<Desc/Clms Page number 1>
Verfahren zut Herstellung von 5, 6-Dimethylbenzimidazol- - cobalamin
EMI1.1
<Desc/Clms Page number 2>
bei einen bereits orangerot gefärbten Extrakt. Dieser wird mit Aktivkohle behandelt. Das Kohleadsorbat wird durch Filtrieren oder Zentrifugieren gewonnen und in üblicher Weise, z. B. mit einem wässerigen Alkohol, eluiert. Das so erhaltene Eluat hat bereits die typische, rein rote Farbe des Vitamin B. Man kann aus demselben sehr leicht in üblicher Weise kristallisiertes Vitamin B, gewinnen. Wenn die Menge an dem umzuwandelnden Cobalamin im Kulturmedium zu hoch gewählt wird, dann kann es vorkommen, dass es beim Gärprozess nicht vollständig in der gewünschten Weise umgewandelt wird.
Man kann dann die im Kulturfiltrat verbleibenden Mengen des betreffenden Cobalamins dadurch völlig verwerten, dass man das Kulturfiltrat nach weiterem Zusatz von Zucker einer erneuten Gärung mit den gleichen Bakterien unterwirft, wobei man im Prinzip ebenso vorgeht, wie bereits beschrieben wurde.
Zur technischen Verwirklichung des erfindungsgemässen Verfahrens kann besonders von der Vitamin B12- Gewinnung aus Faulschlamm ausgegangen werden. Man kann dabei zwei Wege einschlagen, nämlich :
1. Man kann in bekannter Weise aus Faulschlamm ein Konzentrat der verschiedenen Cobalamine, z. B. in Form eines"Kieselgur-Produktes"gewinnen (s. deutsche Patentschrift Nr. 1016898) und aus diesem durch Zellulose-Chromatographie die Aetiocobalamincarbonsäuren und den Faktor Ib abtrennen. Die in den gewonnenen Fraktionen enthaltenen inkompletten sauren Cobalamine werden nun mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens in Vitamin B12 umgewandelt.
2. Man kann aber auch in der Weise vorgehen, dass man aus Faulschlamm lediglich einen wässerigen Extrakt oder ein rohes Konzentrat, z. B. in Form eines Bentonit- oder Kohleeluates, herstellt, das neben inkompletten sauren Cobalaminen auch noch Faktor III, Purin-cobalamine und Vitamin B., selbst enthält. In diesem Fall kann man das vorliegende Verfahren besonders erfolgreich anwenden, da durch den Gä- rungsprozess in Gegenwart von 5,6-Dimethylbenzimidazol die vorhandenen Aetiocobalamincarbonsäuren und Faktor Ib sowie auch die gleichzeitig vorhandenen kompletten Cobalamine in Vitamin B12 umgewandelt werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren besitzt ferner noch folgenden sehr willkommenen technischen Vorteil : Die umzuwandelnden Cobalamine werden von den Bakterienzellen aufgenommen und in diesen in Gegenwart von 5,6-Dimethylbenzimidazol in Vitamin B., umgewandelt, das in den Zellen gespeichert wird. Dies ermöglicht eine einfache Gewinnung von Vitamin B,, idem man die Bakterienzellen abschleudert und aus ihnen Vitamin B12 isoliert.
Man kann auch die in der oben beschriebenen Weise durch Abzentrifugieren gewonnene Bakterienmasse ohne weiteres trocknen und das so erhältliche Trockenprodukt, welches in der Regel weit aber 100 mg an Vitamin B12 je kg enthält, allenfalls als Zusatzfuttermittel verwenden.
Das geschilderte Verfahren kann für die Umwandlung aller bisher bekanntgewordenen natürlichen Aetiocobalamincarbonsäuren, vor allem der häufiger auftretenden Mono-und Dicarbonsäuren ("Faktoren
EMI2.1
sind, angewendet werden.
Der durch das erfindungsgemässe Verfahren erzielbare technische Fortschritt besteht vor allem darin, dass man z. B. die als Nebenprodukte der Vitamin -Gewinnung aus Faulschlamm anfallenden inkompletten sauren Cobalamine, wie Aetiocobalamincarbonsäuren und Faktor Ib, für die man bisher noch keine direkte Verwendung gefunden hatte, nunmehr unmittelbar in Vitamin B umwandeln und so nutzbringend verwenden kann.
Einzelheiten über die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens sind aus nachfolgenden Ausführungsbeispielen ersichtlich :
Beispiel 1 : Man sterilisiert in üblicher Weise (30 Minuten bei 1200C) 10l eines Mediums, das je Liter folgende Bestandteile enthält und auf PH 6,7 eingestellt ist :
EMI2.2
<tb>
<tb> mittels <SEP> Säure <SEP> hydrolysiertes <SEP> Kasein, <SEP> entsprechend <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP> g <SEP> Stickstoff
<tb> mittels <SEP> Trypsin <SEP> verdautes <SEP> Kasein, <SEP> entsprechend <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> g <SEP> Stickstoff
<tb> NAH. <SEP> PO, <SEP> 1, <SEP> 76 <SEP> g <SEP>
<tb> KAPO4 <SEP> 1, <SEP> 76 <SEP> g <SEP>
<tb> MgC. <SEP> 6H <SEP> O <SEP> 0, <SEP> 40 <SEP> g <SEP>
<tb> FeS04.
