DE1642706C3 - Verfahren zur mikrowellen Herstellung von Guanosindi- und -triphosphat - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Guanosindi- und -triphosphat.

Guanosindiphosphat (GDP) und Guanosintriphosphat (GTP) spielen eine wichtige Rolle beim Stoffwechsel und als biochemische Reagentien sowie als Reagentien mit energiereichen Phosphatbindungen und sind daher für die Herstellung von Arzneimitteln von Bedeutung.

Die Herstellung von GDP und GTP erfolgte bisher durch chemische Synthese oder nach einem enzymatisehen Verfahren auf Hefebasis, bei dem man von Guanosin ausgeht. Die mit diesen bekannten Verfahren erzielbaren Ausbeuten sind jedoch verhältnismäßig gering, so daß eine großtechnische Herstellung von GDP und GTP damit nicht möglich ist. Außerdem hat das bekannte enzymatische Verfahren den Nachteil, daß eine große Menge Hefe erforderlich ist, so daß GDP und GTP aufgrund ihrer kostspieligen Herstellungsverfahren verhältnismäßig teuer sind.

Gegenstand des älteren deutschen Patents 14 45 977 ist ein großtechnisch durchführbares Verfahren, mit dessen Hilfe man auf mikrobiellem Wege durch Züchten der Stämme ATCC 6871 oder 6872 von Brevibacterium ammoniagenes in einem Nährmedium, das einerseits Pantothensäure, Pantothensäuresalz, Pantethein, jS-Alanin oder Coenzym A und andererseits Vitamin Bi oder dessen Salze bzw. diese Substanzen enthaltende Naturstoffe enthält, aus Guanin Guanosinmonophosphat in guten Ausbeuten herstellen kann.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Guanosindiphosphat und Guanosintriphosphat anzugeben, mit dessen Hilfe es möglich ist, diese beiden wichtigen Substanzen auf wirtschaftliche Weise großtechnisch herzustellen.

Es wurde nun gefunden, daß sich beim Verfahren gemäß Patent 14 45 977 in der Kulturflüssigkeit neben dem Guanosinmonophosphat auch Guanosindiphosphat und Guanosintriphosphat in beträchtlichen Mengen anreichern.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Guanosindiphosphat und -triphosphat durch Züchten der Stämme ATCC 6871 oder 6872 von Brevibacterium ammoniagenes in einem Nährmedium, das neben üblichen Nährstoffen Pantothensäure, Pantothensäuresalze. Pantethein, ^-Alanin <>5 oder Coenzym A, Vitamin Bi oder dessen Salze oder diese Substanzen enthaltenden Naturstoffe sowie Guanin oder Guanosin enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das im Kulturmedium angereicherte Guanosindiphosphat und -triphosphat von dem gleichzeitig gebildeten Guanosinmonophosphat auf an sich bekannte Weise abgetrennt wird.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, Guanosindiphosphat und Guanosintriphosphat auf verhältnismäßig einfache Weise in großtechnischem Maßstab unter Erzielung hoher Ausbeuten herzustellen.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignet sich jedes übliche Nährmedium, das eine Kohlenistoffquelle, z.B. Kohlehydrate, wie Glucose, Hydrolyseprodukte von Stärke oder Melassen, eine Stickstoffquelle, wie Harnstoff, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, anorganische Salze, wie Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Calciumchlorid und stickstoffhaltige Naturstoffe, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Caseinaminosäuren, Fischextrakt in geeigneten Mengenverhältnissen enthält. Die Zugabe von Pantothensäure, Pantothensäuresalzen, Pantethein, j3-Alanin oder Coenzym A, Vitamin B| oder dessen Salzen bzw. diese Substanzen enthaltenden Naturstoffen erfolgt zur Stabilisierung des Wachstums der Mikroorganismen und der Fermentation. Guanin oder Guanosin kann dem Nährmedium gleich zu Beginn oder während der Züchtung zugegeben werden. Besonders große Mengen an GDP und GTP werden in der Kühlflüssigkeit angereichert, wenn die Konzentration an dem Nährmedium zugegebenem anorganischem Phosphat, berechnet als PO₄, oberhalb 0,4 Gew.-% liegt. Die besten Ergebnisse werden mit PCu-Konzentration zwischen 0,4 und 1,6% erhalten. Während der Fermentation können je nach Bedarf auch Glucose und andere Nährstoffe dem Nährmedium zugegeben werden.

Guanin oder Guanosin, berechnet als Guanin, wird dem Nährmedium in einer Menge von 1 bis 10 mg Guanin pro cm³ zugegeben.

Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, z. B. in einer Schüttelkultur oder in einer Submerskultur unter Rühren und Belüften, bei einer Temperatur von 20 bis 40⁰C. Nach einer Züchtungsdauer von 36 bis 120 Stunden haben sich in der Kulturflüssigkeit GDP und GTP angereichert. Die Ausbeute an GDP und GTP kann erhöht werden, wenn der pH-Wert des Nährmediums nach der Zugabe von Guanin oder Guanosin zwischen 7,5 und 5,5 gehalten wird, beispielsweise durch Zugabe eines geeigneten Neutralisationsmittels, wie wäßriger Natronlauge.

