrift wird ein Verfahren beschrieben, bei dem ein Produkt anfällt, das als die α-Kristallform des Tryptophans beschrieben wird. Eine Lösung von Tryptophan, z.B. ein Kolonnen-Eluat, wird zunächst durch eine semipermeable Membran filtriert. Ein organisches Lösungsmittel wird dann diesem Filtrat zugesetzt. Dann wird Säure zur Lösung zugegeben, um die Bildung der gewünschten Kristalle in einer solchen Weise zu fördern, daß sich die Kristalle von der alkalischen Seite her bilden. Infolgedessen schließt auch dieses Verfahren die Verwendung von teuren und unerwünschten organischen Lösungsmitteln ein. Die Verwendung organischer Lösungsmittel wird als erforderlich angesehen, da sie angeblich eine inhibierende Einwirkung auf die Bildung des gewünschten α-Kristalltyps abschwächen.
Aus den Arbeitsbeispielen der '818-Patentschrift ergibt sich, daß das Verfahren die Verwendung des organischen Lösungsmittels erfordert und daß Säure zugesetzt wird, um eine Neutralisation zu erreichen. Im Falle beider Beispiele 1 und 2 wird Chlorwasserstoffsäure zur Lösung zugesetzt, um die Wiedergewinnung zu erreichen.
Infolgedessen besteht die zu lösende Aufgabe darin, ein Verfahren zur Gewinnung von Tryptophan bereitzustellen, das nicht kostspielig ist und zu dessen Durchführung keine organischen Lösungsmittel benötigt werden. Das Verfahren sollte dazu geeignet sein, Tryptophan von hoher Reinheit zu erzeugen.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Gewinnung einer neutralen Aminosäure aus einer wäßrigen Lösung bereitgestellt, das gekennzeichnet ist durch die Stufen:
1) Bildung einer konzentrierten Lösung der Aminosäure mit einem pH-Wert oberhalb des Lösungs-pKa der Säure,
2) gleichförmige Entfernung von Base aus der Lösung unter Bildung fester Partikel der neutralen Aminosäure bei einem pH-Wert oberhalb des Lösungs-pKa der neutralen Aminosäure,
3) Gewinnung der festen Partikel aus der Lösung.
Bei einer bevorzugten Arbeitsweise ist die wäßrige Lösung eine Fermentationsbrühe. In einer Anfangsstufe wird die Brühe auf einen hohen pH-Wert eingestellt und dann konzentriert und bei diesem hohen pH-Wert filtriert. Zusätzliche Verbesserungen lassen sich durch diese Filtrationsstufe bei hohem pH-Wert realisieren. Diese Stufe erlaubt die Recyclisierung der überstehenden Flüssigkeit und vermeidet einen kostspieligen Ionenaustausch.
Fig. 1 ist eine Darstellung der Sättigungskurve von Tryptophan mit verschiedenen Reinigungsschemata nach dem Stande der Technik wie auch nach der Erfindung.
Fig. 2 ist die Darstellung des Verlaufs der Gewinnung nach Beispiel 3.
Fig. 3 ist die Darstellung des Verlaufs der Gewinnung gemäß Beispiel 4.
Die vorliegende Erfindung läßt sich am besten verstehen unter Bezugnahme auf Fig. 1. Fig. 1 ist eine Sättigungskurve für Tryptophan. Das heißt, die Punkte im linken Teil der Kurve (in Fig. 1, 2 und 3) sind Zustände, unter denen die Säure nicht löslich ist und aus der Lösung ausgefällt wird (oder in Form einer übersättigten Lösung vorliegt) unter Bildung eines Schlammes. Die Punkte rechts der Kurve stellen Zustände dar, unter denen die Säure vollständig in Lösung vorliegt.
Ein typisches Eluat von einem Kationenaustauscherharz ist in Form eines Punktes A dargestellt. Das heißt, die Lösung ist relativ verdünnt in der Säure und von einem hohen pH-Wert. Die Linie A-B-C-D stellt ein typisches Verfahren nach dem Stande der Technik dar, bei dem Ammoniak-Eluat durch Verdampfen konzentriert wird. Im Falle eines Verfahrens dieses Typs wird aufgrund der Löslichkeit des Ammoniaks Ammoniak leicht aus der Lösung ausgetrieben, bevor eine wesentliche Konzentrierung der Lösung erfolgt. Wenn Ammoniak aus der Lösung austritt, wird der pH-Wert vermindert. Dies bedeutet, daß das Verfahren vom Punkt A zum Punkt B verläuft. Wird die Verf lüchtigung fortgesetzt, wird Wasser entfernt und die Konzentration der Lösung setzt ein. Die Ausfällung der Säure beginnt bei C und das ausgefällte Produkt wird aus der Lösung bei D durch Filtration gewonnen.
