DE2553927B2 - An der Spermidin-Seitenkette N-terminal substituierte Derivate von Antibioticum BM 123 γ und Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents

Description

R¹O

bedeuten, und deren pharmakologisch unbedenkliche Säureadditionssalze.

Z Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man BM123gamma als Substanzgemisch oder BM123gammai oder BM123Kamma2 der allgemeinen Formel

NH-(CH₂J₃-NH-(CH₂U-NH₂

NH

mit einem in einer gegenüber einer äquimolaren Menge BM123gamma überschüssigen Menge eingesetzten Keton der allgemeinen Formel

R²

O=C

wobei R¹, R² und R³ die in Anspruch 1 angegebenen jo Bedeutungen haben bzw. cyclische Ketone die Strukturen aufweisen, die sich aus den in Anspruch 1 für R² und R³ zusammen mit der Methylidingruppe angegebenen Bedeutungen ergeben, mit NatriumcyanoDorhydrid bei einem auf 6,0 bis 8,0 gehaltenen pH-Wert bei 10 bis 35°C in einem inerten Lösungsmittel umsetzt.

Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Die reduktive Alkylierung, durch die man die erfindungsgemäßen Verbindungen herstellt, wird wie folgt durchgeführt. Man löst ein Antibioticum BM123gamma, BM123gammai oder BM123gamma2 in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Wasser, Methanol, 2-Methoxyäthanol oder Gemischen hieraus, versetzt die dabei erhaltene Lösung mit einer gegenüber einer äquimolaren Menge überschüssigen Menge des jeweiligen Ketons und gibt im Anschluß daran eine zur Reduktion ausreichende Menge an Natriumcyanobor- -,o hydrid zu. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird während der Umsetzung mit verdünnter Mineralsäure auf 6,0 bis 8,0 gehalten. Nach 1- bis 24stündiger Umsetzung bei Raumtemperatur (10 bis 35°C) dampft man das Reaktionsgemisch im Vakuum zur Trockne ein, behandelt den Rückstand mit Methanol und filtriert das Ganze. Das Filtrat wird mit Aceton verdünnt, und der dabei ausfallende Feststoff wird durch Filtrieren entfernt und im Vakuum getrocknet.

Ketone, die bei obigem Verfahren eingesetzt werden, t,o sind in Tabelle I aufgeführt.

Aus den bei der reduktiven Alkylierung anfallenden Reaktionsgemischen lassen sich die gewünschten Produkte durch übliche Verfahren gewinnen, wie Ausfällung, Konzentrierung, Lösungsmittelextraktion oder Kombinationen hieraus. Nach erfolgter Isolierung kann man diese Produkte durch irgendeines der allgemeinen bekannten Reinigungsverfahren reinigen.

Solche Reinigungsverfahren bestehen beispielsweise in einer Umkristallisation aus verschiedenen Lösungsmitteln und Lösungsmittelgemischen, chromatographischen Techniken oder Gegenstromverteilung, und diese Verfahren werden gewöhnlich alle für diesen Zweck verwendet.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind organische Basen und können daher mit einer Reihe organischer oder anorganischer salzbildender Verbindungen Säureadditionssalze bilden. Die Herstellung solcher Salze erfolgt durch Vermischen der freien Base der jeweiligen Verbindung mit bis zu 3 Äquivalenten einer Säure, zweckmäßigerweise in einem neutralen Lösungsmittel. Für die Salzbildung geeignete Säuren sind beispielsweise Schwefelsäure, Phosphorsäure, Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, SuIfaminsäure, Zitronensäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Essigsäure, Benzoesäure, Gluconsäure oder Ascorbinsäure. Die Säureadditionssalze der erfindungsgemäßen Verbindungen sind im allgemeinen kristalline Feststoffe, die sich im allgemeinen im Wasser, Methanol oder Äthanol verhältnismäßig gut lösen, in nichtpolaren organischen Lösungsmitteln, wie Diethylether, Benzol oder Toluol, jedoch verhältnismäßig unlöslich sind. Die freien Basen sind erfindungsgemäß als äquivalent zu ihren nichttoxiscnen Säureadditionssalzen anzusehen.

