DE1032480B

DE1032480B - Verfahren zur Vorbehandlung eines Fermentationsmediums fuer die Tetracyclinerzeugung

Info

Publication number: DE1032480B
Application number: DEA24916A
Authority: DE
Inventors: Melvin Curtis Firman; Pasquale Paul Minieri; Herman Sokol
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1953-09-28
Filing date: 1954-08-13
Publication date: 1958-06-19
Also published as: NL86837C; CH344180A

Description

Verfahren zur Vorbehandlung eines Fermentationsmediums für die Tetracyclinerzeugung Die Erfindung betrifft die V orbehandlung wäßriger, Nährstoffe enthaltender Fermentationsmedien zur Erzielung höherer Ausbeuten an Tetracyclin aus denselben und stellt eine «eitere Ausbildung des Verfahrens gemäß Patentanmeldung A 20 956 IVa/30h dar, wonach Tetracyclin durch Vergärung eines wäßrigen, Nährstoffe enthaltenden Mediums mittels Tetracyclin erzeugenden Mikroorganismen des Genus Streptomyces erzeugt wird. Ferner ist bekannt, daß bei Gegenwart von Chlorionen in diesem Medium zusammen mit Tetracvclin auch Chlortetracyclin erzeugt wird.
Es ist ein Ziel der Erfindung, ein Fermentationsmedium zu schaffen, das zur Erzeugung von Tetracyclin dienen kann, das praktisch kein Chlortetracy clin enthält. Ein derartiges Tetracyclin ist vom medizinischen Standpunkt aus sehr erwünscht.
Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Vorbehandlung eines wäßrigen, Nährstoffe enthaltenden Fermentationsmediums zur Verbesserung der mittels einem Tetracyclin erzeugenden Mikroorganismus des Genus Streptomyces darin erzielten Ausbeute an Tetracyclin, wobei dieses wäßrige Medium mit einem lonenaustauscher zur Herabsetzung des Chlorionengehalts in Berührung gebracht wird. Vorzugsweise wird die Behandlung so lange fortgesetzt, bis der Chlorionengehalt des wäßrigen Mediums weniger als 50 Teile/Million und vorzugsweise weniger als 10 Teile!Million beträgt.
Zu den verwendeten Mikroorganismen gehören auch Stämme, Varianten oder Mutanten des S. aureofaciens, insbesondere solche, die verhältnismäßig hohe Tetracyclinausbeuten in der Fermentationsflüssigkeit, vorzugsweise mehr als 500 #tg, ml erzeugen. Ein Beispiel hierfür ist ein Organismus UV-8, der eine Mutante des Texas-Mikroorganismus ist. Diese Mutante ist ein neuer Stamm, mit dem die obengenannten Ausbeuten in dem Fermentationsmedium erzielt werden können; er wurde bis jetzt noch nicht beschrieben. Wenn man den Stamm UV-8 auf Waksman-Agar (Journ. Bacter., 7, 1922, S. 339 bis 341, züchtet, dann zeigt er ein starkes 1Iycelwachstum, das zuerst weißlich ist und gelb wird und sich allmählich mit einem pulvrigen weißen Luftmycel bedeckt, das später Sporen bildet. Alte Schrägkulturen zeigen pechschwarze Färbung mit kleinen Flecken von weißem Mycel. Dieses schwarze Wachtum besteht aus einer Masse von Körpern in kurzen Ketten, die leicht zerreißbar sind. Diese Körper variieren in Größe und Form im Bereich von etwa 0,5 bis zu etwa 4,5 m #L und von oval bis schwach eckig kugelförmig. Die mittlere Größe übertrifft diejenige bei S. aureofaciens (NRRL-2209) etwas, und außerdem bestehen auch größere Schwankungen in Größe und Form.
Es wurden bisher viele verschiedene Streptomycesstämme, die sowohl Chlortetracyclin als auch Tetracyclin zu erzeugen vermögen, beobachtet. Während angenommen wird, daß alle diese Stämme trotz einiger ziemlich ausgeprägter Unterschiede in ihrem Wachstumsverhalten und ihren Nährerfordernissen (vgl. Duggar und Mitarbeiter, Annals of the Ne«- York Acaderny of Sciences, Bd. 60,1954, S. 71 bis 101), zutreffend als Streptomyces aureofaciens klassifiziert werden, ist doch immer wieder die Meinung aufgetaucht, daß der eine oder andere Tetracyclin erzeugende Mikroorganismus aus irgendeinem Grunde einer anderen Species angehörte. Im Hinblick auf mögliche Unstimmigkeiten bezüglich der Terminologie und die allgemeine und umfassende Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung wird festgestellt, daß bei der vorliegenden Erfindung alle Mikroorganismen Verwendung finden können, die die oben angegebenen, Tetracyclin erzeugenden Eigenschaften besitzen.
