DE1570027B2

DE1570027B2 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von Flavin-adenin-dinucleotid

Info

Publication number: DE1570027B2
Application number: DE1570027A
Authority: DE
Inventors: Nobuo Nakamura; Masao Machida Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1964-06-24
Filing date: 1965-06-23
Publication date: 1974-05-02
Also published as: DE1570027C3; DE1570027A1; US3445336A

Description

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Das Fermentationsmedium hat die folgende Zu- um- das FAD in die wäßrige Schicht zu überführen;

sammensetzung je Liter Wasser: dann wird die wäßrige Schicht konzentriert, Äthanol

hinzugegeben, wodurch eine Fällung von FAD er-

Glucose 100 g halten wird. Durch Abtrennung und Trocknen des

Harnstoff 6g 5 Niederschlags werden 925 mg FAD einer Reinheit

KH₂PO₄ 10 g von 82% erhalten.

K₂HPO₄ 10g Beispiel 2

MgSO₄-7H₂O 10 g ^P

CaCl₂- 2H₂O 0,1 g Zur Herstellung einer Impfkultur wird ein Stamm

Calciumpantothenat 10 mg io von Micrococcus sodonensis ATCC 15 932 in einem

Thiaminhydrochlorid 2 mg Kulturmedium, das 2 % Glucose, 1 % Pepton, 1 °/o

Biotin 30 μ" Hefeextrakt und 0,25 °/o NaCl enthält, 24 Stunden

bei 30° C gezüchtet. Die erhaltene Impfkultür wird

Das Fermentationsmedium wird wie folgt herge- zum Beimpfen des gleichen Fermentationsmediums stellt: 250-ml-Erlenmeyerkolben, die 19 ml einer 15 wie in Beispiel 1 in einer Menge von 10 Volumprowäßrigen Lösung enthalten, die alle obengenannten zent verwendet. Nach 48 Stunden wird zu der Fer-Bestandteile außer dem Harnstoff enthält, werden in mentationsflüssigkeit Adenin in einer Menge von einem Autoklav unter einem Druck von etwa 1 mg/ml zugegeben. Nach weiterem 72stündigem 1 kg/cm² 15 Minuten sterilisiert. Weiterhin wird eine Züchten wird gefunden, daß sich 94 μg/ml Flavin-12°/oige Lösung von Harnstoff hergestellt und sterili- 20 adenin-dinucleotid in der Fermentationsflüssigkeit siert. 1-ml-Anteile der Harnstofflösung werden dann angesammelt haben.

in die Erlenmeyerkolben gegeben, ehe diese mit der Nachdem 1 Liter der so erhaltenen Kulturbrühe

obengenannten Impfkultur versehen werden. filtriert worden ist, wird das erhaltene Filtrat auf pH 8

Nachdem die Fermentation 48 Stunden fortgesetzt eingestellt und über eine Säule (200 ml) mit einem

worden ist, wird zu der Fermentationsflüssigkeit 25 stark basischen Anionenaustauscherharz auf PoIy-

0,1 mg/ml Flavin-mononucleotid und 0,5 mg/ml styrolbasis (Cl-Form) geschickt. Nach dem Waschen

Adenin gegeben. Es wird dann weitere 48 Stunden der Säule mit Wasser werden die Verunreinigungen

gezüchtet. Nach Ablauf dieser Zeit wird gefunden, mit 750 ml 0,02 n-HCl/0,1 m-Natriumchlorid (wäß-

daß sich in der Fermentationsflüssigkeit 295 iig/ml rigeLösung)unddannFADmit0,02n-HCl/l,5m-Na-

Flavin-adenin-dinucleotid angesammelt haben. 3° triumchlorid (wäßrige Lösung) eluiert, wobei etwa

Nachdem 5 1 der erhaltenen Kulturbrühe filtriert 300 ml Eluat erhalten werden. 88 mg FAD sind in

worden sind, wird das Filtrat auf einen pH-Wert von dem Eluat enthalten.