Die Antibiotica mit den Bezeichnungen BM123jSi, BM123#>, BM123gammai und BM 123gamma₂entstehen während der Züchtung eines neuen Stammes einer undeterminierten Species von Nocardia unter koniroi-

lierten Bedingungen. Dieser neue Antibioticum produzierende Stamm wurde aus einer Probe Gartenerde isoliert, die bei Oceola, Iowa, gefunden wurde, und wird in der Kultursammlung der Lederle Laboratories Division, American Cyanamid Company, Pearl River, New York, als Kultur No. BM123 aufbewahrt. Eine lebende Kultur des neuen Mikroorganismus wurde bei Northern Utilization Research and Development Divison, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt und in die ständige Kultur-Sammlung aufgenommen. Sie ist von dort unter der Hinterlegungs-No. NRRL 5646 frei verfügbar. Die Angabe BM123j3 bezieht sich vorliegend auf irgendein Gemisch aus BM123j?i und BM!23j?₂, und die Angabe BM123gamma bezieht sich auf ein beliebiges Gemisch is aus BM123gammai und BM123gamma2.

Bezüglich einer eingehenden Beschreibung des Mikroorganismus NRRL 5646 der Spezies Nocardia wird auf DE-OS 23 51 344 verwiesen.

Die Produktion von BM123/J oder BM123gamma ist nicht auf diesen besonderen Organismus oder die Organismen beschränkt, die völlig dem oben beschriebenen Wachstumsverhalten und den angeführten mikroskopischen Eigenschaften genügen, welche lediglich zu Illustrationszwecken angegeben sind. Es werden aus diesem Organismus daher auch durch verschiedene Maßnahmen Mutanten gebildet, wie beispielsweise durch Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung oder Einwirkung von Stickstofflost oder Actinophage. Eine lebende Kultur eines typischen derartigen Mutantenstammes wurde bei Northern Utilization Research and Development Division, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt und dort in die ständige Sammlung aufgenommen, von wo sie unter der Nummer NRRL 8050 bezogen werden kann. Obwohl die Kulturmerkmale, die physiologischen Merkmale und die morphologischen Merkmale von NRRL 8050 praktisch die gleichen sind wie diejenigen von NRRL 5646, produziert der erstere während einer aeroben Fermentation größere Mengen an BM123gamma. Der Oiganismus NRRL 8050 unterscheidet sich ferner vorn Stammorganismus NRRL 5646 durch folgende Merkmale:

(a) Er reduziert Nitrate langsamer zu Nitriten und

(b) er bildet auf Bennett- sowie auf Hefeextrakt-Agar ein rosenholz-lohfarbenes Mycelpigment.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind im allgemeinen kristalline Feststoffe, die in nichtpolaren Lösungsmitteln, wie Diäthyläther oder Hexan, verhältnismäßig begrenzt löslich sind, sich in Lösungsmitteln, wie Wasser oder niederen Alkanolen, jedoch weit stärker lösen. Die Antibiotica BM123gammai und BM123gamma:i sind Strukturisomere, die sich durch folgende Strukturformeln darstellen lassen:

HO^~~-—Ο_χ Ο

HN-^r^HO

CH₃

H O

- A ^jl\

Y I N H-(CH, )₃-N H-(CH, U-N H, H

MH

CH,

H₂N NH H₂N NH HN NH

H O

NH-(CH₂J₃-NH-(CH₂U-NH,

60

Die reduktive Alkylierung von BM123gamma und BM123gammai oder BM123gamma2 mit Ketonen findet an der Spermadin-Seitenkette unter Bildung von Derivaten der in Anspruch 1 angegebenen allgemeinen Formel statt