Die Herstellung eines Fermentationsmediums, das weniger als 10 Teile/Million Chlorionen enthält, gestaltet sich verhältnismäßig einfach, wenn es sich um ein sogenanntes synthetisches Medium handelt, d. h. um ein Medium, in dem der Kohlenstoffbedarf der Gärung von verhältnismäßig reinen Materialien, wie Saccharose, und der Stickstoffbedarf durch Ammoniumsulfat oder andere hochgereinigte chemische Verbindungen gedeckt wird. Ungünstigerweise sind derartige synthetische Medien sehr teuer und weisen einen Mangel an einigen der wesentlichen Nährstoffe für den Fermentationsprozeß zur Erzielung hoher Tetracyclinausbeuten auf. Aus diesen und anderen noch nicht völlig geklärten Gründen ist es zweckmäßig, natürlich vorkommende Stoffe bei der Herstellung der Fermentationsmedien zu verwenden, beispielsweise Maisquellwasser, bei der Tierschlachtung anfallende Flüssigkeit, Kaseinabbauprodukte u. dgl. Diese Stoffe sind nicht nur billiger als synthetische Medien, sie liefern auch wesentlich höhere Ausbeuten an dem gewünschten Antibiotikum. Diese Stoffe enthalten jedoch beträchtliche Mengen Chlorionen, weshalb bei der Tetracyclinerzeugung durch Gärung gleichzeitig unerwünscht große Mengen Chlortetracyclin gebildet werden.
Natürliche Materialien, wie Maisquellwasser, können mit Wasser auf eine Konzentration verdünnt werden, die für ein Durchleiten durch ein Ionenaustauscherbett geeignet ist, und der Chlorionengehalt kann bis zu dem als notwendig erachteten Ausmaß entfernt werden. Der weitere Bedarf des Fermentationsmediums an Stickstoff, Kohlenstoff und Mineralbestandteilen kann dann der deionisierten Maisquellwasserlösung zugesetzt werden, wonach das Fermentationsmedium für das Verfahren gebrauchsfertig ist. Maisquellwasser enthält beträchtliche Mengen Chlorionen in der Größenordnung von 0,15 bis 0,5 Gewichtsprozent, und bei der Behandlung dieses Stoffes muß wesentlich mehr Sorgfalt ausgeübt werden als im Fall anderer bei der Herstellung eines Fermentationsmediums verwendeter natürlicher Stoffe.
Kasein, das sich zur Herstellung von Fermeiitaticnsflüssigkeiten sehr gut eignet, kann große Mengen Chlorionen je nach der Herstellungsmethode enthalten. Ein Chlorionengehalt von bis zu 0,3 % wird häufig angetroffen. Durch enzymatischen Abbau aus Kasein erhaltene Produkte, die ebenfalls bei der Herstellung von Fermentationsmedien verwendbar sind, können sogar noch höhere Chlorionenkonzentrationen enthalten. Derartige Produkte sollen erfindungsgemäß behandelt werden, wenn sie zur Herstellung von Fermentationsflüssigkeiten für die Tetracyclinerzeugung verwendet werden.
Bei der Tierschlachtung anfallende Flüssigkeit, Fleischmehl- und Fischmehlabbauprodukte und verschiedene andere Stoffe, besonders tierischen Ursprungs, enthalten große Mengen Chlorionen, und auch die aus diesen Stoffen hergestellten Lösungen sollen zur Verminderung ihres Chlorionengehalts gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden.
Es ist selbstverständlich, daß in unlöslicher Form vorliegende Bestandteile des Fermentationsmediums nicht durch ein Ionenaustauscherbett geleitet werden können, ohne dieses nach kurzer Zeit durch unlösliche Ablagerungen stillzulegen. Die vorliegende Erfindung umfaßt deshalb die Behandlung der löslichen, wie hier erwähnten Bestandteile des Mediums. Auch hochviskose Substanzen bereiten beim Durchleiten durch ein Ionenaustauscherbett Schwierigkeiten und werden deshalb zweckmäßig m;t Wasser auf eine Konsistenz verdünnt, die einen guten Fluß durch das Bett erlaubt.