Die Feststoffe bei D sind nicht so rein wie erwünscht. Es sind diese Feststoffe, die in einem organischen Lösungsmittel gelöst werden müssen und dann mit aktivierter Kohle behandelt werden, um das gewünschte Produkt zu erhalten. Es ist zu bemerken, daß die Ausfällung bei einem pH-Wert erfolgt, der weit unterhalb des Lösungs-pKa-Wertes der Säure liegt, der sich in diesem Beispiel bei etwa 9,2 befindet.
Bei einem alternativen Verfahren des Standes der Technik (nicht in Fig. 1 dargestellt) wird Säure zu einer konzentrierten Eluat-Lösung zugegeben und es kann sein, daß Feststoffe sich zu bilden beginnen, während sich die Nasse der Lösung oberhalb des Lösungs-pKa-Wertes der Aminosäure befindet, die gewonnen werden soll. Das auf diese Weise gewonnene Produkt ist ebenfalls von geringerer Reinheit als erwünscht. Es wird vermutet, daß wenn Säure zugesetzt wird, die Feststoffe sich tatsächlich in einer lokalisierten Umgebung von niedrigem pH-Wert bilden. Auf jeden Fall ist der Zusatz von Säure zur Verminderung des pH-Wertes nicht äquivalent einer gleichförmigen Entfernung von Base zur Verminderung des pH-Wertes wie im Falle der vorliegenden Erfindung.
Zwei Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in Fig. 1 dargestellt. Im Falle der ersten Ausführungsform beginnt das Verfahren wie im Falle des Verfahrens des Standes der Technik. Das Eluierungsmittel bei A wird zu einer Aminosäureaufschlämmung bei E durch Verdampfen genommen. Anstelle der Gewinnung des Produktes an diesem Punkt, werden die Feststoffe der Aufschlämmung nicht entfernt, sondern durch Zusatz von konzentriertem Ammoniumhydroxid oder Ammoniak wieder gelöst. Der pH-Wert wird erhöht unter einer gewissen Verdünnung, sofern Ammoniumhydroxidlösung verwendet wird, bis der Punkt E erreicht ist. Auf diese Weise wird eine konzentrierte Tryptophanlösung mit einem pH-Wert oberhalb des Lösungs-pKa-Wertes des Tryptophans erzeugt. Dies entspricht der ersten Stufe der oben zusammengefaßten Erfindung.
Vom Punkt E wird Ammoniak aus der Lösung durch Verdampfen oder Abstreifen entfernt, bis die Lösung den Punkt G erreicht hat. Das heißt, daß Base gleichförmig aus der Lösung entfernt wird. Eine Produktverfestigung erfolgt am Punkt F, der bei einem pH-Wert liegt, der höher ist als der Lösungs-pKa-Wert der Aminosäure bei dieser Temperatur. Infolgedessen wird die Stufe 2 der Erfindung ausgeführt. Die Feststoffe beim Punkt G werden durch Filtrieren gewonnen und bedürfen keiner zusätzlichen Reinigung. Ungleich der Feststoffe beim Punkt D müssen sie nicht in einem organischen Lösungsmittel gelöst und mit aktivierter Holzkohle behandelt werden.
Eine zweite Ausführungsform der Erfindung wird durch die Kurve A-H-G in Fig. 1 dargestellt. Im Falle dieser Ausführungsform wird das Eluat von hohem pH-Wert des Ionenaustauschers bei A einem Verfahren mit einer Umkehr-Osmosemembran unterworfen. Ungleich einer Verdampfung, bei der das Ammoniak entfernt wird und nachfolgend Wasser, werden bei Verwendung einer Umkehr-Osmosemembran Ammoniak und Wasser gleichzeitig entfernt. Infolgedessen bilden sich Feststoffe beim Punkt H, der wiederum oberhalb des Lösungs-pKa-Wertes der Aminosäure liegt. Im Falle dieser Ausführungsform finden die Stufen 1 und 2 der Erfindung gleichzeitig statt.