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind wertvolle antibiotische Wirkstoffe. Diese günstige Eigenschaft der Derivate von BM123gamma zeigt sich anhand ihrer Fähigkeit zur Bekämpfung systemischer lethaler Infektionen bei der Maus. Die neuen Substanzen zeigen bei der Maus gegenüber Escherichia coli L)S 311 in vivo eine starke antibakterielle Wirkung, wenn man sie durch subkutane Einzeldosis an Gruppen von Carworth Farms CF-1-Mäusen mit einem Gewicht von etwa 20 g verabreicht, die intraperitoneal mit einer lethalen Dosis dieser Bakterien in- einer ΙΟ"³-Verdünnung von Trypticase-Sojabrühe-TSP einer 5 Stunden alten TSP-Blutkultur infiziert sind. In der folgenden Tabelle VI ist die in vivo-Akiivität typischer erfindungsgemäßer Produkte, die aus den angegebenen Carbonylverbindungen hergestellt worden sind, gegenüber Escherichia coli US 311 an der Maus aufgeführt Die Aktivität ist in ED50-Werten oder derjenigen Dosis in Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht angegeben, die zum Schutz von 50% der Mäuse gegenüber E. coli erforderlich ist

Tabelle I

Eingesetztes Keton Name des Derivats

ED₅O in mg/kg Körpergewicht

NMR-Hauptsigna! δ

1 -Dipropylamino-2-propanon

l-Chlor-3-pentanon Cyclooctanon 4-M ethyl-2-penta non Phenylaceton trans-4-Phenyl-3-buten-2-on

1 -Cyclohexyl-1 -propanon 6-M ethyI-5-hepten-2-on 3-M ethyi-2-pentanon 5-M ethyl-2-hexanon 3-Äthyl-2-pentanon 3,5-Dimethyl-2-octanon 3-Octanon

3-M ethyl-2-hexanon 3-Indolylaceton

2-Pentanon

2-Butanon

2-Cyclopenten(- ί -)yl-aceton

Aceton

Mesityloxid

Methoxyaceton Cyclohexylaceton 4-Methyl-2-hexanon 2,2,4,4-Tetramethylcyclopentanon

2,4,4-Trimethylcyclopentanon 2-Cyclopenty!cyc!opentanon 2-(Cyclo-l -hexenyl)cyclohexanon 3-tert.-Pentylcyclopentanon 2-Cyclohexylcyclohexanon 2-Äthylcyclohexanon 3,3-Dimethyl-2-butanon 2-Undecanon Tetrahydrothiopyran-4-on 3,5-Dimethylcyclohexanon 2-Tetradecanon 1 -M ethoxy-1 -buten-3-on

