AT219197B

AT219197B - Verfahren zur Vorbehandlung wässeriger Nährmedien für die Züchtung von Tetracyclin bildenden Streptomycetenstämmen

Info

Publication number: AT219197B
Application number: AT325156A
Authority: AT
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1953-09-28
Filing date: 1954-08-25
Publication date: 1962-01-10

Description


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  Verfahren zur Vorbehandlung wässeriger Nährmedien für die
Züchtung von Tetracyclin bildenden Streptomycetenstämmen 
Die Erfindung bezieht sich auf die Vorbehandlung von wässerigen,   nährstoffhaltigen   Fermentations- medien zwecks Verbesserung der Ausbeute an Tetracyclin aus denselben und stellt eine Verbesserung bzw. 



   Modifikation des in der   österr. Patentschrift Nr. 208506   beschriebenen Verfahrens dar. 



   Aus dieser Patentschrift ist es bekannt, dass Tetracyclin durch Fermentation eines wässerigen,   nähr-   stoffhaltigen Mediums mit einem tetracyclinerzeugenden Mikroorganismus der Gattung Streptomyces erhalten wird. Es ist auch bekannt, dass bei Gegenwart von Chloridionen in dem Medium gleichzeitig mit dem Tetracyclin auch Chlortetracyclin erzeugt wird. 



   Die vorliegende Erfindung bezweckt die Herstellung eines Fermentationsmediums, aus welchem ein praktisch chlortetracyclinfreies Tetracyclin erzeugt werden kann, was vom medizinischen Standpunkt äusserst wünschenswert ist. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren zur Vorbehandlung wässeriger Nährmedien für die Züchtung von Tetracyclin bildenden Streptomycetenstämme, wie Str. aureofaciens, zwecks Erhöhung der Ausbeute an Tetracyclin, besteht darin, dass die wässerige Nährlösung bzw. eine wässerige Lösung von chloridreichen Bestandteilen des Nährmediums zur Herabsetzung des Chlorionengehaltes mit einem anionenaustauschenden Material solange in Kontakt gehalten wird, bis der Chlorionengehalt so weit herabgesetzt ist, dass das gebrauchsfähige Nährmedium einen Chlorionengehalt von weniger als 50 Teilen je Million, vorzugsweise 10 Teilen je Million aufweist. 



   Die Herstellung von Fermentationsmedien mit einem Gehalt an Chloridionen von weniger als 10 Teilen pro Million ist verhältnismässig einfach, wenn ein   sogenanntes "synthetisches Nährmedium" verwen-   det wird, in welchem die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen in Form von verhältnismässig reinen Substanzen wie Saccharose und Ammoniumsulfat oder andern Stickstoffverbindungen enthalten sind, doch sind diese synthetischen Medien sehr teuer und es fehlen ihnen wichtige Bildungsstimulatoren, die zur Erzielung hoher Tetracyclinausbeuten erforderlich sind. Aus diesen und andern, noch nicht ganz geklärten Gründen ist es   zweckmässig,   Naturstoffe für die Herstellung der Fermentationsmedien, z. B. Maisquellwasser (corn steep liquor), Caseinabbauprodukte   u. dgl.   oder andere Abbauprodukte tierischen Ursprungs zu verwenden.

   Diese Materialien sind billiger als die synthetischen Nährmedien und ergeben auch viel höhere Ausbeuten des erwünschten Antibiotikum, enthalten aber merkliche Mengen an Chloridionen, so dass bei der Erzeugung von Tetracyclin durch Fermentation gleichzeitig   unerwünscht grosse Mengen von   Chlortetracyclin gebildet werden. 



   Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens werden die Naturprodukte wie Maisquellwasser mit Wasser soweit verdünnt, dass sie durch ein Ionenaustauscherbett geleitet und dabei im wesentlichen von Chloridionen befreit werden können. Zu der entionisierten Maisquellwasserlösung werden nach Bedarf weitere Stickstoff- und Kohlenstoffverbindungen sowie die erforderlichen Mineralbestandteile zugesetzt, worauf das Fermentationsmedium gebrauchsfertig ist. Handelsübliches Maisquellwasser enthält Chloridionen in Mengen von ungefähr 0, 15 bis 0,5 Gew.-% und bei der erfindungsgemässen Vorbehandlung dieses Materials muss grössere Sorgfalt aufgewendet werden als bei der Entionisierung von andern zur Herstellung des Fermentationsmediums verwendeten Naturprodukten. 



   Casein, ein sehr geeignetes Ausgangsmaterial für die Herstellung von   Fermentationsmedien, kann   ebenfalls, je nach Art seiner Gewinnung, einen erheblichen Gehalt von Chloridionen in Mengen bis zu 

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 ungefähr   0, 3%   enthalten. Enzymatische Abbauprodukte des Caseins, die an sich zur Herstellung von Fermentationsmedien besonders geeignet sind, enthalten oft noch höhere Mengen an Chloridionen, doch können auch diese Produkte, wenn sie gemäss der Erfindung vorbehandelt werden, für die Herstellung von Fermentationsflüssigkeiten für die Tetracyclingewinnung Verwendung finden. 