Zu bemerken ist, daß in gewissen Fällen sich Feststoffe nicht genau dann bilden, wenn die Lösung die Löslichkeitskurve "schneidet". Das heißt, daß sich eine übersättigte Lösung bilden kann. Gemäß der Erfindung sollte sich der pH- Wert zu dem Zeitpunkt, zu dem eine Verfestigung beginnt einzutreten, oberhalb des Lösungs-pKa-Wertes befinden. In typischer Weise verfestigt sich eine übersättigte Lösung spontan. Eine Verfestigung kann ebenfalls induziert werden durch Einführen von Impfkristallen in die übersättigte Lösung.
Infolgedessen ist in Übereinstimmung mit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung die Base Ammoniumhydroxid, und Ammoniak wird gleichförmig in Stufe 2) des beschriebenen Verfahrens durch Verdampfen des Ammoniaks entfernt. Dies bedeutet, daß die Base gleichförmig durch Abstreifen von der Lösung entfernt wird. Die Temperatur während der Verfestigung ist nicht kritisch. Geeignete Temperaturen liegen zwischen etwa 20ºC und 60ºC. Besonders bevorzugte Ergebnisse werden erreicht, wenn die Temperatur bei etwa 55ºC liegt.
Falls gewünscht, kann die Lösung der Einwirkung von Vakuum unterworfen werden, um die Geschwindigkeit der Ammoniakentfernung zu erhöhen. Ein Rühren der Lösung und ein Abführen des Ammoniaks mittels eines anderen Gases, z.B. Luft, können dieses Verfahren ebenfalls fördern.
Wird Base von der Lösung abgestreift, so ist eine flüchtige Base erforderlich. Ammoniak (auch in Form von Ammoniumhydroxid) ist eine geeignete Base für diesen Zweck. Zu anderen flüchtigen Basen, die verwendet werden können, gehören Hydrazin, Ethylamin und Pyridin.
Gemäß einer zweiten bevorzugten Ausführungsform nach der Erfindung ist die Base ebenfalls Ammoniumhydroxid und Ammoniak wird gleichförmig entfernt, während die Tryptophankonzentration der Lösung erhöht wird durch Umkehrosmose, mit dem Ziel der gleichzeitigen Entfernung von Wasser und Ammoniak.
Die Umkehrosmosemembran sollte derart ausgewählt werden, daß Ammoniak nicht mit merklich größerer Geschwindigkeit entfernt wird als das Wasser. Wird Ammoniak zu schnell entfernt, so nimmt der pH-Wert auf einen Punkt unterhalb des Lösungs-pKa-Wertes der Aminosäure ab, bevor die Ausfällung beginnt.
Zu Beispielen von geeigneten Umkehr-Osmose-Membranmaterialien gehören: Polyamide, Polyacrylonitrile, Polysulfone und Polybenzimidazole. Die Form der semipermeablen Membran ist nicht kritisch und sie kann irgendeine der üblichen bekannten Formen aufweisen. Beispielsweise kann die Membran röhrenförmig sein, die Form flacher Blätter haben und spiralförmig sein oder die Form von Hohlfasern aufweisen. Geeignete Membranen haben eine Salzabweisung von größer oder gleich 95%, gemessen nach Methoden, die auf dem Membrangebiet bekannt sind.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt ein billiges Verfahren zur Reinigung von neutralen Aminosäuren dar. In einem typischen Anwendungsfall mit Tryptophan als neutraler Aminosäure lassen sich Reinheiten von über 95% erreichen ohne Verwendung von zusätzlichen Stufen, welche unerwünschte organische Lösungsmittel benötigen.
