DE1620615A1 - Verfahren zur Herstellung von N6-(2-Hydroxy-AEthyl)-tubercidin - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von N6-(2-Hydroxy-AEthyl)-tubercidin

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DE1620615A1
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tubercidin
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black
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Wiley Paul Fears
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Pharmacia and Upjohn Co
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Upjohn Co
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    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
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    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/14—Pyrrolo-pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Description

Alfred Hoeppener T-^. _ · '> OH1965 Dr.Hans Joacuin Wolff /JV -C--^^
Dr. Hans Chr. Beil ^U ä ^gnJ ; 1620615
Frankfurt a. M.-Höchtt Ad.lon.lr.lk 58 - ΤΛ 31264»
Unsere Hr. 12011
The Upjohn Company
Kalamazoo (Michigan, USA).
Verfahren zur Herstellung von H -(2~Hydroxy äthyl )-tuberci<iin.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ""H -(2-Hydroxyäthyl) tuber eidin [4- ( 2-Hydroxyäthyl .)-amino-7-ß-D-ribof uranosyl-7H-pyrrolo-C2,5-d3-pyrimidinI nach folgenden Reaktionsschema!
SAD ORIGINAL
NHa+ClO4"
HQCH2-CHa-:
1V*
HOHaC _ ι
Ma« al/
HO OH
CHa-CHa
-S
HClO4 HOHaC
HO OH
(ID
NHCHa-CHa-OH
HOHa
H H
HO OH
(in)
OH"
109881/Ϊ7Μ
Ss besteht darin, daß man Tuberciüin, das auch als Sparsomycin A oder ^-Amino-Tß-D-ribofuranosyl-TH-pyrrolo-[2,3-d3-pyrimidin bezeichnet wird, in Wasser in Gegenwart von Perchlorsäure mit Äthylenoxyd umsetzt, wobei man N -(2-Hydroxyäthyl)-tubereidin-perchlorat (II) erhält; diese Verbindung ergibt sodann beim Behandeln mit wässrigem Alkali das N6-(2-Hydroxyäthyl)-tubereidin (III).
Das neue N -(2-Hydroxyäthyl)-tubercidin ist eytotoxisch gegen KB-Zellen, wie an Gewebskultüren festgestellt wurde. Lösungen mit 10-30 Teilen der Verbindung pro Million eignen sich zum Waschen von Instrumenten, Gefäßen und Handschuhen, die beim Arbeiten mit Krebsgewebe in Berührung kommen, wobei die lebensfähigen KB-Krebszellen zerstört werden.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Tubercidin mit Wasser , das Äthylenoxyd enthält, gemischt, und Äthylenoxyd wird kontinuierlich bei Raumtemperatur 2-8 Tage lang in die Lösung eingeleitet. Während der Reaktion wird der pH-Wert durch Zugabe von 0,5 bis 2,5 S^-iger wässriger Lösung von Perchlorsäure bei etwa 6-7 gehalten. Das Produkt wird nach der Umsetzung in herkömmlicher Weise isoliert, beispielsweise durch Eindampfen zur Trockne und gegebenenfalls Reinigen durch Umkristallisation.
Das auf diese We4.se erhaltene N1-(2-Hydroxyäthyl)-tubercidin-perchlorat wird durch Behandlung mit einer wässrigalkalischen Lösung in H6-(2-Hydroxyäthyl)-tubereidin überführt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Verbindung II
909887/176A BAD ORIGINAL
Ohne vorherige Reinigung in Wasser gelöst und mit genügend latriumhydroxyd versetzt, sodaß ein pH-Wert yon Il resultiert. Das Gemisch wird dann 24 Std» lang auf eine Temperatur zwischen 50 und 10O0C erwärmt. Sann wird die Lösung zut Trockne eingedampft, vorzugsweise bei vermindertem Druck, und der so erhaltene Rückstand wird in üblicher Weise gereinigt, z.B. durch Umkristallisieren; dabei entsteht die reine Verbindung III.
