DE1445169A1 - Verfahren zur Herstellung von 5'-Nucleotide - Google Patents

Description

PATENTANWÄLTE

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHÖNWALD 1445169 DR.-1 NG. TH. MEYER DR. FUES ___

KÖLN 1, DEICHMANNHAUS Ir.*«ftST*·.SMm*

f. Wöpsd»

27. August 1968 lu/loz

Takeda Chemical Industries, Ltd,

27» Doahomaohi 2-ohome, Higashi-ku, Osaka (Japan)

Verfahren zur Herstellung von 5'»Nucleotide

Sie Herstellung von 5'-Nuoleotidenunter Verwendung von Mikroorganismen erfolgte "bisher nach einem der "beiden folgenden Verfahrent

1) Hydrolyse von Blbonucl einsäur β duroh Einwirkung von Phosphordlβsterase, die duroh Mikroorganismen gebildet wird·

2) Bebrütung von Mikroorganismen, die 5'-Nucleotide bu erzeugen vermögen, unter geeigneten Bedingungen und Anreioherung der 5-Nuoleotid· Im Medium·

Bei der Durchführung im großtechnischen Maflstab sind diese bekannten Verfahren jβdooh ewangsläufig mit Haohteiltn behaftet· Beim erstgenannten Verfahren müssen Mikroorganismen., die als Auegangsmaterial der Ribonuoleinsäure dienen« s. B* Hefe, und Mikroorganismen, die das Inzymeystern für die Hydrolyse der Bilxmualeineäure su 5'-nucleotiden su bilden vermögen, bebrütet werden. Beim iweiten Verfahren müssen die gewUnsohten 5'-Nucleotide während der Bebrütung der Mikroorganismen angereichert werden. Sie Koneentration der angereicherten 5'-Nuoleotide ist daher zwangsläufig niedrig·

Die genannten Vaohteile werden duroh dme Verfahren geaäB der Erfindung behoben, das ei oft jsur großteohniaohen Anwendung

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eignet und es ermöglicht, 5'-Nucleotide unmittelbar aus den Zellen oder dem Mycel von Mikroorganismen zu gewinnen, und zwar aus der im Zellkern der Mikroorganismen vorhandenen Ribonucleinsäure durch Einwirkung eines gleichzeitig vorhandenen Enzymsystems.

Das Verfahren gemäß der Erfindung besteht darin, daß genügend weit ausgebildete Mikroorganismen in einer wässrigen alkalischen Lösung in Suspension gehalten.werden. Beispiels-

weise werden geeignete Mikroorganismen in einer Pufferlösung oder in efoerO,1- bis 0,3-molaren Salzlösung suspendiert. Die Suspension wird etwa 1 bis 10 Stunden bei einem alkalischen pH-Wert von etwa 7*5 bis 12, zweckmäßig von 8 bis 11, gehalten. Während dieser Zeit wird die Suspension ruhig stehengelassen oder bewegt und/oder belüftet. Es ist zu beachten, daß durch die beschriebene Behandlung mehr als 90 % der im Zellkern der Mikroorganismen vorhandenen Ribonuc leinsäure in Form von 5'-Nucleotiden aus den Zellen bzw. dem Mycel ausgeschieden werden. Aus Tabelle 1 ist ferner ersichtlich, daß dieses überraschende Ergebnis keineswegs auf den Fall beschränkt 1st« In dem die in den Zellen der Mikroorganismen vorhandene Rlbonucleinsäure durch gleichzeitig mit der Ribonuoielneäure In den Zellen vorhandene Phosphordiesterase hydrolysiert wird, denn im Falle von Mikroorganismen , die offensiohtlleh Phosphordiesterase bilden, die Ribonucleln-•Äure BU 3'-Nucleotiden hydrolysiert* und in den Fällen, in . denen die Mikroorganismen Phosphordiesterase enthalten, die Muo leinsäure zu 5'-Nucleotiden hydrolysiert, wird der größte T*il der in den Zillen der Mikroorganismen enthaltenen NucleineXura in S'-Nucleotide umgewandelt· Zwar 1st der genaue Meohaniiüue dieser Erscheinung noch nicht geklärt, jedoch wird «ngenoamsn, <fcfl die in den Zellen vorhandene RibonucleinsKure nicht nur durch die Binwirkung der Phosphordiesterase hydrolysiert, sondern auoh durch Rückreaktion mit Polynucleotidphosphorylase und anschließende D©phosphorylierung zu 5'-Nucleotiden abgebaut wird, und daß die innerhalb der Zellen gebildeten 5'-Nucleotide dureh die Zellwände in das Medium ausgeschieden werden. Di€S© Annahme wird dadurch gestützt, daß