In einigen Fällen, wo unlösliche Stoffe dem Fermentationsmedium zugesetzt werden sollen, können diese vor der Zugabe zu dem Fermentationsmedium zur Entfernung von Chlorionen mit deionisiertem @Vasser gewaschen werden. Die Behandlung wird demnach durch die Natur des jeweiligen Stoffes bestimmt. So kann beispielsweise rolle Stärke, die oft beträchtliche Mengen Chlor-Ionen enthält, mit deionisiertem Wasser gewaschen, dem Fermentationsmedium zugesetzt und dann gekocht oder in anderer Weise behandelt werden, um sie für die Assimilierung durch den vergärenden :Mikroorganismus verfügbar zu machen. Lösliche Formen der Stärke können nach geeigneter Verdünnung zur Entfernung der Chlorionen durch ein Ionenaustauscherbett geleitet werden.
Sojabohnenmehlzubereitungen weisen oft Mengen an Chlorionen auf, die für die Tetracyclinerzeugung zu groß sind. Bei Verwendung dieser Art in merklichen Mengen sollen diese ebenfalls nach der oben beschriebenen Arbeitsweise mittels Ionenaustauschern behandelt werden. Das gleiche gilt für andere in der 'Natur vorkommende Stoffe, die zur Herstellung von Fermentationsflüssigkeiten verwendet werden, wenn ihr Chlorionengehalt zu hoch ist.
Bevorzugt werden solche Tetracyclin erzeugenden Stämme von Streptomyces aureofaciens, die mehr als 500 #Lg!ml Antibiotikum erzeugen. In derartigen Fällen kann das Fermentationsmedium 10 Teile/Million Chlorionen enthalten, dcchwerden niedrigere Mengen bevorzugt. Außerdem haben Verbesserungen bei der Selektion von Stämmen Tetracyclin erzeugender Streptomyces ausgeprägte Ausbeuteerhöhungen an erzeugbarem Tetracyclin ergeben, so daß es nunmehr leicht möglich ist; 5000 #tgjml oder darüber an Tetracyclin zu erzeugen. Dieses Ergebnis wird nicht nur durch die Selektion besonders hoch produktiver Stämme für Tetracyclin, sondern auch durch sorgfältige Wahl der zur Zubereitung des Fermentationsmediums dienenden Stof£@ und durch Beschränkung des Chlorionengehaltes erzielt. Vorteilhaft werden deshalb S. aureofaciens Stämme verwendet, die zur Erzeugung von Tetracyclinmengen über 500 #tg/ml in Fermentationsmedien fällig sind, die natürliche Rohstoffe der zur Zeit bei anderen Fermentationsverfahren gewöhnlich verwendeten Art enthalten, die jedoch zur möglichst weitgehenden Entfernung des Chlorionengehaltes behandelt wurden. Auf diese Weise ist es möglich, rohe Fermentationsflüssigkeiten herzustellen, in denen nur ein geringer Anteil des gesamten Antibiotikums als Chlortetracyclin vorliegt.
Wie bereits erwähnt, ist es zulässig, aber nicht erwünscht, daß bis zu 8 bis 10 °,.'o des Gesamtantibiotikums als Chlortetracyclin in der rohen Fermentationsflüssigkeit vorliegen. Eine Fermentationsflüssigkeit, die 5000 #Lg/ml Tetracyclin enthält, kann deshalb bis zu 500 g,g/ml Chlortetracyclin enthalten, das sich aus dem Vorhandensein von 40 bis 50 Teilen; .Million Chlorionen in den Fermentationsflüssigkeiten ergibt, wenn der Mikroorganismus ein guter Verwerter ist. Wenn der bei dem Verfahren verwendete besondere Stamm die Chlorionen nicht vollständig verwertet, dann kann die Fermentationsflüssigkeit größere Mengen an Chlorionen enthalten. In derartigen Fällen brauchen viele natürliche Rohstoffe nicht nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt zu werden, da ihr Chlorionengehalt bereits niedrig genug ist. Zu den zur Erzielung hoher Ausbeuten an Antibiotikum wirksamsten Substraten gehört Maisquellwasser, das wie bereits erwähnt, einen sehr hohen Chlorionengehalt aufweist, und Fermentationsflüssigkeiten, die merkliche Mengen dieses Stoffes enthalten, können durch die erfindungsgemäße Behandlung verbessert werden.