Das in der Kulturflüssigkeit angereicherte GDP und/oder GTP wird nach Beendigung der Züchtung auf an sich bekannte Weise, beispielsweise unter Anwendung einer Ionenaustauscherharzbehandlung, durch Adsorption, Fällung oder Extraktion, abgetrennt.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Die darin angegebenen Prozentangaben beziehen sich, wenn nichts anderes angegeben ist, auf das Gewicht.

Beispiel 1

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 wurde in einem 2% Glucose, 1% Pepton, 1% Hefeextrakt, 0,3% NaCI und 30μg/l Biotin enthaltenden Impfmedium 24 Stunden lang bei 30° C gezüchtet.

Ein Nährmedium der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung wurde mit 10 Vol.-% des erhaltenen Impfmediums beimpft. Die Züchtung wurde als Schüttelkultur bei 30"C durchgeführt.

Das verwendete Nährmedium hatte die folgende Zusammensetzung:

Glucose
Harnstoff
KH₂PO₄
K₂HPO₄
MgSO₄ ■ 7H₂O

Biotin
Calciumpantothenat

100g

6g

10 g

10 g 10g 30 μg 2 mg

IO

20

Die obigen Substanzen wurden unter Auffüllen auf 1 Liter in Wasser gelöst, und! der pH-Wert des Nährmediums wurde vor der Sterilisation mit NaOH auf 8 0 eingestellt. 20-cm³ Anteile des beimpf ten N ährmed.-urns'wurden in 250-cm³-Erlenmeyferkolben gegeben und zum Züchten verwendet, nachdeni 3 g CaCO₃ je 100 cm' Medium hinzugegeben und sie 10 Minuten lang in einem Autoklav unter einem Druck von 1 kg/cm² sterilisiert worden waren.

Nach 72stündigem Züchten des auf diese Weise

beimpften Nährmediums wurde eine solche Menge

Guanin zugegeben, daß in der Kühlflüssigkeit eine

Guaninkonzentration von 2 mg/cm* erreicht wurde.

Nach weiterem 48stündigem Züchten hatten sich in der

Kulturflüssigkeit 2,0 mg/cm* GTP (berechnet als freie

Säure) gebildet. Nach Zugabe des Guanins wurde der

oH-Wert durch Zugabe von Natiiumhydroxyd zwischen

neutral und schwach sauer gehalten. Am Ende der

Züchtung betrug der pH-Wert 5;B.

Es wurden, nur 0,26 mg/cm³ GTP gebildet, wenn kein Guanin zugegeben wurde und sonst die gleichen Bedingungen herrschen. Der End-pH-Wert betrug in

dieseni FaUe;6,2,

Das durch Entfernung der Bakterienzellen aus der Kulturflüssigkeit erhaltene Filtrat wurde durch eine Säule mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz geleitet, und das GTP wurde mit verdünnter Salzsäure eluiert. Diese Fraktion wurde mit wäßriger Natriumhycjroxydlösung neutralisiert, mit Aktivkohlepulver behandelt, eingeengt und gekühlt, um das Natriumsabi von GTP zu erhalten.

Beispiel 2

Es wurde Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871 verwendet. 100 g Glucose, 6 g Harnstoff, 6 g KH₂PO₄, 6g K₂HPO₄, 6g MgSO₄- 7H₂O und 5g Hefeextrakt wurden in Wasser unter Auffüllen auf 1 Liter gelöst. Der pH-Wert wurde auf 6,0 eingestellt und die Lösung in Erlenmeyerkolben gegossen. CaC03 wurde in einer Menge von 3 g/100 cm³ Lösung zugegeben, und dann wurde in einem Autoklav unter einem Druck von

1 kg/cm² 10 Minuten sterilisiert. Das auf diese Weise erhaltene Medium wird als Nährmedium verwendet.

Nach 72stündigem Züchten wurde eine solche Menge Guanin zugegeben, daß eine Guaninkonzentration von

2 mg/cm³ erreicht wurde. Nach der Zugabe des Guanins wurde weitere 24 Stunden lang gezüchtet. Es wurden

) 0,57 mg/cm³ GTP und etwas G DP gebildet.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Guanosindi- und -triphosphat durch Züchten der Stämme ATCC 6871 oder 6872 von Brevibacterium ammoniagenes in einem Nährmedium, das neben üblichen Nährstoffen Pantothensäure, Pantothensäuresalze, Pantethein, 0-Alanin oder Coenzym A, Vitamin Bi oder dessen Salze oder diese Substanzen enthaltenden Naturstoffe sowie Guanin oder Guanosin enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das im Kulturmedium angereicherte Guanosindiphosphat und -triphosphat von dem gleichzeitig gebildeten Guanosinmonophosphat auf an sich bekannte Weise abgetrennt wird.