Der theoretische pKa-Wert einer neutralen Aminosäure ist ein genau definierter Parameter, der unabhängig von der Temperatur und dem Vorhandensein anderer Komponenten ist. Gemäß der Erfindung ist der wichtige pKa-Wert der Lösungs- pKa-Wert, der die tatsächliche Charakteristika der Lösung in Betracht zieht. Infolgedessen muß der pKa-Wert der neutralen Aminosäure in der tatsächlichen Lösung gemessen werden, aus der die Aminosäure ausgeschieden werden soll. Der "Lösungs- pKa-Wert" ist der pH-Wert, bei dem die Löslichkeit/pH-Wert- Kurve für die infrage stehende Lösung die Neigung ändert. Wird beispielsweise der Logarithmus der Konzentration bei der Sättigung gegen den pH-Wert aufgetragen, so ergebn sich zwei gerade Linienteile der Kurve. Der Schnittpunkt dieser geraden Linienteile wird, wenn ausgedehnt, als der Lösungs- pKa-Wert der Lösung unter den Bedingungen des Tests verstanden. Der Lösungs-pKa-Wert hängt von den anderen Komponenten der Lösung ab, beispielsweise der Base, die vorhanden sein kann, der Temperatur und anderen Faktoren.
Die neutrale Aminosäure kann aus jeder wäßrigen Lösung nach dem Verfahren der Erfindung gewonnen werden. Die Lösung kann von chemischen Verfahren zur Aminosäuregewinnung stammen. Wie bereits erwähnt, kann die Lösung das Eluat einer Ionenaustauscherkolonne sein. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Lösung aus einem Fermentationsmedium, das konzentriert und bei hohem pH-Wert filtriert wurde, um viele Verunreinigungen zu entfernen.
Es wurde nunmehr gefunden, daß das Kation-Austauscherharz Verunreinigungen wie Calciumionen und viele Proteinen nicht wirksam entfernt. Eine Konzentrations- und Filtrationsstufe bei hohem pH-Wert entfernt die meisten dieser Verunreinigungen, während die gewünschte neutrale Aminosäure in der Lösung verbleibt. Die Aminosäure wird dann aus dieser Lösung gemäß der Erfindung gewonnen.
Ein unerwarteter Vorteil der Konzentrations- und Filtrierstufe bei hohem pH-Wert ist der, daß die Lösung, die nach der Ausfällung anfällt, leicht recyclisiert werden kann. Besteht die Ausgangs lösung aus einem Ionenaustauscheluat, ist die Recyclisierung schwierig aufgrund der Ansammlung von Verunreinigungen, die durch die Kolonne nicht entfernt werden. Infolgedessen wird bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform die überstehende Flüssigkeit von der Rückgewinnung recyclisiert.
Zusammenfassend besteht die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Gewinnung einer neutralen Aminosäure aus einem Fermentationsmedium mit den Stufen:
1) Konzentration und Filtrieren des Fermentationsmediums unter Aufrechterhaltung eines pH-Wertes von über etwa 10,0;
2) gleichförmige Entfernung von Base aus der Lösung, unter Bildung fester Partikel der neutralen Aminosäure bei einem pH-Wert oberhalb des Lösungs-pKa-Wertes der neutralen Aminosäure;
3) Gewinnung der festen Partikel aus der Lösung.
Die Lösung, die nach der Gewinnung der festen Partikel anfällt, kann in die Stufe 1 recyclisiert werden.
Die gerade beschriebene bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens liefert die gewünschte Aminosäure in einer Reinheit von nahezu 100%. Keine organischen Lösungsmittel oder Ionenaustauscherharze werden benötigt, weshalb das Verfahren sehr billig ist.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen.
In einigen der folgenden Beispiele wurde ein Eluat von einer Ionenaustauscherkolonne verwendet. Das Ionenaustauschereluat wurde wie folgt erhalten. Gereinigte Fermentationsbrühe (die Zellen wurden durch Filtration entfernt) wurde mittels Schwefelsäure auf eigen pH-Wert von etwa 2 eingestellt. Diese Lösung wurde mit einem starken Kationenaustauscherharz (Dowex 50 W x-2 ) in Kontakt gebracht, um das Tryptophan zu adsorbieren, das sich in der Fermentationsbrühe befand. Nach Waschen des Harzes mit Wasser wurde das Harz mit 1 N Ammoniumhydroxid eluiert, wodurch das Tryptophan vom Harz entfernt wurde. Die erhaltene Lösung wies eine Tryptophankonzentration von etwa 12 g/l auf und einen pH-Wert von etwa 10.