4-Hydroxy-3-methyl-2-butanon Menthon

Cyclononanon l-Methyl-2-decalon

Isophoron

l-Methyl-2-(N,N-dipropylamino)-äthyl- 0,3 0,9

BM123gamma

l-Äthyl-3-chlorpropyl-BM123gamma 0,12 1,2

Cyclooctyl-BMmgamma 0,18 1,5

l,3-Dimethylbutyl-BM123gamma <0,12 1,0

l-Methyl-2-phenyläthyl-BM123gamma 0,18 7,5

l-Methyl-3-phenylpropen(-2-)yl- 0,25 7,5

BM123gamma

l-Cyclohexylpropyl-BM123gamma 0,37 7,6

l,5-Dimethylhexen(-4-)yl-BM123gamma 0,06 1,3

l,2-Dimethylbutyl-BM123gamma 0,12 1,0

l,4-Dimethylpentyl-BM123gamma 0,12 1,2

l-Methyl-2-äthylbutyl-BM123gamma 0,18 1,0

l,2,4-TrimethylheptyI-BM123gamma 0,37 7,5

l-Äthylhexyl-BM123gamma 0,18 7,8

l,2-Dimethylpentyl-BM123gamma 0,18 1,2

l-Methyl-2-0S-indolyl)äthyl 0,12 1,3

BM123gamma

l-Methylbutyl-BM123gamma <0,12 1,34

l-Methylpropyl-BMmgamma <0,12 1,26

l-MethyI-2-cyclopenten(-2-)- <0,12 1,38 yl-äthyl-BM 123gamma

lsopropyl-BM123gamma <0,12 1,33

l,3-Dimethylbuten(-2-)yl-BM123 gamma 0,3 1,38

l-Methyl^-methoxyäthyl-BMnSgamrna 0,3 1,26

l-Methyl^-cyclohexyläthyl-BM^gamma 0,18 1,13

l,3-Dimethylpentyl-BM123gamma <0,12 0,84

2,2,4,4-Tetramethylcyclopentyl- 0,75 1,07

Brvii23gamma

2,4,4-Trimethylcyclopentyl-BM123gamma 2-Cyclopentylcyclopentyl-BM 123garnrna 2-( 1 -Cyclohexen)cyc!ohexyl-BM 123gamma 3-tert.-Pentylcyclopentyl-BM 123gamma 2-Cyclohexylcyclohexyl-BM 123gamma 2-Äthylcyclohexyl-BM123gamma

l,2,2-Trimethylpropyl-BM123gamma

1 -M ethyldecyl-BM 123gamma

4-Tetrahydrothiopyranyl-BM 123gamma 3,5-Dimethylcyclohexyl-BM123gamma l-Methyltridecyl-BM123gamma

1 -Methyl-3-methoxypropen(-2-)yl-BM123gamma

1 ^-DimethyW-hydroxypropyl-BM123gamma

S-Methyl-o-isopropylcyclohexyl-BM123gamma
Cyclononyl-BM 123gamma

Decahydro-l-methyl-2-naphthyl-

BM123gamma

3,3-Dimethylcyclohexen(-5-)yl- 0,37 1,04

BM123gamma

0,3	1,1
0,37	!,82
0,19	1,6
0,5	0,78
0,75	1,6
0,19	1,4
<0,12	1,0
>2	13
0,38	1.2
<0,12	0,9
2,0	1,28
>2,0	1,15
0,12	1,3
0,38	0,92
0,18	1,5
0,25	1,2