Herstellung von Sparsomycin A (Tubercidin).
A. Fermentation
Ein Schrägnährboden mit Streptomyces sparsogenes var. sparsogenes, HRRIr 2940 wurde zur Inokulierung von mehreren 500 ml Brlenmeyer-Kolben verwendet, von denen jeder 100 ml eines Nährmediums folgender Zusammensetzung enthielt:
Glucosemonohydrat 25 g
Fharmamedia* oc _
Zp g
Leitungswasser zum Auffüllen auf 1 Liter
+ Pharmamedia = technisches Baumwollsamenöl, Hersteller Traders Oil Mill Co., Fort Worth, GJexas.
Der pH-Wert des Jfährmediums vor dem Sterilisieren betrug 7,2. Das Medium wurde 2 Tage bei 280O auf einer Oump-Schüttelmaschine mit 250 Umdrehungen pro Minute behandelt.
Mit dem Inhalt eines dieser Kolben (100 ml) wurden 15 1 des obigen sterilen Mediums (S-I) plus 1 ml/l Specköl in einem 20 1-Tank inokuliert. Die Züchtung erfolgte 24 Std. bei 280O und einer Belüftung von 10 Horaallitern/Minute, Schüttel-
909887/1764 BAp oRIG,NAL
geschwindigkeit 400 Umdrehungen pro Hinute.
Das resultierende Produkt wurde dann zur Inokulierung von 250 1 des folgenden sterilen Mediums, das sich in einem Gärbehälter von 380 1 Inhalt befand, verwendet:
Glucosemonohydrat 10 g/Liter
Dextrin 15 g/liter
Pharmamedia 20 g/Liter
Wilson's Peptone Liquor Hr. 159+ 5 g/Liter
Specköl 2 ml/Liter Eest Leitungswasser
+ Wilson's Pepton Liquor Nr. 159 besteht aus hydrolysierten Proteinen tierischen Ursprungs. "
Sie Gärung erfolgte dann während 113 Std., wobei die Temperatur bei 280O gehalten wurdej filtrierte Luft wurde in einer Menge von 100 Normallitern pro Minute zugeführt und es wurde mit 28 Umdrehungen pro Minute gerührt. Während der Fermentation wurden 1850 ml Specköl als 8chäumungsVerhinderer zugegeben.
B. Aufarbeitung.
Die gesamte Fgrmentationsbrühe wurde mit 350 ml Schwefelsäure (konzentriert) vom End-pH-Wert 7,1 auf pH 2,4-eingestellt und unter Verwendung von 3,6 $ Diatomeenerde als Filterhilfsmittel filtriert. Der Filterkuchen wurde mit 0,2 Volumenteilen an entionisiertem Wasser gewaschen, und' die klare Brühe plus YiaschlÖsung (280 l) vmrde mit 300 ml 50 jt-iger wässriger Natriumhydroxydlösung auf pH 7,35 gebracht; dann wurde über Nacht bei 100O stehen gelassen. Daraufhin wurde die Gärbrühe mit 50 ml 50 ^-iger wässriger Natriumhydroxydlösung
9 0 ■■ 4 a 1 / - '■· -3 - BAD ORIGINAL
auf pH 8 eingestellt und eine Stunde lang Mit 1 i» iSatfärbungekohle und 3 fl Diatomit gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und der Kohlekuchen wurde mit 0,2 Vol.-ieilen 20 56-igem wässrigem Aceton gewaschen. Der gewaschene Kuchen wurde 2 mal mit 0,4 Volumina 50 tigern wässrigem Aceton gewaschen, das sodann mit konzentrierter Schwefelsäure auf pH 2,5 angesäuert wurde, und die Eluate wurden vereinigt. Die vereinigten Acetoneluate (72 1) wurden mit 30 ml 50 £-iger wässriger Natriumhydroxydlösung auf pH 6,4 gebracht und zu einer wässrigen Lösung (40 1) eingeengt. Das Konzentrat wurde auf pH 5»9 eingestellt und einer Gefriertrocknung unterworfen, wobei man 447 g lyophilisiertes Material erhielt.