8,0 eingestellt und über eine Säule (1 Liter) mit Das Eluat wird über eine Säule (50 ml) mit einem einem stark basischen Anionenaustauscherharz auf Ionenaustauscherharz auf Polystyrolbasis (Cl-Form) Polystyrolbasis (Cl-Form) geschickt. Nach Waschen 35 geschickt; dann werden 200 ml Wasser bei pH 3,0 der Säule mit Wasser werden die Verunreinigungen hindurchgeschickt. Die Säule wird der Elution mit mit 15 1 0,02 n-HCl/0,125 m-Natriumchloridlösung einer wäßrigen, auf pH 9,0 eingestellten Aceton-(wäßrige Lösung) eluiert und anschließend die Säule lösung, die 1 % Phenol enthält, unterzogen, wobei der Elution mit einer wäßrigen 0,02 n-HCl/1 m-Na- 200 ml Eluat mit 82 mg FAD erhalten werden,
triumchloridlösung unterzogen, wobei 2,5 1 Eluat, 40 Das Eluat wird unter vermindertem Druck kondas 1150 mg FAD enthält, erhalten werden. zentriert und dann mit Ammoniumsulfat gesättigt, Das erhaltene Eluat wird über eine Säule (200 ml) wodurch FAD in der Phenolschicht konzentriert wird, mit einem Ionenaustauscherharz auf Polystyrolbasis Dann wird die Phenolschicht abgetrennt und mit (Cl-Form) geschickt und die Säule mit Wasser von Äther und einer kleinen Menge Wasser versetzt, wopH 3,0 gewaschen und der Elution mit einer wäß- 45 bei FAD in die wäßrige Schicht übergeht. Nach einer rigen l%igen Phenollösung, die auf pH 9,0 einge- Wiederholung der Phenolextraktion wird genügend stellt war, unterworfen. 1 Liter des Eluats wird unter Äthanol zur wäßrigen Lösung, die FAD enthält, gevermindertem Druck auf 70 ml konzentriert und mit geben und die Lösung stehengelassen, wodurch Ammoniumsulfat gesättigt, wobei das Eluat in eine 74 mg FAD einer Reinheit von 90 % erhalten werden. Phenolschicht, die das FAD enthält, und eine wäß- 50 Wenn zu dem in Beispiel 2 verwendeten Medium rige Schicht getrennt wird. Äther und eine kleine kein Adenin zugegeben wird, sammeln sich nur 10 Menge Wasser werden zur Phenolschicht gegeben, bis 20 μ^αη³ FAD an.

Claims

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welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man Brevi-

Patentanspruch: bacterium ammoniagenes ATCC 6872 oder Micro-

coccus sodonensis ATCC 15932 in einem Nähr-

Verfahren zur fermentativen Herstellung von medium üblicher Zusammensetzung unter aeroben

Flavin-adenin-dinucleotid durch Züchten eines 5 Bedingungen bei einer Temperatur von etwa 20 bis

Mikroorganismus in Gegenwart entsprechender 40° C und einem pH-Wert von etwa 5,5 bis 9,0 in

Vorläufer, dadurch gekennzeichnet, daß Gegenwart von Adenin oder Adenin und Flavin-

man Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 mononucleotid züchtet und das im Kulturmedium

oder Micrococcus sodonensis ATCC 15 932 in angereicherte Flavin-adenin-dinucleotid in üblicher

einem Nährmedium üblicher Zusammensetzung io Weise isoliert.

unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen

von etwa 20 bis 40° C und einem pH-Wert von Verfahrens werden Flavinmononucleotid und Ribo-

etwa 5,5 bis 9,0 in Gegenwart von Adenin oder flavin kaum in dem Kulturmedium gebildet, während

Adenin und Flavinmononucleotid züchtet und sich von dem gewünschten Flavin-adenin-dinucleotid

das im Kulturmedium angereicherte Flavin- 15 große Mengen ansammeln.

adenin-dinucleotid in üblicher Weise isoliert.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens gelingt es, FAD in wirksamer und einfacher Weise in hoher Reinheit und Ausbeute herzustellen.

Als Kulturmedium sind sowohl künstliche als

20 auch natürliche Nährmedien geeignet, welche die für das Wachstum der eingesetzten Mikroorganismen

Flavin-adenin-dinucleotid (FAD) spielt eine wich- wesentliche Nährstoffe enthalten. Zu diesen Nähr-

tige Rolle als Coenzym bei den verschiedensten stoffen zählen eine Kohlenstoff quelle, eine Stickstoff-

enzymatischen Reaktionen in der lebenden Zelle. quelle, anorganische Verbindungen sowie bestimmte

Bekanntlich ist das Flavin-adenin-dinucleotid die 25 Wuchsstoffe.

biochemsich aktive Form von Vitamin B₂, Ribo- Als Vorläufer des Flavin-adenin-dinucleotids wird

flavin, und ist in letzter Zeit in großen Mengen für dem Nährmedium erfindungsgemäß die Purinbase

die verschiedensten Zwecke an Stelle von Ribo- Adenin oder Adenin und Flavinmononucleotid zu-

flavin verwendet worden, wie z. B. in Arznei- bzw. gesetzt.