r=—:—: —^—■ rs Ij	25 53 927	10	0,25	NMR-Haupt-
I 9			0,30	signal δ
i:' Fortsetzung		ED50 in mg/kg		1,0
: Eingesetztes Keton	Name des Derivats	Körpergewicht	0,38
		0,37	0,3	7,0
j. 3-Methyl-2-decalon	Decahydro-S-methyl-^-naphthyl-		<2,0
	BM123gamma	1,0	1,5	1,32
■ ■ 1 -(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-butanon	2-Äthyl-2-(3,4-dimethoxyphenyl)äthyl-
	BM123gamma	0,18	0,5	1,28
X] l-Diäthylamino-3-butanon	l-Methyl-3-(N,N-diäthylamino)propyl-			1,18
t ·'■	BM123gamma	1,5	0,25
f Chloracetessigsäure-äthylester	l-Methyl^-chlor^-carbäthoxyäthyl- BM 123öammn	0,18	0,25	1,16
\ 3-Hydroxy-3-methyl-2-butanon	1,2,2-Dimethylhydroxypropyl-		0,75	7,48
	BM123gamma	0,19
\ 3-Methyl-2-butanon	1,2-Dimethylpropyl-BM 123gamma	0,25	0,75	1,3
p-Chlorphenylaceton	1 -Methyl-2-(4-chlorphenyl)-äthyl-
	BM123gamma	0,38	0,7	1,0
N-(tert.-Butyl)acetoacetamid	2-(tert.-Butylcarbamoyl)-l-methyläthyl-			0,94
	BM123gamma	l-Methyl-2,2-dimethoxyäthyl-BM123gamma 0,5	0,38	1,18
1,1 -Dimethoxyaceton		l-Propylbutyl-BM123gamma	0,38
4-Heptanon	l-Methyl-2-(3-methoxyphenyl)äthyl-	0,38	7,26
3-M ethoxyphenylaceton	BM123gamma	0,37	1,22
	2-Phenylcyclohexyl-BM 123gamma	0,37	1,18
I 2-Phenylcyclohexanon	l-Methyl^-phenoxyäthyl-BMnSgamma		7,5
Phenoxy-2-propanon	l-Methylbutin(-2-)yl-BM123gamma	0,38
j 3-Butin-2-on	l-Methyl-2-{N,N-dimethylamino)propyl-	0,75	1,25
i Dimethylaminoaceton	BM123gamma	0,38
	l-Methyl-4-(N,N-diäthylamino)butyl	0,38	7,5
I 5-Diäthylamino-2-pentanon	BM123gamma	0,3	1,18
	2-Cyclohexenyl-BM 123gamma	0,25	1,2
I 2-Cyclohexen-l-on	l-Cyclopropyläthyl-BM^Sgamma	0,18
s Cyclopropylmethylketon	l-Methyl-S^-dimethoxypropyl-	0,50	6,5
[ 4,4-Dimethoxy-2-butanon	BM123gamma	0,39
	l-Carbomethoxy-2-carbomethoxyäthyl-	0,39	7,2
; l^-Dimethylacetondicarboxylat	BM123gamma	0,75
	l-Methyl-2-(2-methoxyphenyl)äthyl-		7,5
\ 2-M ethoxyphenylaceton	BM123gamma		1,36
	Cyclobutyl-BM123gamma .		7,2
ί Cyclobutanon	1-Methylheptyl-BM 123gamma	7,5
2-Octanon	l-Methyl-3-phenylpropyl-BM123gamma	7,24
4-Phenyl-2-butanon	l-MethyW-chlorbutyl-BM123gamma
5-Chlor-2-pentanon	l-Methyl-2-(2-chlorphenyl)äthyl-	7,26
o-Chlorphenylac-~ton	BM123gamma	1,5
	l-Methyl-2-(3-chlorphenyl)äthyl- BM123eamma	1,3
m-Chlorp heny laceton	Cyclohexyl-BM 123gamma	1,3
Cyclohexanon	l-Methylpentyl-BM123gamma	1,5
2-Hexanon	1-Methylhexyl-BM 123gamma	1,7
2-Heptanon	Cycloheptyl-BM 123gamma	1,0
Cycloheptanon	Cyclopentyl-BM123gamma	1,15
Cyclopentanon	l,3,3-Trimethylbutyl-BM123gamma	0,9
4,4-Dimethyl-2-pentanon	2-Acetamido-l-methylpropyl-	0,86
2-Acetamido-3-butanon	l-Isopropyl-4-methylpentyl-BM 123gamma	7,55
2,6-Dimethyl-3-heptanon	1-Propylpentyl-BM 123gamma
4-Octanon	1 -(3-Pyridyl)äthyl-BM 123gamma
3-Acetylpyridin

12

Fortsetzung

Eingesetztes Keton

Name des Dirivats

ED50 in mg/kg	NMR-Haupt
Körpergewicht	signal ö
0,25	0,88
0,75	0,9
0,18	7,45
0,75	2,86
<0,12	1,2
<0,25	1,64
0,39	2,0
0,18	7,2
0,5	0,92
0,39	1,26
0,25	1,74
0,18
0,12
0,25	1,8
0,39	1,16
0,18	1,2
0,18	7,5
0,37
0,18	1,18
0,37	1,4
0,18	1,3
0,18
0,12	0,84
0,12