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in diesem Prozeß ein günstiges Ergebnis erzielt wird, wenn während der Bebrütung der Mikroorganismen eine größere Menge an anorganischen Phosphaten als üblich zugesetzt wird, und daß die im Zellkern vorhandene Desoxyribonucleinsäure kaum abgebaut wird und während dee Prozesses in den Zellen bzw. im Myoel usw. bleibt«

Mikroorganismen

Tabelle

Bildung von Enzymen, die Ribonuoleinsäure hydrolysieren

Phosphordi*»· esterase, die Ribonucleinsäure zu 5'-Nucleotiden hydrolysiert

Phosphordiester ase, die Ribonucleinsäure zu 3'-Nucleotiden hydrolysiert

inner- außerhalb halb der der Zellen Zellen

inner- außerhalb halb
der der
Zellen Zellen

Ausbeute an 5'-Nucleotiden aus in den Zellen vorhandener Ribonucleinsäure beim Verfahren gemäß der Erfindung

Baoillus pumilus

Pseudomonas

graveolens + -

Rhodotorula ~

glutinis + -

Streptomyoes

aureus + +

Penioillium

oorymbiferum - -

92 90 86 70 45

+ Der Mikroorganismus bildet das Enzym. - Der Mikroorganismus bildet das Enzym nicht.

Es wurde festgestellt, daß fast die gesamte in den Zellen vorhandene Ribonuoleinsäure zu 5'-Nucleotiden abgebaut werden kann, wenn die Mikroorganismen unter geeigneten Bedingungen in einem alkalischen Medium in Suspension gehalten werden, und daß die auf diese Weise gebildeten 5'-Nucleotide aus den Zellen oder dem Myoel in das Medium übertreten·

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Als Mikroorganismen eignen sich für die Zwecke der Erfindung Bakterien, Hefen, Fungi imperfecti, Schimmelpilze, Aktinomyceten usw. Die nachstehend aufgeführten Mikroorganismen sind lediglich als Beispiele anzusehen und stellen nur einen Teil der Mikroorganismen dar, die sich für das Verfahren gemäß der Erfindung eignen.

Bakterien«

Acetofaacter suboxydans Kluyver et de Leeuw Achromotacter liquidum (]?r. et Pr.) Bergey et al Aerobaeter aerogenes (Kruse) Beijerinck Agrobacterium tumefaciens (Smith et Townsend) Conn Bacillus "brevis Migula emend„ ford Bacillus cereus Prankland et Prankland Bacillus megatherium de Bary

Bacterium myccides (Grotenfeld) Migula Srwinia carotovora (Jones) Holland Bsoherichia coli (Migula) Oastellani et Chalmers Microco ecus subflavus Ilügge

Mycobacterium avium Chester

Proteus vulgaris Hauser

Pseudomonas aeruginosa (Schroeter) Migula Pseudomonas fragi (Eichholze) Huss emend. Hussong et al» Pseudomonas graveolens levine et Anderson Saroina lutea Schroeter

Serratia marcescens Bizio

Streptococcus liquefaciens Sternberg emend. Orla-Jensen ¥ii>rio percolans Mudd et Warren Xanthomonas malvacearum (Erw« Smith) Dowsön, etc.

He fen ι

Candida ro "bust a Did dens et Lodder Cryptocoοcue neoformans (Sanfelice) Yuillemin .

DeTaaryomyces globosus Klöcker

Endomyces magnusii Ludwig

Hansenula anomala (Hansen) H₀ et P₀ Sydow Haneeniaspora Talbyensis Klöcker

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Kloeokera apioulata (Reess emend. Klöoker) Janice Myooderma mandshurica S ait ο Pi chi a membranaefaoiens Hansen Bhodotarula flava (Salto) Lodfler Hhodotorula glutinis (Pres.) Harrison Ehodotorula pallida Loader Saooharomyoes oerevisiae var. ellipsoideus (Hansen)Eekker Saooharomyoes exLguus Hansen Saooharomycea mi so cP Mogi Saooharomyoes misooP-var. 2 Mogi Saooharomyoes rouxii Bouirroux Sohizosaooharomyoes pomlDe Lindner Sohwanniomyoes acoldentalia Klöcker SporoTx)lomyoes pararoseus Olson et Hammer Torulopsis oolliculosa (Hartmann) Sacoardo Zygopichia miso Mogi Zygosaooharomyoes naniwaensis (Äani II

Fungi imperfeotit

luearium roeeum Link Aorooylindrium sp. (Kurata) Gliomaetix oonvoluta (Harz) Mason var. felina (Marchal) Mason

HeImlnthosposlum algmoideum var₀ irreguläre Cralley et Iullie

Schimmelpilze t

AspergilluB queroinus (Bainier) Thorn et Ohuroh Botryo&phaeria riMe ohromogena Q, et Bo Glomerella oingulata (Stonem.) Spauld. et v. Sohr. Sordaria fimioola (Ha"b.) Ce sari et de No tar is