Beispiel 1-3 Ammoniak-Abstreifen

Der Verlauf des Beispiel es wird in Fig. 2 veranschaulicht. Der Ausgangspunkt war das Eluat bei Punkt A&sub3;. Das veranschaulichte Beispiel ist Beispiel 3, in welchem die Gewinnung bei 55ºC erfolgte. Die anderen Gewinnungen bei anderen Temperaturen waren ähnlich.
Das Ionenaustauschereluat wurde unter Vakuum bei 50 bis 90ºC eingedampft, um Ammoniak und Wasser zu entfernen. Die erhaltene Lösung wies eine Tryptophankonzentration von etwa 211 g/l auf und hatte einen pH-Wert von etwa 8,0 (Punkt D&sub3;). Das Tryptophan war teilweise ausgefallen, unter Bildung einer Aufschlämmung.
Zu dieser Auf schlämmung wurden 12 M Ammoniumhydroxid gegeben, um das Tryptophan wieder aufzulösen. Der PH-Wert der erhaltenen Lösung lag bei etwa 10,5 (Punkt E&sub3;). Die Lösung wurde dann erhitzt und ein Luftstrom wurde über die Oberfläche der Lösung geblasen, um das Ammoniak zu entfernen, wobei die Lösung schwach gerührt wurde. Es entstand eine übergesättigte Lösung von Tryptophan (Punkt G&sub3;), das spontan fest wurde. Der pH-Wert der Ausfällung ist in Tabelle I dargestellt. Der Lösungs-pKa-Wert bei jeder Temperatur ist ebenfalls angegeben.
Die Aufschlämmung, die erhalten wurde, wurde filtriert, um das feste Tryptophan zu entfernen. Die Feststof fe wurden mit kaltem Wasser (0 bis 4ºC) gewaschen. Ein Teil der Feststoffe wurde in einem Vakuumofen bei 100 C getrocknet und 16 h lang Vakuum-getrocknet. Die Reinheit des erhaltenen gewonnenen Tryptophans ist in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Ausfällungsbedingungen Beispiel Temperatur pH-Wert Reinheit

