DE1470338A1 - Verfahren zur Herstellung von 5-Nucleotiden - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von 5-NucleotidenInfo
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Description
DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES „ , to--H™irJ^%
g.ni.V.cyorCr.fuDs [!.,' Ü,.: >
„!ek«elrifchf
KÖLN 1, DEICHMANNHAUS D^ Cum.Oi jioKeile/ Dr.-l
Köln, 22.Oktober 1968 Pu/Bt
27, Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan)
Die Herstellung von 5'-Nucleotiden unter Verwendung von
Mikroorganismen erfolge bisher nach einem der beiden folgenden Verfahren:
1) Ribonucleinsäure wird durch Einwirkung von durch Mikroorganismen
erzeugter Phosphodiesterase hydrolysiert.
2) Mikroorganismen, die während der Bebrütung 5'-Nucleotide
zu bilden und diese im Medium anzureichern vermögen, werden unter geeigneten Bedingungen zu diesem
Zweck bebrütet.
Diese bekannten Verfahren sind jedoch zwangsläufig mit Nachteilen verbunden, wenn sie industriell durchgeführt
werden. Beim erstgenannten Verfahren müssen Mikroorganismen, die Ribonucleinsäure liefern, z.B. Hefe, und
Mikroorganismen, die das Enzymsystem zur bevorzugten Hydrolyse der Ribonucleinsäure zu 5'-Nucleotiden zu bilden
vermögen, bebrütet werden. Beim zweiten Verfahren werden zwar die gewünschten 5'-Nucleotide während der Bebrütung
der Mikroorganismen angereichert, aber die Konzentration dieser 51-Nucleotide ist unvermeidlich niedrig.
Die Nachteile der bekannten Verfahren werden durch die Erfindung vermieden, deren Gegenstand ein Verfahren zur
Herstellung von 5'-Nucleotiden ist, bei dem diese unmittelbar
aus den Zellen von asporogenen Hefen gewonnen
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werden, und zwar aus der intrazellularen Ribonucleinsaure
dieser Hefen durch Einwirkung eines gleichzeitig vorhandenen Enzymsystems. Das Verfahren gemäß der Erfindung
eignet sich zur großtechnischen Herstellung von 5'-Nucleotiden,
nach denen die Nachfrage ständig wächst.
Das Verfahren gemäß der Erfindung wird, kurz gesagt, so durchgeführt, daß man ausgewachsene asporogene Hefen in
einer wäßrigen sauren Lösung suspendiert hält. Beispielsweise hält man diese Hefen etwa 1 bis 10 Stunden in einer
Pufferlösung oder in einer Salzlösung einer Konzentration von etwa 0,1 bis 0,5 Mol/l suspendiert. Der Pj^-Wert der
Suspension wird wenigstens für die ersten 10 bis J>0 Minuten
dieser Zeit im sauren Bereich von etwa 3,0 bis 6,0, zweckmäßig
von 4,5 bis 5,5, gehalten. Die Suspension kann man ruhig stehen lassen, bewegen und/oder belüften. Es ist zu
bemerken, daß mehr als 90$ der in den Zellen der asporogenen
Hefen enthaltenen Ribonucleinsäure aus den Zellen als 5'-Nucleotide ausgeschieden werden, indem die Hefen
lediglich der genannten Behandlung unterworfen werden.
Die Anmelderin stellte fest, daß fast die gesamte intrazellulare Ribonucleinsäure zu 5'-Nucleotiden abgebaut
werden kann, wenn die asporogenen Hefen unter geeigneten Bedingungen in einem sauren Medium in Suspension gehalten
werden, und daß die hierbei gebildeten 5f-Nucleotide aus
den Zellen in das Medium übertreten. Dem Verfahren gemäß der Erfindung liegen diese Peststellungen zugrunde.