Akt inomyoe tent

Streptomyoea aureue (Waksman et Curtis) Wäkaman et Henrioi Streptomyoee flaveolue (Wakeman) Wakeman et Henrioi Streptomyoea oliraoeue (Wakeman) Waksman et Henrioi

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Sie Züchtung der Mikroorganismen erfolgt in einem wässrigen Kulturmedium· Das Kulturmedium muß im allgemeinen die Nährstoffe für die Mikroorganismen enthalten, wie Stoffe, die assimilierbaren Kohlenstoff enthalten, Stoffe, die digerierbaren Stickstoff enthalten, vorzugsweise anorganische Substanzen, Titamine, Spurenelemente, sonstige waohstumsfordernde Stoffe usw. Diese Nährstoffe können aus natürlichen Quellen stammen oder synthetisch hergestellt sein. Hs kohlenstoffhaltige Stoffe eignen sich "beispielsweise Glukose, Lactose, Maltose, Glycerin, Stärke, Dextrin usw„ Geeignete stickstoffhaltige Stoffe sind "beispielsweise Ammoniumsalze, Nitrate, Harnstoffe usw. Nährstoffe, die gleichzeitig Kohlenstoff und Stickstoff liefern, sind "beispielsweise Pepton, !fleischextrakt, Hefeextrakt, So j ahohnenmehl, Maismaische, Melasse, Gasein, Caseinhydrolysate, Gluten, Reiskleie, verschiedene Aminosäuren uswo Geeignete anorganische Fährstoffe sind "beispielsweise Kaliumphosphat, Natriumchlorid, Magnesiumsulfat, Eerrichlorid, Natriumnitrat, Calciumchlorid usw« Von den anorganischen Nährstoffen eignen sich die Phosphate - vorzugsweise in Form von wasserlöslichen Salzen mit Ammonium, Natrium oder Kalium - "besonders gut für die Züchtung, da sie die Ausbeute an 5'-Nucleotiden erhöhen, wie "bereits erwähnt, und gleichzeitig als Nährstoffe sehr wirksam sind.

Die Bebrütung wird gewöhnlich etwa 10 "bis 72 Stunden "bei einer Temperatur von etwa 25 "bis 30° durchgeführt. Die optimale Bebrütungszeit ist verschieden je nach der Art des Mikroorganismus, der Zusammensetzung des Mediums, der (Temperatur, dem Bewegungsgrad des Mediums usw. Nachdem die Mikroorganismen für genügend lange Zeit gezüchtet worden sind, enthalten sie Hi"bonuoleinsäure in einer Menge von etwa 4 "bis 18 $, bezogen auf das Gewicht ihres getrockneten Körpers.

' Xn der nächsten Stufe werden die erhaltenen rohen Zellen "bzw. das rohe Myoel der Mikroorganismen "bei einem pH-Wert von etw& 7,5 "bis 12, vorzugsweise von 8 "bis 11 gehalten» Zu diesem Zweok können die Mikroorganismen gegebenenfalls vom Kulturmedium abgetrennt werden. Im Falle der Abtrennung

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vom Kulturmedium werden sie anschließend in einem wässrigen' Medium suspendiert» Bevorzugt werden wässrige Medien, die hergestellt werden, indem geeignete Mengen löslicher Stoffe, wie Glycin, Triaminomethan, Natriumchlorid, Ammoniumchlorid, Kaliumchlorid, Borax, Natriumphosphate, Kaliumphosphate, Ammoniumsulfate, Natriumacetat, Natriumeitrat o. dgl·, in Wasser gelöst werden, für den gleichen Zweck lässt sich vortieilhaft eine bekannte Pufferlösung, z. B. eine Tris-(hydroxymethyl)-andnomethan-Pufferlösung (nachstehend kurz als "Tris-Pufferlösung" "bezeichnet) verwenden. Die Suspension wird gewöhnlich "bei einer Temperatur von etwa 30 45° ruhig stehengelassen oder geschüttelt oder gerührt· In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, die Mikroorganismen vor der Suspendierung einer physikalischen Behandlung, beispielsweise einer Gefrierbehandlung, zu unterwerfen, um die Zellwände in gewissem Grade zu beschädigen und dadurch die für den Suspendierungeprοzeß erforderliche Zeit zu verkürzen·

Wenn die Mikroorganismen dem alkalischen pH-Bereich ausgesetzt werden, ohne daß man sie vom Kulturmedium abtrennt, muß das letztere beispielsweise durch Zusatz der vorstehend aufgeführten löslichen Stoffe auf den erforderlichen pH-Wert von etwa 7»5 bis 12, vorzugsweise von 8 bis 11, eingestellt werden· Sie weitere Behandlung kann in ähnlicher Weise, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt werden.