<SEP> THO <SEP> 10 <SEP> mg
<tb> Hefeextrakt <SEP> 3 <SEP> g
<tb> Technische <SEP> Glukose <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
Sodann beimpft man mit 11 einer Vorkultur von Propionibacterium shermanii im gleichen Medium und bebrütet unter anaeroben Bedingungen bei 28-30 C. Nach zweitägiger Gärung versetzt man mit
<Desc/Clms Page number 3>
einer sterilen Lösung von 50 mg Aetiocobalamincarbonsäure und 200 mg 5, 6-Dimethylbenzimidazol.
Während des Gärprozesses fügt man von Zeit zu Zeit sterile Glukose-Lösung zu, um die Gärung in Gang zu halten, und regelt durch Zugabe von gesättigter Natriumcarbonatlösung den pH-Wert auf 6,6. Nach weiteren zwei Tagen setzt man nochmals 200 mg 5,6-Dimethylbenzimidazol zu. Nach insgesamt 6 Tagen ist der Gärprozess beendet. Man säuert durch Zusatz von Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,0 an, wodurch die Bakterien zum Sedimentieren gebracht werden. Durch Abschleudern erhält man 285 g
Bakterienmasse mit einem Trockensubstanzgehalt von 29%. Die feuchte Bakterienmasse wird mehrmals unter Druck je 10 Minuten bei 1100C mit Wasser extrahiert, wobei man insgesamt 2, 5 l orangeroten wäs- serigen Extrakt erhält.
Diesen versetzt man nach dem Erkalten unter Rühren mit 25 g Aktivkohle, saugt diese über Kieselgur ab und eluiert das Kohleadsorbat wiederholt bei Siedetemperatur mit einer Mischung aus 70 Vol. -Teilen Isopropanol, 25 Teilen Wasser und 5 Teilen Benzol so lange, bis das Eluat praktisch farblos ist. Man erhält so 11 eines rein rot gefärbten Eluates, das im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt wird. Man gewinnt daraus in üblicher Weise 34 mg kristallisiertes Vitamin B.
Das erhaltene Produkt kann durch Ermittlung seiner Eigenschaften, besonders des elektrophoretischen
Verhaltens bei PH 2,7 und 7,2 identifiziert werden. Unter diesen Bedingungen verhält sich Vitamin B neutral, während die Aetiocobalamincarbonsäuren bei PH 2,7 kathodisch und bei PH 7,2 anodisch wandern. Ferner lässt sich die Identität des Vitamin B, auch papierchromatographisch unter Benutzung der üblichen Entwicklungssysteme und durch Messung seines Absorptions-Spektrums bestätigen.
Beispiel 2 : Man geht in der gleichen Weise vor wie in Beispiel 1 angegeben, nur dass man hier an Stelle von Aetiocobalamincarbonsäuren 40 mg Faktor Ib verwendet. Man erhält dabei in völlig gleichartiger Weise 28 mg kristallisiertes Vitamin B,. Das erhaltene Produkt wird in gleicher Weise wie im Beispiel 1 identifiziert.
Beispiel 3 : 100 l einer wässerigen Lösung, die man durch Erhitzen von Faulschlamm und Beseitigung der Feststoffe durch Abzentrifugieren in üblicher Weise erhält und die im Test mit E. coli eine Vitamin B-Aktivität von 3, 8 mg/l zeigt und eine Mischung von Aetiocobalamincarbonsäuren sowie Faktor Ib samt kompletten Cobalaminen, wie Faktor III und Purin-cobalaminen, enthält, werden mit 1 kg technischer Glukose versetzt und in üblicher Weise sterilisiert. Sodann beimpft man mit 10 l einer Vorkultur von Propionibacterium W 10, die in dem in Beispiel 1 beschriebenen Medium gezüchtet worden ist.
Man bebrütet unter anaeroben Bedingungen bei 28-30 C. Nach zweitägiger Gärung versetzt man mit einer sterilen Lösung von 2 g 5, 6-Dimethylbenzimidazol und hält den Gärprozess durch zeitweisen Zusatz von steriler Glukoselösung und Regelung des pH-Wertes auf 6,6 durch Zugabe von konzentrierter Sodalösung 6 Tage lang in Gang. Am vierten Gärungstage setzt man nochmals l g 5, 6-Dimethyl- benzimidazol zu.
Die Aufarbeitung der Gärbrühe erfolgt in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise. Man setzt der Gärbrühe Schwefelsäure zu, bis ein pH-Wert von 4,0 erreicht ist. Die hiebei ausgeflockten Bakterien werden durch Abzentrifugieren abgetrennt. Man erhält so 2, 8 kg Bakterienmasse mit einem Trockensubstanz-Gehalt von 29%. Aus der feuchten Bakterienmasse gewinnt man, wie in Beispiel 1 beschrieben, 30 l wässerigen Extrakt, den man mit 300 g Aktivkohle behandelt. Das durch Abzentrifugieren gewonnene Kohleadsorbat eluiert man bei Siedetemperatur erschöpfend mit einer Mischung aus 70 Vol. -Teilen Isopropanol, 25'Teilen Wasser und 5 Teilen Benzol.
Aus den vereinten, rein rot gefärbten Eluaten (13,5 l) gewinnt man in üblicher Weise Vitamin Bu'Wie die nähere Untersuchung zeigt, sind die im ursprüngli- chen Medium enthaltenen Aetiocobalamincarbonsäuren sowie Faktor Ib nun verschwunden und in Vitamin B umgewandelt. Das gleiche gilt für die in dem Ausgangsmedium enthaltenen Purin-cobalamine und Faktor III.