Weitere 1126 g wurden erhalten, indem man die obige Fermentation und Aufarbeitung zweimal wiederholte. Bas vereinigte Produkt (1573 g) wurde in 10 1 Methanol von 40° 1 Std. lang aufgeschlämmt. Unlösliches Material wurde abfiltriert und dreimal mit je 500 ml warmem Methanol (40 ) gewaschen. Methanol-Extrakt und Vaschlösungen wurden vereinigt (11(5 1) und im Vakuum eingeengt, wobei man 321 g trockenen Rückstand (HRV-25,3) erhielt, der gegen Proteus vulgaris einen Testwert von 1,25 Bioeinheiten pro mg zeigte.
C. Reinigung .
Verteilungssäule
300 g des obigen Präparates (HRV-25t3) wurden auf eine wie folgt hergestellte Ohromatographiersäule aufgegeben: Bin Lösungsmittelsystem wurde hergestellt unter Verwendung gleicher Volumina (350 Liter) Mcllvaine'g pH 6,0-Puffer und
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BAD
16206TS
Me thyläthylke ton. Eine Aufschlämmung aus 9» 6 kg Diatomit in 60 1 der oberen Phase und 4,8 1 der unteren Phase des obigen Lösungsmittelsystems wurde in eine 30,5 cm Säule eingegossen und mit Stickstoff von 1,3 Atmosphären gepackt. Die für diese Säule bestimmte Beschickung wurde in 3 1 der unteren Phase des genannten Lösungsmittelsystems gelöst, mit 1920 g Diatomit aufgeschlämmt und mit einem solchen Quantum der oberen Phase versetzt, daß ein freifließendes Gemisch entstand. Diese Beschickung wurde vorsichtig auf das obere Ende der Säule, die mit einer Schicht Seesand bedeckt war, aufgebracht. Die Säule wurde mit 2 l/Min, der oberen Phase eluiert. Es wurden Fraktionen von je 4 1 aufgefangen, lediglich as Beginn und am Ende wurden 20 1 Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen wurden eingeengt und ihre Aktivität gegen P. vulgaris wurde getestet. Zu diesem Zeitpunkt des Verfahrens erfolgte die Trennung von Sparsomyein und Sparsomycin A. Beim weiteren Verarbeiten werden diese Komponenten gereinigt, wobei man schließlich kristallines Material erhält.
Die Fraktionen 24-34 einschließlich, die aus obiger Säule erhalten wurden, enthielten das Sparsomycin.
Reinigung von Sparsomycin A·
Sparsomyoin A wurde wie folgt gereinigt und kristallisiert: Die Fraktionen 11-20 einschließlich, die aus der oben beschriebenen Säule isoliert wurden, enthielten das Sparsomycin A. Diese Fraktionen wurden vereinigt vmä iisi verändertem Druck eingeengt, wobei man 7,2 g eines kristallinen Materials erhielt. Die Kristalle wurden in 400 si Wasser uad 50 «1 0,1-n.