Eine Verkürzung der für die Anreicherung der 5'-Nucleotide im Medium erforderlichen Zeit kann erreicht werden, wenn die genügend gewachsenen Mikroorganismen vor der Suspendierung oder während der Zeit, in der sie in Suspension gehalten werden., mit einer Verbindung, wie Phenol, Cresol, Natriumdesoxyoholat usw. behandelt werden, wodurch die Zellwände beschädigt werden.

Bemerkenswert ist ferner, daß durch Zusatz einer chemischen Agens, das mehrbasisohe Anionen liefert, z. B* eines Phosphats, Pyrophosphats, Polyphosphate, Arsenate, Citrate usw., zum Medium, in dem die Mikroorganismen in Suspension gehalten

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v/erden, häufig eine erhöhte Ausbeute an 5 '-Nucleotiden erzielt wird.

Durch die "besehriebenen Behandlungen verschwinden 80 "bis 100 io der intrazellularen Ribonueleinsäure und werden 60 "bis 90 # dieser Ribonuoleinsäure in 5'-Nucleotide, wie 5'-Adenylsaure, 5'-Guanylsäure, 5'-Cytidylsäure und 5'-Uridylsäure, umgewandelt, die aus dem Mycel "bzw. den Zellen in das umgehende Medium übertreten und darin angereichert werden. Bei Verwendung von Mikroorganismen, die 5'-Adenylsäuredeaminase erzeugen, kann 5 '-Inosinsäure anstelle von "5'-Adenylsäure angereichert werden.

Wenn die Aktivität der Nucleotidasen zu hoch ist, lassen sich die unerwünschten Ergebnisse der Dephosphorylierung vermeiden, indem man einen Nucleotidase-Inhibitor, wie Arsenate o_e dgl., dem Medium zugibt „_

In den folgenden Beispielen werden einige "bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens gemäß der Erfindung "beschrieben« Hierbei sind die Bestandteile der Medien in Gew.-$ , "bezogen auf Volumen, angegeben» Alle anderen Mengenangaben beziehen sich auf das Gewicht. Die Temperaturen sind un=» korrigiert. Die Zahlen hinter den Bezeichnungen der Mikroorganismen bedeuten die Eingangßnummern des jeweiligen Stamms beim Northern Utilization Research Branch of U. S. Department of Agriculture, Peoria, III*, U₉S»A, (NRRI) oder bei der American Type Culture Collection, Washington, D.C„_S UoS.A. (ATCC) ο

Beispiel 1

Bacillus sp* Imada (ATCC-14552) wurde 24 Stunden bei 30° in einem Tank bebrütet₉ der 20 1 eines wässrigen Mediums enthielt, das 5,0 $ Maismaische, 4»0 fi Natriumacetat, 0,7 $ Dikaliumhydrogenphosphat, 0,2 ^ Kaliumdihydrogenphosphat und 0,05 $> Magnesiumsulfat enthielt. Nach der Bebrütung wurden die Zellen abgetrennte Sie wogen 800 g und enthielten 15 $> Ribonucleinsäure, bezogen auf das Trockengewicht der

97ft ' ORJGiB^AL ί~ι·««ί·&·^

Zellen, Das Gewicht der trockenen Rohzellen "betrug 156 g. Sie rohen Zellen wurden 30 Minuten "bei 0° stehengelassen und dann in 10 1 einer 0,25-molaren Glyoin-Natriumhydroxyd-Pufferlösung suspendiert, die auf einen pH-Wert von 9,4 „ eingestellt war.. Die Suspension wurde 2 Stunden "bei 37° stehengelassen und filtriert. Die hierbei abgetrennten Zellen wurden mit Wasser gewaschen. Das Waschwasser wurde mit dem Filtrat vereinigt. Die erhaltene Lösung wurde mit Salzsäure auf pH 2,0 eingestellt und durch eine mit ,Aktivkohle gefüllte Kolonne gegeben, wobei die Nucleotide an der Aktivkohle adsorbiert wurden. Die Nucleotide wurden mit Äthanol, das mit Ammoniak alkalisch gemacht worden war, von der Aktivkohle eiuiert. Bei der Reinigung der in der ablaufenden !flüssigkeit enthaltenen Nucleotide mit Anionenaustausohharzen wurden 6,5 g 5^f-Adenylsäure, 6,2 g 5'-G-uanylsäure, 5,2 g 5 '-Gyt idyl säure und 4,6 g Uridylsäure erhalten·

Wenn "beim vorstehend beschriebenen Verfahren der SuspendierungBprozeß in Kulturmedium vorgenommen wird, dem Dinatriumhydrogenphosphat in einer Menge von 25 Millimol zugesetzt wird, wird die gleiche Ausbeute innerhalb von 40 Minuten nach Beginn des Versuohs erhalten.