In Übereinstimmung mit anderen Fermentationsverfahren zur Erzeugung von Antibiotika enthalten die Fermentationsflüssigkeiten Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralsalze. Viele davon sind verhältnismäßig chlorionenfrei und werden zur Ergänzung der obengenannten erfindungsgemäß mit Ionenaustauschern behandelten Stoffe verwendet. Dazugehören unter anderem Saccharose, Glukose, Dextrin, Zuckeralkohole, Zitronensäure, Stärke, Baumwollsamenmehl, :: Maismehl, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl und verschiedene andere kohlenstoff- und stickstoffhaltige Substanzen, die in variierenden Mengen von etwa 1/2 bis 5 Gewichtsprozent oder mehr des Gesamtgewichts des Fermentationsmediums verwendet werden. Zur Erzielung höherer Ausbeuten und aus wirtschaftlichen Gründen werden oft Mischungen dieser Stoffe zusammen mit den obenerwähnten, in der Natur vorkommenden Produkten verwendet, die zur Entfernung übermäßiger Mengen von Chlorionen mit Ionenaustauschern behandelt wurden.
Bei der praktischen Durchführung werden den Fermentationsmedien außerdem Mineralsalze in variierenden Mengen zur Unterstützung des Wachstums des Mikroorganismus und zur Förderung der Bildung hoher Tetracyclinausbeuten zugesetzt. Hierzu gehören unter anderem Ammoniumphosphat, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat und die verschiedenartigsten Spurenelemente, wie Kobalt, Kupfer, Zink, Mangan, Eisen, Chrom usw. Die Verwendung derartiger Spurenelemente zur Förderung der Gärung ist in der Fachwelt allgemein bekannt und braucht nicht näher erläutert zu werden.
Bei der Behandlung wäßriger Lösungen der Nährstoffe für das Fermentationsverfahren zur Entfernung von Chlorionen kann es auf Grund des nicht selektiven Anionenadsorptionsvermögens einiger Anionenaustauscher vorkommen, daß einige der in der Fermentationsflüssigkeit enthaltenen erwünschten Anionen entfernt werden. Beispielsweise können unter gewissen Bedingungen Phosphationen aus der Lösung entfernt werden. In entsprechender Weise können auch Sulfationen entfernt werden. Um diese Möglichkeit auszuschalten und die Beladung auf der Ionenaustauschersäule herabzusetzen, werden vorzugsweise die meisten der Mineralbestandteile, wie Phosphate und Sulfate, sowie die Spurenbestandteile nach der Chloridentfernung durch Ionenaustauscherbehandlung zugesetzt.
Das Hauptziel der Ionenaustauscherbehandlung besteht selbstverständlich in der Entfernung des Überschusses an Chlorionen aus natürlich vorkommenden Stoffen, die übermäßige Mengen davon enthalten. Unter gewissen Bedingungen kann es auch zweckmäßig sein, bestimmte kationische Gruppen vor der Gärung zu entfernen. Dementsprechend kann ein Mischbett, mit dem sowohl Kationen als auch Anionen entfernt werden, gewünschtenfalls verwendet werden. Die Anwendung und Einstellung eines derartigen Ionenaustauschermischbettes ist dem Fachmann bekannt und braucht nicht näher erläutert zu werden.
Zu den erfindungsgemäß verwendbaren Ionenaustauschern gehören solche wasserunlöslichen Stoffe, die zur Adsorption oder andersartigen Entfernung von Chlorionen aus wäßrigen Lösungen fähig sind. Es handelt sich dabei gewöhnlich um synthetische Harze mit freien Aminogruppen, z. B. Phenolformaldehyd, Polyaminkondensate, Melamin, Guanidin-Formaldehyd-Harze und Polyalkylen-Polyamin-Harze. Der genaue chemische Bau dieser Substanzen und die Art und Weise, in welcher die Chlorionen adsorbieren, ist nicht völlig geklärt. Sie sind jedoch im Handel erhältlich, wenn man den Verwendungszweck, nämlich die Entfernung von Chlorionen aus wäßrigen Lösungen, angibt. Es stehen die verschiedenartigsten Typen zur Verfügung.