Als asporogene Hefen eignen sich für· die Zwecke der Erfindung
beispielsweise die folgenden Gattungen: Brettanomyces, Candida, Cryptococcus, Kleockera, Mycoderma, Rhodotorula
und Torulopsis. Am besten geeignet hiervon sind beispielsweise die folgenden Spezies:
Brettanomyces claussenii Ousters Brettanomyces bruxellensis Kufferath et van Laer
Candida pseudotropicalis (Cast.) Basgal Candida tropicalis (Cast.) Berkhout
Candida utilis (Henneberg) Lodder et van Rij Cryptococcus laurentii (Kufferath) Skinner
Cryptococcus neoformans (Sanfelice) Buillemin
Kloeckera apiculata (Reess emend. Klöcher) Janke Kloeckera africana (Klöcker) Janke
Myooderma tannica Asai
Rhodotorula mucilaginosa (Jörg.) Harrison
Rhodoturula pallida Lodder
Torulopsis candida (Saito) Lodder Torulopis famata (Harrison) Lodder et van Rij
Die Züchtung der Mikroorganismen erfolgt in einem wäßrigen Kulturmedium. Das Kulturmedium muß im allgemeinen die Nährstoffe
für die Mikroorganismen enthalten, z.B. Stoffe, die assimilierbaren Kohlenstoff liefern, Stoffe, die digerierbaren
Stickstoff liefern, und vorzugsweise anorganische Substanzen, Vitamine, sonstige das Wachstum fördernde
Faktoren usw. Diese Nährstoffe können natürlichen Ursprungs oder synthetisch hergestellt sein. Geeignete Kohlenstoff
liefernde Stoffe sind beispielsweise Glucose, Lactose, Maltose, Glycerin, Stärke, Dextrin usw. Geeignete Stickstofflieferanten
sind beispielsweise Ammoniumsalze, Nitrate, Harnstoff usw. Stoffe, die gleichzeitig Kohlenstoff und
Stickstoff liefern, sind beispielsweise Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Maismaische, Melasse,
Kasein, Käseinhydrolya*e, Gluten, Reiskleie, verschiedene
Aminosäuren usw. Als anorganische Nährstoffe kommen beispielsweise infrage: Kaliumphosphat, Natriumchlorid,
Magnesiumsulfat, Eisen-III-chlorid, Natriumnitrat, Calciumchlorid
usw.
Die Bebrütung erfolgt gewöhnlich etwa 10 bis 72 Stunden
bei einer Temperatur von etwa 25 bis 30°C. Die optimale Bebrütungsdauer ändert sich mit Faktoren, wie Art der
asporogenen Hefen, Zusammensetzung des Mediums, Temperatur, Bewegung oder Ruhezustand des Mediums usw. Die auf
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'■ v- f i
diese Weise gezüchteten asporogenen Hefen enthalten Ribonucleinsäure
in einer Menge von etwa 4 bis 10$, bezogen
auf das Gewicht der trockenen Zellen.
Als nächste Stufe werden die erhaltenen Rohzellen der asporogenen Hefen in einem wässrigen Medium gehalten,
dessen p„-Wert auf etwa 3,0 bis etwa 6,0, vorzugsweise auf 4,5 bis 5,5, eingestellt ist. Zu diesem Zweck können
die asporogenen Hefen vom Kulturmedium abgetrennt werden oder auch darin belassen werden. Wenn sie vom Kulturmedium
abgetrennt werden, suspendiert man sie anschließend in einen wäßrigen Medium. Vorzugsweise wird eine wäßrige
Pufferlösung als wäßriges Medium verwendet. Beispielsweise kann eine essigsaure Pufferlösung oder eine bernsteinsaure
Pufferlösung mit dem gewünschten pH-Wert vorteilhaft verwendet werden. Falls erforderlich, können
organische oder anorganische Salze weiterhin in solchen Mengen Zugesetztwerden, daß die Endkonzentration an Salz
etwa 0,1 bis 0,5 Mol pro Liter beträgt. Als Salze werden für diesen Zweck vorzugsweise Natriumchlorid, Kaliumchlorid
und Ammoniumchlorid verwendet. Die Suspension wird im allgemeinen 1 bis 10 Stunden bei einer Temperatur
von etwa 20 bis 50°, vorzugsweise von 30 bis 45°C, stehen
gelassen oder geschüttelt oder gerührt.
Wenn die asporogenen Hefen dem sauren wäßrigen Medium ohne
vorherige Abtrennung vom Kulturmedium ausgesetzt werden, ist das letztere auf einen sauren p„-Wert von etwa 3,0
bis 6,0, vorzugsweise von 4,5 bis 5,5, und eine Salzkonzentration von etwa 0,1 bis 0,5 Mol/l, beispielsweise
durch Zusatz der vorstehend genannten Stoffe oder durch Verdünnen mit Wasser, einzustellen. Die weitere Behandlung
kann in der gleichen Weise wie bei der vorstehend beschriebenen Suspendierung durchgeführt werden.