3-Heptanon

Butyroylessigsäureäthylester

l-Benyl-4-piperidon

l-Methyl-4-piperidon

2-Acetyl-5-norbornen

Bicyclo[3.2.1]octan-2-on

3-Chinuclidinon

5-Methoxy-2-tetralon

4-M ethyl-2-heptanon

3,4-Dimethyl-2-hexanon

2-M ethylcyclopentanon

2,4-Dimethylcyclopentanon

2-Äthylcyclopentanon

2-Adamanton

3-Hexanon

Äthyl^-methylacetoacetat

Norbornanon

3-Hydroxy-2-butanon

4-Hlydroxy-3-methyl-2-butanon

2-Nonanon

5-Hydroxy-2-pentanon

2-Decanon

4-tert.-ButylcycIohexanon

2-Äthylidencyclohexanon

l-Äthylpentyl-BM123gamma

l-(Carbäthoxymethyl)butyl-BM123gamma

l-Benzyl-4-piperidyl-BM123gamma

l-Methyl-4-piperidyl-BM123gamma

l-[5-Norbonen(2)]äthyl-BM123gamma

S-Chinuclidinyl-BM^gamma

5-Methoxy-2-tetralyl-BM123gamma

l,3-Dimethylhexyl-BM123gamma

l,2,3-Trimethylpentyl-BM123gamma

2-Methylcyclopentyl-BM123gamma

2,4-Dimethylcyclopentyl-BM 123gamma

2-ÄthylcycIopentyl-BM123gamma

Adamantyl-2-BM 123gamma

l-ÄthyIbutyl-BM123gamma

1 -M ethyl-2-carboäthoxypropy 1-BM123gamma

Norbornyl-BM123gamma
l-Methyl-2-hydroxypropyl-BM123gamma

l-Methyl-2-(3-hydroxy-2-methylpropyl)-BM123gamma

1-Methyloctyl-BM 123gamma
l-Methyl-4-hydroxybutyl-BM123gamma
l-Methylnonyl-BM123gamma
4-tert.-Butylcyclohexyl-BM 123gamma
2-Äthj'lidencyclohexyl-BM 123gamma

Zur Herstellung von vorwiegend BM123|? und
BM123gamma ausgewähltes Fermentantionsverfahren

Die Züchtung von Nocardia sp. NRRL 8050 kann in einer Reihe verschiedener flüssiger Kulturmedien vorgenommen werden. Zur Bildung der Antibiotica geeignete Medien enthalten assimilierbare Kohlenstoffquellen, wie Stärke, Zucker, Melassen oder Glycerin, assimilierbare Stickstoffquellen, wie Protein, Proteinhydrolysat, Polypeptide, Aminosäuren oder Maisquellwasser, sowie anorganischen Anionen und Kationen, wie Kalium, Magnesium, Calcium, Ammonium, Sulfat, Carbonat, Phosphat oder Chlorid. Spurenelemente, wie Bor, Molybdän oder Kupfer, werden als Verunreinigungen anderer Bestandteile der Medien geliefert Die Belüftung in Tanks oder Kolben erfolgt, indem man durch das Fermentationsmedium oder auf die Oberfläche des Fermentationsmediums unter Druck sterile Luft leitet Eine weitere Durchmischung in Tanks erfolgt durch einen mechanischen Rührer. Gegebenenfalls kann man auch ein Mittel gegen Schaumbildung zusetzen.

Herstellung des Inokulums
für BMl 23JS und BM123gamma

Ein primäres Schütlelflascheninokulum von Nocardia sp. NRRL 8050 wird hergestellt, indem man 100 ml steriles flüssiges Medium durch Abkratzen oder Abwaschen von Sporen aus einer Agarschräge der 40 Kultur in 500-ml-Kolben inokuliert. Gewöhnlich verwendet man hierzu folgendes Medium:

Bactotrypton	5g
Hefeextrakt	5g
Rindfleischextrakt	3g
Glucose	10g
Wasser auf	1000 ml

Die Kolben werden bei einer Temperatur von 25 bis 29°C, vorzugsweise 28° C, inkubiert und über eine

50 Zeitspanne von 30 bis 48 Stunden kräftig auf einem Rotationsschüttler in Bewegung gehalten. Anschließend wird das Inokulum in sterile Schraubverschlußkulturflaschen übertragen und bei unter —17,8° C gelagert-Dieser Vorrat an vegetativem Inokulum wird dann

55 anstelle von Schrägagarpräparaten zur Inokuiierung weiterer Schüttelkolben für die Herstellung dieses erststufigen Inokulums verwendet

Die aus dieser ersten Stufe erhaltenen Kolbeninokula werden zur Beimpfung von jeweils 12 Liter Ansätzen

bo des gleichen Mediums in 20 Liter Glasfermentern verwendet Der Inokulumbrei wird mit steriler Luft belüftet während man ihn 30 bis 48 Stunden weiter wachsen läßt

Mit den 12 Liter Ansätzen der in der zweiten Stufe

b5 erhaltenen Inokula werden Tankfermenter beimpft die 300 Liter des folgenden sterilen flüssigen Mediums enthalten, um auf diese Weise das dritte und letzte Inokulum zu bilden:

Fleischextrakt 15 g

Ammoniumsulfat 3 g

Kaliumdihydrogenphosphat 3 g

Calciumcarbonat 1 g

Magnesiumsulfat-heptahydrat 1,5 g

Glucose 10 g

Wasser auf 1000 ml

Die Glucose wird getrennt sterilisiert.