Beispiel 4 Umkehrosmose

Der Verlauf dieses Beispieles ist in Fig. 3 dargestellt. 10 l des Ionenaustauschereluates (Fig. 3, Punkt A&sub4;) wurden konzentriert, unter Anwendung einer urnkehrosmosevorrichtung. Die verwendete Vorrichtung war eine Vorrichtung vom Typ DDs Lab Module 20, Hersteller Niro Atomizer Food and Dairy Inc., Hudson, Wisconsin, USA. Die Membranfläche war 0,144 m² groß und in vier Platten unterteilt. Zwei der Platten waren HR- 95-Membrane und zwei der Platten waren HR-98-Membrane, beide erhältlich von der Firma Niro.
Das Verfahren wurde bei einem Druck von etwa 5340 kPa durchgeführt, einer Rezirkulationsgeschwindigkeit von 1,8 l/min und einer Temperatur von 37ºC. Die Umkehrosmose wurde durchgeführt, bis der Strom des Konzentrates eine Tryptophankonzentration von 142 g/l bei einem pH-Wert von 9,2 aufwies, an welchem Punkt die Ausfällung begann (Punkt G&sub4;). Der Lösungs-pKa-Wert dieser Lösung lag bei etwa 8,9.
Die konzentrierte Aufschlämmung wurde aus der Umkehrosmosevorrichtung mit etwa 500 ml deionisiertem Wasser ausgespült. Die erhaltene Aufschlämmung wurde auf 23ºC unter schwachem Rühren abgekühlt. Sie wurde dann im Vakuum filtriert, unter Gewinnung von 31 g Produkt. Dieses Produkt wurde mit kaltem Wasser gewaschen. Das Produkt wurde wie in Beispiel 1 getrocknet. Die getrocknete Probe bestand aus Tryptophan in einer Reinheit von 97%.

Beispiel 5 Säure-Ausfällung

Dies ist ein Vergleichsbeispiel.

Ein Teil des ionenaustauschereluats wurde konzentriert durch Eindampfen auf eine Tryptophankonzentration von etwa 250 g/l. Wahrend dieser Stufe wurde Natriumhydroxid zugesetzt, um das Tryptophan in Lösung zu halten. Der pH-Wert dieses Konzentrates lag bei etwa 10,8.
Das Konzentrat wurde dann zu einer 50 vol.-%igen Essigsäurelösung bei Raumtemperatur innerhalb eines Zeitraumes von 30 min zugegeben. Beim Ende der Zugabe lag das Verhältnis von Essigsäure:Triptophan bei 5:1. Die Lösung wurde dann weitere 30 min lang gerührt. Während dieser Stufen fiel das Tryptophan aus der Lösung aus und es wurde eine Aufschlämmung erzeugt.
Die erhaltene Auf schlämmung wurde filtriert, mit kaltem Wasser gewaschen und in einer Weise, ähnlich wie in Beispiel 1 beschrieben, getrocknet. Die erhaltene feste Masse bestand aus Tryptophan mit einer Reinheit von nur 90%.
In diesem Beispiel wurde das Tryptophan unter sauren Bedingungen ausgefällt, da das Konzentrat zu einer stark sauren Lösung zugegeben wurde. Der pH-Wert dieser Lösung lag gut unterhalb des pKa-Wertes des Tryptophankonzentrats. Die Reinheit des erhaltenen Tryptophans war schlechter als die Reinheit des Produktes, das nach dem Verfahren der Erfindung hergestellt wurde.

Beispiel 6 Verdampfungs-Ausfällung

Dies ist ein Vergleichsbeispiel.

2 l des ionenaustauschereluats wurden bei 60ºC bis zu einem Endvolumen von etwa 300 ml eingedampft. Die Tryptophankonzentration und der pH-Wert der erhaltenen Aufschlämmung wurde nicht gemessen, jedoch zu 69 g/l bzw. 8,0 bestimmt. Der Tryptophan-Lösungs-pKa-Wert unter diesen Bedingungen liegt bei etwa 8,2. Infolgedessen trat eine Ausfällung gut unterhalb des Lösungs-pKa-Wertes auf.
Die erhaltene Aufschlämmung wurde filtriert und die feste Masse wurde gewaschen und wie im vorstehenden beschrieben getrocknet. Die Reinheit des Tryptophans, das erzeugt wurde, lag bei nur 75,2%.