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Es wurde festgestellt, daß die Einwirkungsdauer des sauren Mediums auf die Mikroorganismen nicht sehr lang sein muß,
daß jedoch eine Behandlungsdauer von wenigstens 10 bis 30 Minuten erforderlich ist. Das wäßrige Medium, in dem
die Mikroorganismen gehalten werden, wird zunächst genau auf einen gewünschten p^-Wert im sauren Bereich eingestellt
und für eine Zeit, die langer ist als die genannte Mindestzeit, beim sauren pH-Wert innerhalb eines gewünschten
Bereichs gehalten. Danach braucht keine Korrektur des Pu-Werts mehr vorgenommen zu werden, auch wenn er bis zum
neutralen Bereich ansteigt.
Es ist vorteilhaft, die asporogene Hefe vor oder während des Suspendierungsprozesses einer physikalischen oder
chemischen Behandlung zu unterwerfen, durch die eine
gewisse Beschädigung der Zellwände oder eine Erhöhung ihrer Durchlässigkeit bewirkt wird. Hierdurch kann die
für die Suspendierung erforderliche Zeit verkürzt werden. Beispielsweise kann man die asporogene Hefe vor der Suspendierung
einmal oder mehrmals gefrieren lassen· Eine Erhöhung der Wirksamkeit des Suspendierungsprozesses wird
auch erzielt, wenn man die Zellen der Hefe der Einwirkung folgender Stoffe aussetzt: Organische Lösungsmittel, wie
Äthylacetat, Toluol, Aceton usw., Antibiotika, insbesondere Antibiotika vom Polyentyp, wie Nystatin (siehe J.D.Dutcher
u. Mitarb., Antibiotics Annual (1953-1952O, S. 191), Eurocidin (siehe K. Nakazawa, "Journal of the Agricultural
Chemical Society of Japan", 2^, S. 65O), Candimycin (siehe
M.Shibata u.Mitarb., "The Journal of Antibiotics", Series B, Bd. 7, S.I68 (1954), japanisches Patent 301 24o),Amphotericin
B (siehe J. Vandeputte u.Mitarb. "Antibiotics Annual" (1955-1956), S.587), Trichomycin (siehe Hosoya u.
Mitarb. "The Jamal of Antibiotics", Series B, £, S.564
(1952) ) usw., kationaktive oberflächenaktive Mittel, wie Cetyltrimethylammoniumbromid, oder Glucanasen, hergestellt
durch einen Mikroorganismus der Gattung Trametes oder Streptomyces, z.B. Trametes sanguinea (L. ex Fr.)
Lloyd. 90 9 8 U7 1 126
Durch diese Behandlungen verschwinden 80 bis 100$ der
intrazellularen Ribonucleinsäure, und 60 bis 90$ dieser
Säure wird in 5*-Nucleotide umgewandelt, z.B. in 51-Adenylsäure,
5!-Guanylsäure, 51-Cytidylsäure und 51-Uridylsäure.
Diese Säuren treten aus den Zellen in das umgebende Medium über und reichern sich darin an. Wenn
der Mikroorganismus 5'-Adenylsäuredeamxnase bildet, kann
5'-Inosinsäure anstelle von 5'-Adenylsäure angereichert
werden.
Wenn die Aktivität der Nucleotidasen zu hoch ist, lassen sich die unerwünschten Polgen einer Dephosphorylierung
vermeiden, wenn man dem Medium einen Nueleotidase-Inhibitor,
wie Arsenate u.dgl., zusetzt.
Als 51-Nucleotide werden auf diese Weise im allgemeinen
51-Adenylsäure, 5*-Guanylsäure, 5r-Uridylsäure, 51-Cytidylsäure
usw. erhalten. Wenn Deaminase in der Lösung vorhanden ist, können 5'-Inosinsäure und/oder 5'-Xanthylsäure
erhalten werden, aber die Bildung dieser Desaminierungsprodukte kann verhindert werden, wenn die Wirksamkeit der
Desaminase vorher ausgeschaltet wird. Die 51-Nucleotide
können durch Adsorption, z.B. an Aktivkohle oder Ionenaustauschharzen, durch Fällung mit Hilfe von Salzen oder durch
Extraktion mit Lösungsmitteln aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt werden. Je nach der Art der Abtrennung des zu verwendenden
Produkts können die 5!-Nucleotide als Gemisch von zwei oder mehr Arten von 5'-Nucleotiden oder auch einr
zein aus dem Reaktionsgemisch gewonnen werden.
Bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens gemäß der Erfindung werden in den folgenden Beispielen beschrieben, in
denen die Prozentsätze der Bestandteile-der Medien als
Gew.-#/Vol. ausgedrückt sind und die übrigen Mengenangaben
sich auf das Gewicht beziehen. Die Temperaturen sind sämtlich unkorrigiert.