Beispiel 2

Pseudomonas graveolens (Levine und Anderson (NRRL, B-14) wurde 18 Stunden bei 30° in einem in einem Tank enthaltenen wässrigen Medium bebrütet, das 3,0 # Maismaisohe, 0,5 1» Harnstoff, 5,0 i> Glukose, 0,7 $> Dinat riumhydro genpho sphat, 0,2 $> Kaliumdihydrogenphosphat und 0,05 # Magnesiumsulfat enthielt. Haoh der Bebrütung wurden die erhaltenen Zellen abgetrennt. Sie wogen 1,8 kg und enthielten 12 $> Ribonuoleinsäure, bezogen auf das Trookengewicht der Zellen. Das Gewioht der Bohzellen betrug 370 g auf trookener Basis. Die rohen Zellen wurden in 25 1 einer 0,2-molaren Natriumohioridlösung suspendiert. Die Suspension wurde 3 Stunden bei einem mit

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ITatriumhydroxyd auf 9,4 eingestellten pH-Wert gerührt und dann filtriert. Die Zellen wurden mit Wasser gewaschen· Das Wasohwasser wurde mit dem Piltrat vereinigt. Aus der Lösung wurden 12 g S^-Adenylsäure, 9 g 5'-Guanylsäure, 7 g 5'-Cytidylsäure und 6,5 g 5'-üridylsäure erhalten.

Beispiel 3

Sohizosaccharomyoes pombe lindner (ATCC-14548J wurde 18 Stunden "bei 30° in 10 1 eines wässrigen Mediums unter Schütteln .-'be'brütet. Las Medium enthielt 10,0 # Melasse, 3,0 $> Maismaisohe, 0,5 $> Harnstoff, 0,1 9& Dikaliumhydrogenphosphat, 0,6 # Kaliumdihydrogenphosphat und 0,05 # Magnesiumsulfat. Fach der Be"brütung wurden die gebildeten Zellen abgetrennt» Sie wogen 640 g und enthielten 11,5 $> Bxbonueleinsäure, "bezogen auf das Trockengewicht der Zellen. Die rohen Zellen wogen trocken 180 g. Sie wurden ü"ber Facht "bei -25° im gefrorenen Zustand gehalten, aufgetaut und in 7 1 einer 0,25-molaren Tris-Pufferlösung, die auf pH 9»0 eingestellt war, suspendiert. Die Suspension wurde 5 Stunden "bei 37° gerührt. Anschließend wurden die Zellen a"bfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das Waeohwasser wurde mit dem trat vereinigt..Aus der erhaltenen Lösung wurden 3,2 g 5¹-Adenylsäure, 3,1 g 5'-Guanylsäurβ, 2,4 g 5'-0ytidylsäure und 2,5 g 5'-TJridylsäure gewonnen.

Wenn im vorstehend "besehrie"benen Versuch die rohen Zellen ohne Gefrierbehandlung unmitterbar in der Pufferlösung suspendiert wurden, war die Ausbeute an 5'-Nucleotiden geringer? und zwar wurden 2,4 g 5'-Adenylsäure, 2,1 g 5'-Guanylsäure, 1,8 g 5'-Gytidylsäure und 1,9 g 5'.-Ur idyl säure erhalten.

■Beispiel 4

Saooharomyoes misotTvar. 2 Mogi (ATÖC-14549) wurde 16 Stunden "bei 28° in 3yT eines in einem Tank enthaltenen Mediums "bebrütet, das 5,0 $> Glukose, 0,5 # !fleischextrakt, 0,2 36 Hefeextrakt und 0,05 $> Magnesiumsulfat enthielt» Nach der Be-

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brütung wurden die erhaltenen Zellen abgetrennt. Sie wogen 2,3 kg und enthielten 10,5 i> Ribonuoleinsäure, bezogen auf das Trookengewioht der Zellen. Das Trockengewicht der Rohzellen betrug 450 g. Die rohen Zellen wurden in 15 1 einer 0,25-molaren Glyoin-Katriumhydroxyd-Pufferlösung suspendiert, die auf pH 10,5 eingestellt war. Die Suspension wurde 6 Stunden bei 37° gerührt. Anschließend wurden die Zellen von der Suspension abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Die Waschflüssigkeit wurde mit dem filtrat vereinigt. Aus der erhaltenen Lösung wurden 8,4 g 5'-Adenylsäure, 5»1 g 5'-Gruanylsäure, 4,2 g 5^f-Cytidylsäure und 4,8 g 5'-Uridylsäure gewonnen.