Man kann zwar erfindungsgemäß Stoffe anwenden, die einfach Chlorionen adsorbieren, doch ist ihre technische Verwendung nicht ratsam, da man sie nicht wieder verwenden kann. Die Bezeichnung »Austausch;<, wie sie im Zusammenhang mit den erfindungsgemäß verwendeten Ionenaustauschern angewandt wird, soll sich auf ein Material beziehen, das nach der Adsorption von Chlorionen aus einer Lösung durch Entfernung der so adsorbiertep Chlorionen reaktiviert und bei der Herstellung weiterer Chargen von Fermentationsflüssigkeit immer wieder verwendet werden kann.
Einige Ionenaustauschbetten können so betrieben werden, daß nur Anionen aus der Lösung entfernt werden. In anderen kann ein Ersatz erfolgen. Beispielsweise werden mit einem Ionenaustauscherharz, das im Sulfatzustand eingesetzt wird, Chlorionen entfernt und Sulfationen zum Ersatz derselben in die Lösung abgegeben. Obwohl dies gewöhnlich nicht notwendig ist, können diese Sulfationen mittels eines zweiten Ionenaustauscherbettes, das in Verbindung mit dem ersten betrieben wird, adsorbiert werden. Das gleiche gilt für etwa vorhandene andere Anionen. Aus diesen Gründen ist es von Bedeutung, daß der Anionenbedarf der Nährmedien, insbesondere an Phosphat, nach der Ionenaustauscherbehandlung eingestellt wird.
Nach der Behandlung von einigen der Bestandteile des Fermentationsmediums mit Ionenaustauscherharzen können die anderen bei der Fermentierung verwendeten erforderlichen Stoffe zugefügt werden. Die Mischung wird dann sterilisiert und mit dem Tetracyclin erzeugenden Mikroorganismus geimpft. Die Fermentierung wird dann in üblicher Weise geführt. Beispiel 1 Ein Maisquellwassermedium wurde wie folgt hergestellt Maisquellwasser mit einem Feststoffgehalt von etwa 50 % (Gew./Gew.) wurde mit destilliertem Wasser auf eine Endkonzentration von 20/, verdünnt. Die so erhaltene verdünnte Flüssigkeit wurde durch eine Säule geleitet, die mit 30 1 einer Mischung aus 2 Volumen Anionenaustauscherharz und 1 Volumen Kationenaustauscherharz gefüllt war. Mit dem Auffangen der austretenden Flüssigkeit wurde erst begonnen, nachdem der Widerstand auf 5000 Ohmcm gestiegen war, und so lange fortgesetzt, bis der Widerstand auf unter 3000 Ohmcm abgefallen war. Zu 1000 ml der deionisierten Maisquellwasserlösung wurden die folgenden Bestandteile zur Zubereitung eines für die Züchtung des Inokulums und die Tetracyclinerzeugung geeigneten Mediums gegeben, wobei das erhaltene Medium etwa 17 Teile/Million Chloridion enthielt, obwohl ein niedrigerer Chloridgehalt bevorzugt ist. Saccharose....................... 30,0 g K,HP04 ........................ 15,0 g (NHJ,HP0..................... 5,0 g MgS04 - 7 11,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,0 g CaCO3 .......................... 1,0 g K Br ............................ 0,5 g ZnS04 7 11,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05 g CuS0,, 5 H20 . . .. . . .. . . .. . . . . . . . 3,0 mg MnSO, 4 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,5 mg Maisquellwasserflüssigkeiten mit Konzentrationen von 1,5 und 2,00/" wurden mit Harzmischungen deionisiert, die 3 Volumen anionisches Austauschharz und 1 Volumen kationisches Austauschharz enthielten (etwa zehn Ansätze). Ein Ansatz wurde durchgeführt mit einem Mischharz aus 2 Volumen anionischem Harz und 1 Volumen kationischem Harz. Das Verhältnis von Harzvolumen zu Volumen der austretenden Flüssigkeit wurde mit 1 : 3 als zufriedenstellend festgestellt. Mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,01 ml Lösung je ml Harz und Minute wurde eine bessere Deionisierung als mit 0,016 ml Lösung je ml Harz und Minute erzielt. Die Verwendung von zwei Harzsäulen in Serie ergab eine gute Deionisation. Die Chlorionenprüfung der in dieser Weise deinonisierten Lösungen ergab die Anwesenheit von 3,5 bis 29 Teilen j e Million.