9098U/1126
U70338
— Ύ —
Rhodotorula pallida Lodder wird 30 Stunden bei 20° in
30 1 eines Mediums (pH 6,2) bebrütet, das folgende Zusammensetzung
hat: 5»ο $6 Glucose, o,5 % Pepton, 0,5 %
Fleischextrakt, 0,2 % Hefeextrakt, 0,o5# Magnesiumsulfat und 0,ol # Calciumchlorid. Die Zellen werden dann abgetrennt
und in 5 1 einer essigsauren Pufferlösung (0,25 Mol, Pti5*0) suspendiert. Nachdem die Suspension 5 Stunden bei
37 bewegt worden ist, werden die Zellen vom flüssigen Anteil abgetrennt. Sie werden mit Wasser gewaschen, und
das ablaufende Waschwasser wird zum flüssigen Anteil gegeben. Aus der Lösung werden die 5'-Nucleotide in üblicher Weise
abgetrennt. Erhalten werden 8,2 g 5!-Adenylsäure, 7*7 g
5'-Quanylsäure, 5,3 g S'-Cytidylsäure und 6,7 g 5'~Uridyl-*
säure.
Rhodotorula pallida Lodder wird 30 Stunden bei 28° in
3o 1 eines Mediums folgender Zusammensetzung bebrütet:
3, ο % MaJanaische, 0,5 % Harnstoff, 0,05 % Magnesiumsulfat,
o,l % Kaliummonohydrogenphosphat und 0,5 % Kaliumdihydrogen-
phosphat. Der p„-Wert wird durch Zugabe von etwa 3 1 einer
η
Pufferlösung, die 2 Mol Acetat enthält, auf 5*ο eingestellt.
Es wird noch 6 Stunden bebrütet, worauf die Zellen abgetrennt werden. Das Piltrat wird auf die gleiche Weise wie in Beispiel
1 behandelt. Erhalten werden 7*5 g 5'-Adenylsäure,
6,9 g 5'-Guanylsäure, 5,1 g 5'-Cytidylsäure und 6,1 g
Mycoderma tannica Asai wird 30 Stunden bei 2b° in 30 1 des
gleichen Mediums wie in Beispiel 1 bebrütet, worauf die Zellen abgetrennt werden. Sie werden in Io 1 Essigsäurepufferlösung
(0,25 Mol, ΡτΛ,ο) suspendiert. Nachdem die
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Suspension 4 Stunden bei 37° bewegt worden ist, werden die Zellen vom flüssigen Anteil abgetrennt, der auf die
gleiche Weise wie in den vorigen Beispielen behandelt wird. Erhalten werden 3,2 g 5!-Adenylsäure, 2,6 g 5"Guanylsäure,
2,1 g Cytidylsäure und 3,1 g 5'-Uridylsäure.
1) Zum Nachweis der Bedeutung der pH-Werts-Begrenzung sind die folgenden Versuche gemacht worden:
Rhodotorulae pallida Lodder wird in der in Beispiel 1 beschriebenen
Weise inkubiert und dabei 1 kg (Nassgewicht)
an Zellkörpern mit einem Gehalt von Io % Ribonucleinsaure
gewonnen, loo g dieser Zellkörper werden in 5oo ml der
im folgenden angegebenen Pufferlösungen suspendiert (o,25 Mol bei pH-Werten, die in der nachfolgenden Tabelle angegeben
sind. Die Suspensions wird für 5 Stunden bei 37°C stehengelassen, dann werden die Zellkörper von der Flüssigkeit abgetrennt.
Die Flüssigkeit wird in konventioneller Weise unter Verwendung von Aktivkohle, Ionenaustauschharzchromatographie
usw., zur Gewinnung der 5'-Nucleotide weiterverarbeitet.