Beispiel 5

Saccharomyoes rouxii Boutroux (ATOO-14550) wurde 18 Stunden bei 28° in 5 1 eines wässrigen Mediums, das 10,0 $> Melasse, 3,0 i» Maismaische, 0,5 i» Harnstoff, 0,1 $ Dikaliumhydrogenphosphat, 0,6Ji Kaliumdihydrogenphosphat und 0,05 $> Magnesiumsulfat enthielt, unter Schütteln bebrütet. Nach der Bebrütung wurden die erhaltenen Zellen abgetrennt. Sie wogen 380 g und enthielten 12,0 f> Eibonuoleinsäure, bezogen auf das Trockengewicht der Zellen. Das Gewicht der Roh/zeilen betrug 75 g auf Trookenbasis. Die Rohzellen wurden in 2 1 einer 0,25-molaren Tria-Pufferlösung suspendiert, die auf pH 9,0 eingestellt war. Die Suspension wurde 4 Stunden bei 37° bewegt. Anschließend wurden die Zellen abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Die Waschflüssigkeit wurde mit dem Filtrat vereinigt· Aus der erhaltenen Lösung wurden 1,5 g 5^f-Adenyläsure, 1,1 g 5·-Guanylsäure, 0,95 g 5'-öytidylsäure und 1,1 g 5'-Uridylsäure gewonnen.

Beispiel 6

Ehodotorula fleva Lodder (ATÖO-14551) wurde 20 Stunden bei 28° in 30 1 eines in einem Tank enthaltenen wässrigen Mediums bebrütet, das 5,0 i» Glukose, 0,5 + Pepton, 0,5 & Fleisoh-

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extrakt, 0,2 # Hefeexbrakt, 0,05 # Magnesiumsulfat, 0,2 # Kaliumnitrat Wnd 0,01. # öalciumohlorid enthielt. Uach .der Bebrütung wurde das gebildete Mycel abgetrennt. Bs wog 2050 g entsprechend 410 g getrocknetem Mycel. Das rohe Mycel wurde in 10 1 einer 0,25-molaren Tris-Pufferlösung suspendiert, deren pH-Wert 7, 5 "betrug. Die Suspension wurde 6 Stunden "bei 37° bewegt und filtriert, um das Mycel abzutrennen. Das Mycel wurde mit Wasser gewaschen. Die Waschflüssigkeit wurde mit dem Filtrat zusammengegeben. Aus der erhaltenen lösung .wurden 7,1 g 5'-Adenylsäure, 5,2 g 5·-G-uanylsäure, 4,0 g , 5'-Cytidylsäure und 4,3 g 5'-Uridylsäure gewonnen»

Beispiel 7

Pseudomona.s graveolens (Levine und Anderson UHEL, B-14) wurde 28 Stunden bei 28 in 30 1 eines wässrigen Mediums unter Belüftung und Bewegung bebrütet_β Das Medium enthielt 1,0 i» Slukose, 0,7 & Dikaliumhydrogenphosphat, 0,2 $ Kaliumdiehydrogenphosphat, 0,42 $ Hefeextrakt, 0,02 $ Magnesiumsulfat und Qj, 1 $> Ammoniumsulfate lach der Bebrütung wurden die gebildeten Zellen mit einer Sharpies-Zentrifuge abgetrennt, wobei 750 g nasse Zellen erhalten wurden. Dies entspricht @in©m frockengewicht von 140 g_o.Der Sehalt an Eibonueleinsäure in den Zellen betrug etwa 14g. Die nassen Zellen wurden in 10 1 einer wässrigen Lösung suspendiert₉ die auf pH 7»ö ©ingestellt war und o,5 $ Maismaische, 0,4 ^S* Dikaliumkydrogenphosphat, 0,1 ^ Kaliuaäihydrogenphosplaat, 0,5 ^ Q-lyeerin, 1,0 # Natriuiiaoetatj 0,2 ^ Hefeextrakt, 0,01^ Magnesiumsulfat und 0,2 φ Aimnoniüiasulfat enthielt. Me Suspeasioa wurde bei 30° belüftet unä bewegt. Haoh 4 Stuaden war ä®j? Gehalt an libonmcloinsäure in den Zellen auf 18 g uaä der pH-Wert der Suspension auf 7_?S gestiegen. In dieser Stufe Jb.att@n die kurzen Bazillen, die sich während der Yor-■bebrütuag gebildet hatten., ein auBe^ordentliohes Längenwachstum erfahrene Bei weiterer Bewegung stieg der pH-Wert des Medium® weiter, während der behalt an Sibonuoleinsäure in den Zellen- su fallen begann und die Anreicherung von 5¹—

iHAL !W3PEGTED

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Nucleotiden im Medium einsetzte· Naoh 16 Stunden war der pH-Wert des Mediums auf 9,2 gestiegen und der Gehalt an Bibonuoleinsäure in den Zellen auf etwa 9 g gefallen, während sich 5'-Nucleotide im Medium entsprechend angereichert hatten· Sine enzymatische Messung unter Verwendung von 5'-Nucleotidase ergab an diesem Punkt etwa 11 g 5'-Nucleotide· Bach "48 Stunden betrug der pH-Wert des Mediums 9_t4} der Gehalt an Ribonuoleinsäure in den Zellen war auf etwa 1 g gefallen, während sich 21 g 5'-Nucleotide im Medium angesammelt hatten. Naoh 50 Stunden wurde die Suspension filtriert, wobei 28 1 Eiltrat erhalten ,wurden, aus denen etwa 19 g eines Gemisohes von 5'-Nucleotiden erhalten wurden»