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BAD ORIGINAL
HOl gelöst. Zur Erleichterung der Lösung wurde schwach erwärmt und dann filtriert. Sie klare Lösung wurde »it 50 ji-iger wässriger Hatriumhydroxydlösung auf pH 9,0 eingestellt und dann 5 Std. lang in Kühlschrank gehalten. Die dabei entstehenden Kristalle wurden abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei man 5»65 g des Präparates ÄDA-102,1 erhielt. 2 g dieses Präparats wurden in 75 ml Wasser und 20 ml 0,1-n HOl gelöst. Me klare Lösung wurde mit 50 ji-iger wässriger Hatriumhydroxydlösung auf pH 9,0 eingestellt, wobei sofort Kristallisation begann. Die Lösung wurde 7 Std. lang bei 250C stehen gelassen,
und dann wurden die Kristalle gesammelt, nit 25 Ml Wasser gewaschen und getrocknet, wobei man 1,52 g des Präparates ADA-105,1 rom Schmelzpunkt 247,8 - 2500O erhielt} optische Drehung 2| - 62° Cc= O9718 in 0,1-n HCl), lajiiralentgewicht 269 ' = 5s07 (in Wasser), W-Absorptionsspektrum in
Wasser 270 mp , a · 44,14
OsOl-n H9SO. 227 m«, , a * 85,28 d * 27lB/t, a - 40,82
0$Ql-n KOH 270 m<t, a * 43,50
IE-Absorption (cm )s
8AD 909387/1784
3350 (S) (Sch) °lA 1475 (M) 1160 (Schw) 903 (M)
3250 (S) (Öl) 1458 (S)(Ol) 1134 (M) 867 (M)
3145 (S) (Öl) 1445 (M)(SCh) 1120 (M) 852 (Schw)
3095 (S) 1895 (Schw) 1426 (M) 1093 (M) 842 (Schw)
2880 (3) 1640 (S) 1370 (M) (öl) 1080 (Schw) 799 (Schw)
2810 (3) 1592 (S) 1351 (M) • 1055 (M) 715 (Schw)
1553 (M) 1306 (M) 1042 (S) 704 (S)
1502 (M) 1276 (Schw) 1017 (S) 675 (M)
Analyses 1255 (S) 992 (3) 658 (M)
Ber. für 1241 (M) 953 (Schw)
Gefunden: 1198 (Schw) 912 (Schw)
Beispiel
G: 49,62; H: 5,30; N: 21,04.
G: 49,81; H: 5,20; H: 20,92.
N6-(2-Hydroxyätnyl)-tubercidin.
Ein Gemisch aus 1 g Tubercidin und 15 ml Wasser, mit Äthylenoxyd gesättigt, wurde unter Einleiten von Äthylen oxyd 5 Tage lang gerührt. Ber pH-Wert des Gemische wurde stets bei 6,5 gehalten, durch regelmäßige Zugabe von 1 #-iger wässriger Perohlorsäurelöaung. Bann wurde der pH-Wert Mit Perchlorsäure auf 5,0 eingestellt, die Lösung wurde filtriert und das Piltrat wurde bei vermindertem Brück but Trockne eingedampft·
Her Bückstand wurde in 40 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung wurde mit !-normaler Hatriuahydroxydlö-
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BAD ORIGINAL
sung auf 11 eingestellt. Die Lösung wurde 24 Std. lang auf 60° erwärmt und dann bei vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der so erhaltene Rückstand wurde mit Wasser verrührt, abgekühlt und filtriert. Hach sorgfältigem Waschen wurde das dabei erhaltene Produkt gereinigt, indem man es in verdünnter Salzsäure löste und mit verdünnter Natriumhydroxydlösung Ausfällung bewirkte. Nach dem Waschen und Trocknen des Niederschlags erhielt man N -(2-Hydroxyäthyl)-tubercidin vom Schmelzpunkt 210-210,50C
Analyse:
Ber.: für O13H18V5X C* 50,31; H: 5,84| Ni 18,06. Gefunden: Cs 5O,13j Hs 5,83? N: 18,11.
Zur Herstellung des Endproduktes kann anstelle von Natriumhydroxyd auch Kalium- oder Bariumhydroxyd verwendet werden.
ORIGINAL 909887/1764

Claims (1)

162061g
Patentanspruch ι
Verfahren zur Herstellung von H -(2-Hydroxyätfayl)-tubereidin, dadurch gekennzeichnet, daß man Suberciiin in Gegenwart von Perchlorslisre mit Äthylenoxyd su N -{2™ Hydroxyäthyl)-tubercidin-perehlorat umsetst imd dieses Salz mit Natrium- oder Kaliumliyirozyd behandelt.
F& TkQ Üp|©hn
9887/1704 bad
DE19651620615 1964-10-12 1965-10-09 Verfahren zur Herstellung von N6-(2-Hydroxy-AEthyl)-tubercidin Pending DE1620615A1 (de)

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