   Auch Fischmehl und dessen Abbauprodukte, Sojabohnenmehl sowie verschiedene andere für die Herstellung von Nährmedien an sich geeignete Naturprodukt, insbesondere solche tierischen Ursprungs, enthalten grosse Mengen an Chloridionen. Lösungen dieser Substanzen können jedoch gleichfalls erfindunggemäss behandelt werden, um ihren Chloridionengehalt zu reduzieren. 



   Selbstverständlich eignet sich das erfindungsgemässe Verfahren nur zur Vorbehandlung von Lösungen, da ungelöste Bestandteile des Fermentationsmediums die   lonenaustauschanlage   durch die unlöslichen Ablagerungen verstopfen und unwirksam machen. Auch hochviskose Lösungen   z. B.   von löslicher Stärke, passieren das Ionenaustauscherbett nur schwer und müssen daher mit Wasser soweit verdünnt werden, dass ein freies Fliessen durch das Bett möglich ist. 



   Die erfindungsgemässe Vorbehandlung wässeriger Nährstofflösungen zwecks Entfernung der Chloridionen führt, zufolge der unspezifischen anionaktiven Wirksamkeit einiger Anionenaustauscher, notgedrungen auch zur Entfernung von in der Fermentationsflüssigkeit erwünschten Anionen. So können   z. B.   



  Phosphationen unter gewissen Bedingungen aus der Lösung entfernt werden. Um diese Möglichkeit auszuscheiden und die Belastung der Ionenaustauschsäule zu verringern, wird vorzugsweise die Hauptmenge der Mineralbestandteile wie die Phosphate und Sulfate sowie die Spurenelemente erst   nachder   Entfernung der Chloride durch den Ionenaustausch zugegeben. 



   Der Hauptzweck des erfindungsgemässen Verfahrens ist natürlich die Entfernung der überschüssigen Chloridionen aus den entsprechenden Naturprodukten. Unter manchen Umständen ist es aber auch erwünscht, den Gehalt an bestimmten Kationen, die in toxischen Mengen den Verlauf der Fermentation störend beeinflussen könnten, zu entfernen. Daher können, wenn gewünscht, auch gemischte   lonenaus-   tauscherbetten, welche sowohl Kationen wie Anionen entfernen, verwendet werden. Die Verwendung und der Betrieb solcher Einrichtungen ist dem Fachmann geläufig und braucht daher nicht näher erläutert zu werden. 



   Beispiel 1 : Maisquellwasser mit einem Gehalt von ungefähr   50%   Trockensubstanz (Gewicht/Volumen) wird mit destilliertem Wasser bis zu einer Konzentration   von 2%   verdünnt und sodann durch eine Säule geleitet, die mit   30 I   einer Mischung aus 2   Vol.-Teilen   eines Anionenaustauscherharzes auf Aminbasis (Amberlite IR 45) und 1 Vol.-Teil eines Kationenaustauscherharzes auf Polystyrolbasis mit monofunktionellen Carboxylgruppen (Amberlite IRC 50) beschickt ist. Mit dem Sammeln der abfliessenden Flüssigkeit wird begonnen, sobald ihr spezifischer Widerstand einen Wert von 5000 Ohm/cm erreicht hat und so lange fortgesetzt, bis der   spezifische Widerstand unter 3000 Ohm/cm sinkt.

   Zur Herstellung eines   Nährmediums, das zur Züchtung von Streptomyceten und zur Gewinnung von Tetracyclin geeignet ist und ungefähr 17 Teile Chlorid je Million enthält, werden je 1000 ml des entionisierten Maisquellwassers mit den folgenden Bestandteilen versetzt : 
 EMI2.1 
 
<tb> 
<tb> Saccharose <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP> g <SEP> 
<tb> K2HPO4 <SEP> 15, <SEP> 0 <SEP> g <SEP> 
<tb> (NHHPO <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> MgSq. <SEP> 7H <SEP> O <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> CACAO <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> KBr <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> ZnS04. <SEP> 7HO <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> g <SEP> 
<tb> CuS0. <SEP> 5HO <SEP> 3,0 <SEP> mg
<tb> MnS0. <SEP> 4HO <SEP> 2,5 <SEP> mg
<tb> 
 
 EMI2.2 
 
45niumgruppen IRA 400 und 1 Vol. kationisches Harz auf Polystyrolbasis mit Sulfogruppen IR 120).

   Der Chloridionengehalt der so entionisierten Lösungen beträgt 3, 5 - 29 Teile je Million. 

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   Beispiel 2:Maisqueliwasser mit einem Gehalt von ungefähr 50% Trockensubstanz (Gewicht/Volumen) wird mit destilliertem Wasser bis zu einer Konzentration von   l, 5% verdünnt,   sodann durch eine Säule geleitet, welche mit einer Mischung aus 3   Vol.-Teilen   Amberlite IR 45 und 1   Vol.-Teil Amberlit   IRC 50 beschickt ist und gemäss Beispiel 1 weiter behandelt.