Beispiel 8

Bacillus sp. Imada (ATOO-14552) wurde bei 28° in 1 1 eines wässrigen Mediums bebrütet, das einen pH-Wert von 7>0 hatte und 1,0 Ji Glycerin, 1,0 $> Oaseinhydrolysat, 0,7 1* Dikaliumhydrogenphosphat, 0,2 ^ Kaliumdihydrogenphosphat, 0,02 j( Magnesiumsulfat, 0,1 f> Ammoniumsulfat, 1,0 j> einer Lösung eines Gemisohes von Vitaminen der Gruppe B und 0,05 ^ des Vatriumsalzes von Bibonuoleinsäure enthielt. (1 Liter der Lösung des Vitamingemisohes enthielt 20 mg Vitamin B^, 20 mg Vitamin Bp, 40 mg Nikotinsäure, 40 mg Oaloiumpantothenat, 1 mg Biotin, 1 mg 3?olinsäure, 1 mg p-Aminosalicylsäure, 20 mg Vitamin Bg und 20 mg Inosit·) Bas geimpfte Medium wurde gesohüttelt. Naoh 36 Stunden war der pH-Wert des Mediums auf 7,6 und naoh 72 Stunden auf 7,8 - 8,5 gestiegen· Das Medium wurde filtriert, wobei 0,9 1 Piltrat erhalten wurden, aus dem 280 mg 5'-Adenyleäure, 275 mg 5'-Guanylsäure, 211 mg 5'-Qytidylsäure und 235 mg 5'-TJr idyl säur β gewonnen wurden·

Wenn im vorstehend beschriebenen Vereuoh das N*.triumsala Ton Bibonuoleinsäure weggelassen wurde, verringerte eioh die Ausbeute an 5'-Nuoleotiden auf folgende Mengen ι 120 mg 5'-Adenyleäure, 121 mg 5'-Guanylsäure, 92 mg 5' säure und 90 mg 5'-Uridylsäure.

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Beispiel 9

Pseudomonae graveolens (Levine und Anderson HHRL, B-14) und Baoillus sp. Imada (ATfcC-14552) wurden getrennt 24 Stunden !sei 28° in einem wässrigen Medium "beträtet, das einen pH-Wert von 7,0 hatte und 1,0 # Glukose, 1,0 $> Polypepton, 0,4 i> Dikaliumhydrogenpho sphat, 0,1 ?£ Kaliumdihydrogenphpaphat, 0,3 5^ Hefeextrakt, 0,01 # Magnesiumsulfat und 0,1.i» Ammoniumsulfat enthielt* Von "beiden Kulturen wurden je 100 cm-'^Jale Saatkultur zu 30 1 eines wässrigen Mediumgigege"ben, das 2,0 ^ Dikaliumhydro genpho sphat, 0,05 $> Kaliumdihydrogenphosphat, 0,005 i» Magnesiumsulfat und 0,1 $> Ammoniumsulfat enthielt. Beide Bakterienstämme wurden gleichzeitig 18 Stunden "bei 28° "bebrütet. Nach der Bebrütung wurden Natriumacetat und Maismaische in Mengen von je 1,5 $, te zogen auf die Brühe, zugegeben. Die Mischung wurde etwa 4 "bis 6 Stunden geschüttelt, worauf der pH-Wert des Mediums zu steigen "begann und die Anreicherung von 5·-nucleotiden im Medium einsetzte. Fach 18-stündigem Schütteln wurde die Misohung filtriert. Aus dem Piltrat wurden 15 g 5'TAdenylaäure, 14 g Guanylaäure, 12 g 5'-0ytidylsäure und 11 g 5'-Uridylsäure erhalten»

Beispiel 10

Ehodotorula glutinis Harrison (MHHL, Y-1091) wurde 20 Stunden "bei 28° in einem wässrigen Medium von pH 6,5 unter Be- . lüftung und Bewegung "bebrütet. Bas Medium enthielt 10,0 % Melasse, 3,0 H Maiemaisohe, 0,5 # Harnstoff, 0,1 i» Dikaliumhydro genpho sphat, Ο,β 5ί Kaliumdihydro genpho sphat und 0,05 $ Magnesiumsulfat. Der pH-Wert des Mediums verschob sich auf 7,0 und wurde dann mit Watriumhydroxyd weiter auf 10,5 erhöht, worauf weitere 5 Stunden "bewegt wurde. Die Mischung wurde dann filtriert· Aue dem PiItrat wurden 8,6 g 5'-Adenyl-» eäure, 5_t3 g 5^f-Guanyleäure, 4,7 g ö'-Oytidylsäure und 4,5 g 5»-Uridyleäure gewonnen.