Stärkungsmitteln und als Zusatzmittel in verschiede- 30 Selbst wenn die Vorläufer während der Züchtung, nen Lebensmitteln und Futtermitteln. Das Flavin- ζ. B. aus dem Nährmedium zugesetzten natürlichen adenin-dinucleotid ist wegen seiner starken bioche- Substanzen, gebildet werden, erweist es sich nichtsmischen Wirksamkeit und seiner hohen Löslichkeit destoweniger auf die Bildung von Flavin-adeninin Wasser von großem praktischen Wert. dinucleotid als von günstiger Wirkung, wenn diese Zur Herstellung der Verbindung ist bisher die Ex- 35 Vorläufer dem Kulturmedium gesondert zugesetzt traktion aus lebenden Zellen und die Synthese, aus- werden.

gehend von Riboflavin, angewendet worden. In in- Die zur Herstellung des Flavin-adenin-dinucleotids dustriellem Maßstab wurden gezüchtete Zellen von angewendete Fermentation wird unter aeroben Be-Eremothecium ashbyii, einem Reboflavin erzeugen- dingungen durchgeführt, wie z. B. in einer aeroben den Mikroorganismus, extrahiert (s. japanische Pa- 40 Schüttelkultur oder unter Rühren einer Tauchtentveröffentlichung 496/1964 und Bitamin, 26, S. 93 kultur bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40° C bis 102 [1962]). Bei der Herstellung von Eremothe- und bei einem pH-Wert von etwa 5,5 bis 9,0. Nach cium ashbyii findet man jedoch, daß das in den Zeil- 2 bis 8 Tagen Züchtung unter diesen Bedingungen körpern während des Frühstadiums der Züchtung findet man, daß sich in dem Kulturmedium große angesammelte FAD mit fortschreitender Zeit über 45 Mengen an Flavin-adenin-dinucleotid angesammelt Flavinmononucleotid (FMN) in Riboflavin umge- haben. Geringe Mengen an Flavin-adenin-dinucleotid wandelt wird. Bei diesem Verfahren ist es daher werden außerdem in den Zellkörpern selbst gefunden, schwierig, das Flavin-adenin-dinucleotid in hoher Nach Beendigung der Fermentation wird das Reinheit und Ausbeute zu erhalten. Ferner bestehen Flavin-adenin-dinucleotid aus dem Fermentationsbei diesem Verfahren weitere Schwierigkeiten hin- 50 filtrat nach üblichen Verfahren, wie durch Behandsichtlich der Extraktion des Flavin-adenin-dinucle- lung mit Ionenaustauschharzen, Extraktion mit Löotids aus den Zellkörpern und bei der Abtrennung sungsmitteln, Fällung mit Metallsalzen oder Chrovon den anderen Flavinverbindungen. matographie abgetrennt.

Gemäß dem Verfahren des älteren deutschen Pa- Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der tents 1 445 377 kann durch Züchten von Brevibac- 55 Erfindung. Falls nicht anders angegeben, beziehen terium ammoniagenes ATCC 6872 in Gegenwart von sich die Prozentangaben auf das Gewicht.
Adenin 5'-Adenylsäure hergestellt werden. Es wurde .
nun gefunden, daß bei der Züchtung von Brevibac- Beispiel 1
terium ammoniagenes ATCC 6872 und von Micro- Eine Impf kultur von Brevibacterium ammoniacoccus sodonensis ATCC 15 932 in Gegenwart von 60 genes ATCC 6872 wird hergestellt, indem in einem Adenin neben 5'-Adenylsäure auch FAD gebildet sterilisierten Kulturmedium, das 2% Glucose, 1% wird. Größere Mengen an FAD bilden sich, wenn Hefeextrakt und 0,25 % NaCl enthält, 25 Stunden die Züchtung in Gegenwart von FMN und Adenin bei 30° C gezüchtet wird.

durchgeführt wird. Diese Kulturflüssigkeit wird zum Beimpfen eines

Die Erfindung betrifft dementsprechend ein Ver- 65 Fermentationsmediums in einer Menge von 10 Vo-

fahren zur fermentativen Herstellung von Flavin- lumprozent des Fermentationsmediums verwendet,

adenin-dinucleotid durch Züchten eines Mikroorga- Es wird sodann eine aerobe Schüttelkultur bei 30° C

nismus in Gegenwart entsprechender Vorläufer, durchgeführt.