Beispiel 2 Maisquellwasser mit einem Feststoffgehalt von etwa 500/0 (Gew./Gew.) wurde mit destilliertem Wasser auf eine Endkonzentration von 1,5°1o verdünnt. Das verdünnte Material wurde durch eine mit einer Mischung aus 3 Volumen Anionenaustauscher und 1 Volumen Kationenaustauscher gefüllte Säule geleitet. Mit dem Auffangen der austretenden Flüssigkeit wurde erst begonnen, nachdem der Widerstand auf 5000 Ohmcm angestiegen war, und damit fortgefahren, bis er unter 3000 Ohmcm abgesunken war. Zur Herstellung eines zur Züchtung des Inocolums für die Tetracyclinerzeugung geeigneten Mediums wurden der deionisierten Maisquellwasserlösung folgende Stoffe zugesetzt Saccharose.................... 2,0°,'o K Hz P 04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,5 °/o (NH4)2HP0................... 0,5°/o MgS04 - 7 H20 . ... . . . ..... . . . 0,20/0 CaC 03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,10,/0 Zn S 04 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . 50,0 Teile/Million CuS0, 5 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0 Teile/Million Mn S O, 4 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . 2,5 Teile/ Million K Br . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05 Otlo Für die Verwendung sowohl bei der Herstellung des Impfstoffes als auch für Fermentationskolben wurde dieses Medium in 100 ml ausmachenden Teilen in 500-ml-Erlenmeyerkolben gegeben und durch Behandlung im Autoklav während 20 Minuten bei 121'C und 1,05 Atm. (15 psi) sterilisiert. Der Chloridgehalt des Mediums nach der Sterilisation betrug 17,7 Teile/Million.
Durch Beimpfen von Kolben mit einer lyophilisierten Mischung aus Sporen und Mycel von Streptomyces aureofaciens (Stamm 201-15) und Bebrüten der Kolben bei 26° C auf einer Schüttelmaschine mit Hin- und Herbewegung während 48 Stunden wurde ein Inocolum hergestellt. 5 Volumprozent des 48stündigen Inocolums wurden zur Beimpfung der Fermentationskolben verwendet, die dann unter den gleichen Bedingungen 48 Stunden bebrütet wurden. Die antibiotische Aktivität wurde nachgewiesen, indem eine mit filtrierter Flüssigkeit gesättigte 13-mm-Papierscheibe auf eine mit Escherichia coli beimpfte Agarplatte aufgebracht und 18 Stunden bei 30° C bebrütet wurde.
400 ml dieser Maische wurden mit 2,4 g Oxalsäure und 1,6 g Ammoniumoxalat behandelt. Nach 10 Minuten langem Rühren wurde die Mischung filtriert. Dann wurde das Filtrat mit 80 ml Essigsäureäthylester verrührt und der pu-ZVert auf 8,5 eingestellt. Die die '.Masse der Aktivität enthaltende Lösungsmittelphase wurde mit 5 ml Wasser geschüttelt und der pH-Wert auf 2 eingestellt. Mit der unteren Phase des Systems ButanoljWasser, enthaltend 2,5% Essigsäure, auf 1:500 verdünnt, wurden Absorptionsmaxima im Ultravioletten bei 270 und 360 mi, erhalten.
Gegenstromverteilungsanalyse (48 Überführungen Butanol zu 2,5 0/0 Essigsäure) dieses Konzentrats zeigte, daß es Tetracyclin enthielt. Dieses Ergebnis wurde am Ende der Verteilung durch Verdünnung einer jeden der unteren Phasen mit Methanol und Bestimmung der optischen Dichte bei 370 m#t erhalten. Der Hauptanteil der Aktivität wurde beim Rohr 19 gefunden. Die Zahlen der Rohre mit Spitzengehalt an Chlortetracyclin und Oxytetracyclin waren 26 bzw. 16.