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U45169

Beispiel 11

Helminthosporium sigmoideum var. irreguläre Oralley und Tullis (ATCC-134O6) wurde 48 Stunden bei 28° in 10 1 eines in einem Tank enthaltenen wässrigen Mediums "bebrütet, das einen pH-Wert von 6,2 hatte und 5,0 56 Glukose, 0,5 f> Sojabohnenmehl, 0,05 f> Magnesiumsulfat, 0,01 ^ Calciumchlorid und 0,2 i» Kaliumnitrat enthielt. Nach der Bebrütung wurde das gebildete Myoel abgetrennt und in 10 1 einer 0,25-molaren Tris-Pufferlösung von pH 9»0 suspendiert. Die Suspension wurde 5 Stunden bei 37° stehengelassen und dann filtriert· Aue dem Filtrat wurden 0,75 g 5'-Adenylsäure, 0,72 g 5'-Guanyl- | säure, 0,69 g 5'-Oytidylsäurβ und 0,71 g 5'-Uridylsäurβ gewonnen.

Beispiel 12

Aspergillus queroinus Thorn und Church (ATCC-14307) wurde 72 Stunden bei 28° in 10 1 eines in einem Tank enthaltenen wässrigen Mediums unter Schütteln bebrütet· Das ^Medium hatte die gleiohe Zusammensetzung wie das in Beispiel 11 verwendetet. Naoh der Bebrütung hatte das Medium einen pH-Wert von 6,6, der dann durch Zusatz von Natriumhydroxyd auf 10,5 erhöht wurde, worauf weitere 4 Stunden geschüttelt wurde· Die Misohung wurde dann filtriert. Das Piltrat wurde durch Adsorption an Aktivkohlepulver, Elution von der Kohle, Ad- * sorption an einem Anionenaustausohharz, Elution vom Harz usw. gereinigt. Hierbei wurden 1,2 g 5^f-Adenylsäure, 0,95 g 5'-Guanylsäure, 0,7 g 5'-Cytidylsäure und 0,75 g 5'-Uridyl-Bäure erhalten.

Btiepiel 13

Streptomyoee aureuas Waksman und Henrioi (ATCO-13404) wurde 48 Stunden bei 28° in 30 1 eines in einem Tank enthaltenen wässrigen Mediums unter Sohütteln bebrütet· Dae Medium hatte •inen pH-Wert von 6,5 und enthielt 5,0 + Glukose, 3,0 Jl Maiamaieoh·, 0,5 H Pepton und 0,05 + Magnesiumsulfat. Der

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PH-Wert des Mediums stieg auf 7*0 und wurde durch Zusatz . von Natriumhydroxyd weiter auf 10,0 erhöht, worauf weitere 5 Stunden geschüttelt wurde. Die erhaltene Mischung wurde filtriert. Aus dem Piltrat wurden 4,2 g 5'-Adenylsäure, "2,9 g 5'-Guanyl säure, 2,j5 g 5'-Cytidylsäure und 2,5 g 5*-

Uridylsäure gewonnen.

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Claims (4)

Patent anBprtiohe

1)jVerfahren zur HerBtellung von 5'-nucleotiden aus Bakte- ^-'rien, Hefestämmen, Fungi imperfect!, Schimmelpilzen oder Aotinomyoeten, die durch Bebrüten in einer Nährlösung hergestellt worden Bind, daduroh gekennzeichnet, daß man das ' MikroorganiBmenprodukt, gegebenenfalls die von den "be-"brüteten Produkten abgetrennten Zellen, in einer wässrigalkalisohen Lösung "bei einem pH von 8 Ms 11 und Temperaturen zwischen 30 und 45⁰O in Suspension hält, anschließend das K-It rat als trennt und daraus in an sich "bekannter Weise die gebildeten 5'-WUoIeOtide isoliert»

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die abgetrennten Zellen mehrere Stunden einfriert, danach auftaut und dann im alkalischen Medium "behandelt.

3) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen zusätzlich, mit Phenol, Kresol oder Alkalideoxyoholaten "behandelt.

4) Verfahren nach Anspruch 1—3, dadurch gekennzeichnet» daß man dem verwendeten alkalischen Medium mehrtasische Phosphorsäure-, Pyrophosphorsäure-, Polyphosphorsäure-, Arsensäure- oder Zitronensäure-Anionen zusetzt. j

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Neu© Unterlagen (Art. 7 } 1 Abi 2 Nr. I Sau 3 au Änderunfleflee. v. 4.9.