Beispiel 7 Filtration bei hohem pH-Wert

Eine Ferinentationsbrühe, die filtriert worden war, um die Zelltrümmer zu entfernen, wurde als Ausgangsmaterial dieses Beispieles verwendet. Es wurde keine Ionenaustauscherreinigung durchgeführt. Die Probe der filtrierten Brühe hatte ein Volumen von 12,0 l und enthielt 5,4 g Tryptophan/l bei einer Reinheit von 25%, bezogen auf die vorhandenen Feststoffe. Die Brühe wurde unter Anwendung einer Umkehrosmose auf 2,5 l und 26,7 g Tryptophan/l konzentriert. Die konzentrierte Brühe wurde dann weiter konzentriert durch Eindampfen bis zu einer Aufschlämmung von 1,9 l.
Der pH-Wert der Aufschlämmung wurde unter Verwendung von Ammoniakgas bis zu 10,3 eingestellt. Die Feststoffe, die bei diesem pH-Wert vorhanden waren, wurden abfiltriert. Infolgedessen wurde die Fermentationsbrühe bei hohem pH-Wert filtriert gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung. Das erhaltene Filtrat bestand aus 1,75 l mit 36,4 g/l Tryptophan mit einer Reinheit von 25,1%. Die festen Stoffe, die abfiltriert wurden, wogen 23,8 g, von denen 2,9% aus Tryptophan bestanden.
Mit Teilen des Filtrats wurden zwei getrennte Ammoniak-Abstreif-Ausfällungen durchgeführt. Die überstehenden Flüssigkeiten und Wäschen von diesen zwei Versuchen wurden recyclisiert und für eine andere Ammoniak-Abstreif-Ausfällung verwendet. Da das Filtrat der Filtration bei hohem pH-Wert nicht die gewünschte Konzentration für ein Ammoniak-Abstreifen aufwies, wurde es durch weiteres Eindampfen konzentriert. Während dieser Eindampfung bildeten sich mehr Feststoffe, die bei hohem pH-Wert abfiltriert wurden.
Aus diesen drei Versuchen wurden insgesamt 14,6 g Tryptophan gewonnen. Unter Berücksichtigung experimenteller Fehler lag die Reinheit des Produktes bei 100% unter Anwendung sowohl einer hochwirksamen chromatographischen Methode wie auch einer Titrationsmethode zur Bestimmung der Reinheit.

Claims

1. Verfahren zur Rückgewinnung einer neutralen Aminosäure aus einer wäßrigen Lösung mit den Stufen:

1) Bildung einer konzentrierten Lösung der Aminosäure mit einem PH-Wert oberhalb des Lösungs-pKa der Säure

2) gleichförmige Entfernung von Base aus der Lösung unter Bildung fester Partikel der neutralen Aminosäure bei einem pH-Wert oberhalb des Lösungs-pKa der neutralen Aminosäure

3) Rückgewinnung der festen Partikel aus der Lösung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Base Ammoniumhydroxid ist und Ammoniak gleichförmig in Stufe 2 durch Verflüchtigung des Ammoniaks entfernt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das Ammoniak durch Anwendung von Wärme und Vakuum Verflüchtigt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die neutrale Aminosäure Tryptophan ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Temperatur während der Verfestigung bei 55ºC liegt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Base Ammoniumhydroxid ist und Ammoniak gleichförmig entfernt wird, während die neutrale Aminosäurekonzentration der Lösung erhöht wird durch Umkehrosmose unter gleichzeitiger Entfernung von Wasser und Ammoniak.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die neutrale Aminosäure Tryptophan ist.

8. Verfahren zur Ruckgewinnung einer neutralen Aminosäure aus einem Fermentationsmedium mit den Stufen:

1) Konzentrierung und Filtrieren des Fermentationsmediums unter Aufrechterhaltung eines pH-Wertes oberhalb 10,0;

2) gleichförmige Entfernung von Base aus der Lösung unter Bildung fester Partikel der neutralen Aminosäure bei einem pH-Wert oberhalb des Lösungs-pKa der neutralen Aminosäure,

3) Rückgewinnung der festen Partikel aus der Lösung.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die neutrale Aminosäure Tryptophan ist.

10. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die Lösung, die nach der Rückgewinnung der festen Partikel in Stufe 3 hinterbleibt, zur Stufe 1 recyclisiert wird.