Beispiel 3 17,8 kg eines schwach anionischen Austauscherharzes vom Phenol-Formaldehyd-Polyamin-Typ wurden mit 1 n-Schwefelsäure neutralisiert, in eine Säule von 15,24 cm Durchmesser bis auf eine Höhe von 193 cm eingefüllt und mit Wasser gewaschen, bis die austretende Flüssigkeit ein pH von 2,0 besaß. 15,0 kg Maisquellwasser wurden mit 45 1 Wasser verdünnt und bei 50° C filtriert. Der Kuchen wurde mit 151 Wasser gewaschen. Die Maisquellwasserlösung wurde mit einer Geschwindigkeit von 401/Stunde durch die Säule geleitet. In dem Eluat ergab sich nach der Behandlung des Äquivalents von 13,5 kg Maisquellwasser ein positiver Chloridtest. Die chlorionenfreie, behandelte Maisquellwasserlösung wurde mit konzentriertem Ammoniumhydroxyd auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt und war dann gebrauchsfertig.
Es wurde ein Fermentationsmedium mit folgenden Bestandteilen zubereitet Harzbehandeltes Maisquellwasser .. 20 g/1 (Feststoffe) Maisstärke, mit Schwefelsäure abgebaut, @,fließfähig.c . . . . . . . . . . . . . . 55 g/1 Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . 8,0 g!1 Baumwollsamenmehl . . . . . . . . . . . . . 3,5 g/1 Ammoniumsulfat mit besonders niedrigem Chloridgehalt . . . . . . . . . 6,0 g/1 85 %ige Phosphorsäure . . . . . . . . . . . 0,24 g/1 Schmalzöl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0% (Volumen) FeSO,, - 2 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 mg/1 ZnS04 - 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 mg /1 Mn S O, - 4 H,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 mg, 1 Leitungswasser auf . . . . . . . . . . . . . . . 1000M1 Das Medium wurde 15 Minuten bei 125°C sterilisiert und dann mit 3 Volumen Leitungswasser verdünnt. Es enthielt etwa 24 Teile/Million Chlorionen. Dann wurde es mit 2 0I0 seines Volumens mit S. aureofaciens (Stamm S-77), enthaltend, bezogen auf eine Impfstoff-Feststoff-Basis, 1 Gewichtsprozent Maisquellwasser, 3 0/', Dextrin, 0,625 0/0 Calciumcarbonat und 0,2% Ammoniumsulfat, beimpft. Die Fermentation wurde bei 26 bis 27°C 112 Stunden unter mechanischer Bewegung und Belüftung mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,5 Volumen Luft je Volumen Medium und Minute geführt.
Beim Abernten wurde gefunden, daß die Gärflüssigkeit über 5000 t.g/ml Tetracyclin mit einem Gehalt von weniger als 5 % dieser Menge an Chlortetracychn enthielt. Zur Regenerierung der Säule wurde 1 n-Schwefelsäure mit einer Geschwindigkeit von 1001/Stunde durch dieselbe geleitet, bis die austretende Flüssigkeit keine Chlorionen mehr enthielt (es waren 2001 Säure erforderlich) ' dann wurde Wasser mit einer Geschwindigkeit von 1001/Stunde hindurchgeleitet, bis der pH-Wert über 2,0" anstieg. Hierzu waren 4501 Wasser nötig. Dann war die '' Säule wieder verwendbar. Diese Säule wurde 15mal verwendet, ohne daß ein Absinken in ihrer Chlorionenentfernungskapazität oder in den Nähreigenschaften des erhaltenen Maisquellwassers festgestellt werden konnte. Beispiel 4 Es wurde eine Säule ähnlich der im Beispiel 5 beschriebenen unter Verwendung eines stark anionenadsorbierenden Ionenaustauscherharzes vom Phenolformaldehyd-Polyamin-Typ hergestellt. Maisquellwasser wurde gernU@ Beispiel 3 durch die Säule geleitet, ein Fermentations-' medium hergestellt, sterilisiert und mit dem gleichen wie oben beschriebenen, Tetracyclin erzeugenden Stamm vrn@: S. aureofaciens beimpft. Die Fermentation wurde in ent'!!, sprechender Weise geführt. Das dabei erhaltene Ferme'' , tationsmedium enthielt etwa 18 Teile/Million Chlorionen. Die Gärflüssigkeit enthielt beim Abernten 3510 y/ml Tetracyclin und 255 y/ml Chlortetracyclin.