Pjj-Wert | Puffer system |
5'-AMP (g) |
5'-GMP (g) |
5'-UMP (g) |
5'-CMP (g) |
l,o | HCl-KCl | o,o5o | o,o4o | o,o3 | o,o3 |
2,o | HCl-KCl | o,o7o | o,o6o | o,o45 | o,o3o |
3, ο | Essigsäure- Natriumacetat |
o, 65 | o, 5« | o,5o | o,47 |
4,o | tt | o,82 | o, 73 | o, 61 | 0,60 |
5,o | ti | o, 85 | o, 75 | o, 62 | o,6l |
6, ο | Il | o,8o | o,72 | o,6o | o,59 |
7, ο | HCl-Trisamlno- methan |
o,2o | o, 17 | o, 14 | o,13 |
8,o | Il | o,15 | o, 11 | o,o9 | 0,09 ' |
5'-AMP: | Adenosin 5'-mono- phosphat |
||||
5f-GMP: | Guanosin 5'-mono- phosphat |
||||
5'-UMP: | Uridin 5'-mono- phosphat |
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-Wert
Puffersystem
U7033B
5'-AMP 5'-GMP 5'-UMP 5'-CMP
(g) (g) (g) (g)
5'-CMP: Cytidin 5'-monophosphat
2) Zum Nachweis der Bedeutung der spezifischen Salzkonzentration werden den Versuchen zu Ziffer 1 entsprechende Versuche
durchgeführt, hier wird jetzt jedoch konstant bei einem Prj-Wert von 5, ο in einer Essigsäure-Pufferlösung gearbeitet,
während die Salzkonzentration variiert wird. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind aus der folgenden Tabelle ersichtlich:
SaIzkonzentrat ion | 5'-AMP | 5 -GMP | 5l-UMP | 5'-CMP |
in Mol | (g) | (g) | (g) | (g) |
0 | o,o7 | o,o5 | o,o4 | o,o4 |
o,o5 | o, 15 | o,13 | o,ll | o,lo |
o,l | o,7o | 0,63 | o,54 | o,52 |
o,2 | o, 85 | o,75 | o,62 | o,6l |
o,3 | o, 84 | o,73 | o,62 | o,6l |
o,4 | o,8l | o,71 | 0,60 | 0,60 |
o,5 | o,78 | 0,70 | o,61 | 0,60 |
o,6 | o, 21 | o,15 | o,ll | o,lo |
o,7 | o, 15 | o,lo | 0,07 | 0,06 |
l,o | o, 12 | o,lo | 0,08 | 0,07 |
3) Zum N xhweis der Bedeutung der spezifischen Behandlungstemperatur werden Versuche gemäss Ziffer 1 durchgeführt, bei
denen im Essigsäure-Puffer (0,25 Mol, pH 5,0) gearbeitet wird. Bei den miteinander zu vergleichenden Versuchen wird jetzt die
Temperatur variiert. Das Ergebnis dieser Versuche Ist in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst:
909814/1126
- Io -
Temperatur | 5'-AMP | 5'-GMP | 5f-UMP | 5f-CMP |
0C | " Cs) | (g) | (g) | -(K) |
Io | o,o6 | o,o4 | 0,03 | o, 03 |
15 | o,o8 | 0,07 | o,o4 | o,o4 |
2o | o,59 | o,5o | o,4l | 0, 41 |
25 | o,72 | 0,62 | o,54 | o,53 |
Ί>ο | o,82 | o,71 | o, 60 | 0,60 |
JJ | 0,85 | o,75 | o,62 | o, 61 |
45 | 0,83 | o,72 | o,6l | o,6l |
5o | 0,75 | 0,67 | o,58 | o,57 |
55 | 0,15 | o,12 | 0, Io | o,lo |
6o | 0,09 | 0,07 | o,o5 | 0,05 |
9098U/1 126
Claims (2)
- Patentansprüche( 1.) ) Verfahren zur Herstellung von 5f-Nucleotiden durch enzymatische Spaltung von Hefe-Ribonucleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man asporogene Zuchthefen bei Temperaturen von 20 bis 500C in einem wässrigen Medium mit einem Salzgehalt von 0,1 bis 0,5 Mol/Liter suspendiert, den p„-Wert des wässrigen Mediums im Anfang der Hefebehandlung mindestens 10 bis 30 Minuten lang zwischen 3»0 und 6,0 - vorzugsweise 4,5 bis 5*5 hält, und die gebildeten 5!-Nucleotide aus dem wäßrigen Medium gewinnt.
- 2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Hefeausgangsmaterial vor der Behandlung einer an sich bekannten physikalischen oder chemischen Behandlung zur Beschädigung der Zellwände oder Erhöhung ihrer Durchlässigkeit unterwirft.3·) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Hefe der Gattung Rhodotorula, Mycoderma, Rhodotorula pallida Lodder oder Mycoderma tannica Asai verwendet wird.Neue Unterlagen (Art. 711 Abs. 2 fir.1 Satz 3 des Änderungsges. v. 4. %OBiQtNAL IN$PECT89
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