   Zur Herstellung eines für die Züchtung von Streptomyceten und für die Gewinnung von Tetracyclin geeigneten Nährmediums wird das entionisierte Maisquellwasser mit folgenden Substanzen versetzt : 
 EMI3.1 
 
<tb> 
<tb> Saccharose <SEP> 2,0 <SEP> %
<tb> kH2pO4 <SEP> 1, <SEP> 5% <SEP> 
<tb> (NH4)2HpO4 <SEP> 0, <SEP> 5% <SEP> 
<tb> MgSO4. <SEP> 7 <SEP> H2O <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 11/0 <SEP> 
<tb> CaCO <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> 
<tb> ZnSO"o <SEP> 7Hp <SEP> 50,0 <SEP> Teile <SEP> je <SEP> Million
<tb> CUSO" <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> Hp <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> Teile <SEP> je <SEP> Million
<tb> MnSO.

   <SEP> 4 <SEP> H2O <SEP> 2,5 <SEP> Teile <SEP> je <SEP> Million
<tb> KBr <SEP> 0, <SEP> 05%
<tb> 
 
 EMI3.2 
 
 EMI3.3 
 
<tb> 
<tb> Bereitung <SEP> von <SEP> Impfkulturen <SEP> wird <SEP> dieMaisstärkehydrolysat <SEP> 55 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 8, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Baumwol1samenmehl <SEP> 3,5 <SEP> g
<tb> Ammoniumsulfat <SEP> (chloridfrei) <SEP> 6,0 <SEP> g
<tb> Phosphorsäure <SEP> (85%) <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP> g <SEP> 
<tb> Specköl <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> Volé
<tb> Spruenelemente <SEP> FesO4. <SEP> 2H2O <SEP> 41 <SEP> mg
<tb> ZusO4 <SEP> 7 <SEP> HO <SEP> 100 <SEP> mg <SEP> 
<tb> MnSO4. <SEP> 4H2O <SEP> 50mg
<tb> mit <SEP> Leitungswasser <SEP> auf <SEP> 1000 <SEP> ml <SEP> aufgefüllt.
<tb> 
 

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   Das Nährmedium wurde 15 Minuten bei 125 C sterilisiert und dann mit 3 Vol. Wasser verdünnt ; es enthielt annähernd 24 Teile Chloridionen je Million. Bei der Kultur von   2f1/0   Str. aureofaciens im Submersverfahren in üblicher Weise enthält das Gärfiltrat über 5000 y Tetracyclin je ml und weniger als   5% die-   ser Menge an Chlortetracyclin. 



   Zur Regenerierung des Ionenaustauschers wird die Säule mit n-Schwefelsäure mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 100   l/Std.   so lange durch die Säule geleitet, bis in der Waschflüssigkeit keine Chloridionen mehr nachweisbar sind (Säureverbrauch 200 1). Dann wird mit Wasser in der gleichen Weise gewaschen, bis der pH-Wert über 2 ansteigt (450   l   Wasser), worauf die Säule für die Wiederverwendung bereit ist. Diese Säule wurde   fünfzehnmal   verwendet, ohne dass das Chloridbindungsvermögen oder der Nährstoffcharakter des behandelten Maisquellwassers beeinträchtigt worden wären. 



   Zur Durchführung des   erfindungsgemässen Verfahrens   kann das Anionenaustauschharz nicht nur in Sul- fatform, sondern in der   Nitrat- oder Hydroxylform   usw. angewendet werden, wobei ähnliche Ergebnisse wie die vorstehend beschriebenen erzielt und Nährlösungen mit einem Gehalt von 15 bis ungefähr 30 Teilen Chloridion je Million erhalten werden. Dabei beträgt trotz der erzielten hohen Ausbeuten an Antibioticum der Anteil an Chlortetracyclin in allen Fällen weniger als   SOlo.   



    PATENTANSPRÜCHE :    
1. Verfahren zur Vorbehandlung wässeriger Nährmedien für die Züchtung von Tetracyclin bildenden Streptomycetenstämmen, wie Str. aureofaciens, zwecks Erhöhung der Ausbeute an Tetracyclin, dadurch gekennzeichnet, dass die wässerige Nährlösung bzw. eine wässerige Lösung von chloridreichen Bestandteilen des Nährmediums zur Herabsetzung des Chlorionengehaltes mit einem anionenaustauschenden Material so lange in Kontakt gehalten wird, bis derChlorionengehaltsoweitherabgesetzt ist, dassdas gebrauchsfähige Nährme-   dium einen Chlorionengehalt von weniger als   50 Teilen je Million, vorzugsweise 10 Teilen je Million aufweist.

Claims

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Nährlösung nach der Ionenaustauschbehandlung lösliche Phosphate zugesetzt werden.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass wässerige Nährmedien mit einem Gehalt an natürlichen Nährstoffquellen, wie Maisquellwasser, Caseinabbauprodukte oder sonstige proteolytische Abbauprodukte tierischen Ursprungs verwendet und die Lösungen vor der Ionenaustauschbehandlung zweckmässig auf einen Gehalt von weniger als 5 Gew.-% Trockensubstanz verdünnt werden.

4. Ausgestaltung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass für den Chlorionenaustausch ein gemischtes Bett von Anionen- und Kationenaustauschern verwendet wird.