Beispiel 5 Es wurde ein Kationen-Anionen-Austauscherharz-Mischbett aus gleichen Teilen, wobei ein stark kationenaustauschendes Harz vom Sulfonsäuretyp verwendet wurde, hergestellt und, wie im Beispiel 3 beschrieben, mit 1 n-Ammoniumsulfat behandelt.
Maisquellwasser wurde zur Entfernung von Chlorionen in der oben beschriebenen Weise in dieser Säule behandelt und gemäß Beispiel 5 ein Fermentationsmedium hergestellt. Das verdünnte und sterilisierte Medium wurde dann mit S. aureofaciens, Stamm S-77, beimpft und die Fermentation unter den im Beispiel 5 angegebenen Bedingungen geführt. Zu Beginn der Fermentation enthielt das Medium etwa 28 Teile/Million Chlorionen. Die Gärflüssigkeit enthielt 4670 y/ml Tetracyclin und 390 y/ml Chlortetracyclin.
Beispiel 6 Bei Schüttelkolbenversuchen unter Verwendung des Fermentationsmediums gemäß Beispiel 3, wobei das Medium mit 200 mg Phosphorsäure je Liter angereichert wurde, wurden 2830 y/ml Tetracyclin und 210 y/ml Chlortetracyclin erhalten.
Wenn die Fermentation, wie im vorstehenden Absatz beschrieben, unter Verwendung von unbehandeltem Maisquellwasser mit einem Gehalt von 1 % an Gesamtfeststoffen geführt wurde, dann wurde gefunden, daß die Gärflüssigkeit etwa 1600 y/ml Tetracyclin und 1600 y/ml Chlortetracyclin enthielt, woraus hervorgeht, daß die verfügbaren Chlorionen in dem Maisquellwasser zur Erzeugung höherer Anteile Chlortetracyclin verwertet wurden. Beispiel 7 Das Anionenaustauscherharz kann in verschiedenen Formen, beispielsweise als Sulfat, Nitrat, Hydroxyd u. dgl., verwendet werden. Bei Wiederholung der im Beispiel 3 beschriebenen Arbeitsweise unter Verwendung des Ionenaustauscherharzes im Nitratzustand, hergestellt durch Behandlung mit 1 n-Salpetersäure an Stelle von Schwefelsäure, ergaben zwei verschiedene Ansätze 3590 y/ml Tetracyclin und 210 y/ml Chlortetracyclin bzw. 4460 y/ml Tetracyclin und 230 y/ml Chlortetracyclin.
Bei den im vorstehenden beschriebenen Ansätzen enthielt die Fermentationsflüssigkeit zwischen etwa 15 und 30 Teilen/ Million Chlorionen, die von dem S. aureofaciens Mikroorganismus unter Bildung des auf Grund des Chlorionengehaltes des Mediums möglichen Chlortetracyclins voll ausgewertet wurden. Wegen der erzielten hohen Ausbeuten an Antibiotikum beträgt jedoch der Chlortetracyclinanteil bei den Ansätzen, bei denen Ionenaustauscherharze zur Behandlung des Maisquellwassers verwendet wurden, durchweg weniger als 8 °/o.

Claims

PATENTANSPRüCHE: 1. Verfahren zur Vorbehandlung eines wäßrigen, Nährstoffe enthaltenden Fermentationsmediums zur Verbesserung der bei der Fermentation mittels eines Teträcyclin erzeugenden Mikroorganismus des Genus Streptomyces erzielbaren Ausbeute, dadurch gekennzeichnet, daß dieses wäßrige Medium mit einem Ionenaustauscher zur Herabsetzung des Chlorionengehalts in Berührung gebracht wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung so lange fortgesetzt wird, bis der Chlorionengehalt des Mediums weniger als 50 Teile/Million und vorzugsweise weniger als 10 Teile/ Million beträgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß dem Medium nach der Ionenaustauschbehandlung Phosphationen zugesetzt werden.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein natürliches Medium, beispielsweise Maisquellwasser, Kaseinabbauprodukte und bei der Tierschlachtung anfallende Flüssigkeiten verwendet werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das natürliche Medium mit Wasser auf eine Konsistenz von weniger als etwa 5 Gewichtsprozent, bezogen auf die Trockenstoffe, verdünnt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Ionenaustauscher ein Anionenaustauscher oder ein aus Anionen- und Kationenaustauschern bestehendes Mischbett verwendet wird.