Das bei der dritten Stufe erhaltene Inokulum wird bei ι ο einer Geschwindigkeit von 0,4 bis 0,8 Liter steriler Luft pro Liter Brühe pro Minute belüftet, wobei man das Fermentationsgemisch durch einen Rührer mit einer Geschwindigkeit von 150 bis 300 Umdrehungen pro Minute durchmischt Die Temperatur wird auf 25 bis 29°C, gewöhnlich auf 28°C, gehalten. Man läßt das Ganze 48 bis 72 Stunden wachsen, worauf man mit dem auf diese Weise erhaltenen Inokulum einen 3000 Liter fassenden Fermentationstank beimpft.

Tankfermentation zur Herstellung von BM123/3 und BM123gamma

Für die Herstellung von BM 123)3 und BM123gamma in Tankfermentern verwendet man vorzugsweise das folgende Fermentationsmedium: r>

3(1

Die Glucose wird getrennt sterilisiert.

3Ί

Jeder Tank wird mit 5 bis 10% des bei der oben beschriebenen Herstellung des lnokulums in der dritten Herstellungsstufe erhaltenen lnokulums inokuliert. Der Ferrnentationsbrei wird auf einer Temperatur von 25 bis 28° C, gewöhnlich von 26° C, gehalten. Der Brei wird mit w steriler Luft in einer Geschwindigkeit von 0,3 bis 0,5 Liter sterile Luft pro Liter Brei pro Minute belüftet und durch einen Rührer mit einer Rührgeschwindigkeit von 70 bis 100 Umdrehungen pro Minute in Bewegung gehalten. Man läßt die Fermentation 65 bis 90 Stunden 4 > laufen, worauf man die Maische erntet.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel!

Herstellung des lnokulums für BM123/3 und BMl 23gamma

Unter Verwendung des folgenden typischen Nährmediums läßt man die erste und die zweite Stufe eines v> Inokmlums wachsen:

Fleischextrakt	30 g
Ammoniumsulfat	6g
Kaliumdihydrogenphosphat	6g
Calciumcarbonat	2g
Magnesiumsulfat-heptahydrat	3g
Glucose	20 g
Wasser auf	1000 ml

Bactotrypton
Hefeextrakt
Rinderextrakt
Glucose
Wasser auf

5g

5g

3g

10g

1000 ml

Zwei 500-ml-Kolben, die jeweils 100 ml des obigen sterilen Mediums enthalten, werden jeweils mit 5 ml eines gefrorenen vegetativen lnokulums von Nocardia sp. NRRL 8050 beimpft. Die Kolben werden dann auf einen Rotationsschüttler gegeben und über eine Zeitspanne von 48 Stunden bei einer Temperatur von 28° C kräftig geschüttelt Anschließend überträgt man das erhaltene Kolbeninokuium in einen 22,7 Liter fassenden Glasfermenter, der 12 Liter des obigen sterilen Mediums enthält Der Brei wird während des etwa 48stündigen Wachsens mit steriler Luft belüftet worauf man mit dem Fermenterinhalt einen 455 Liter fassenden Tankfermenter beimpft, der 300 Liter des folgenden sterilen flüssigen Mediums enthält:

Fleischextrakt	15g
Ammoniumsulfat	3g
Kaliumdihydrogenphosphat	3g
Calciumcarbonat	ig
Magnesiumsulfat-heptahydrat	1,5 g
Glucose	10g
Wasser auf	1000 ml

Die Glucose wird getrennt sterilisiert.

Der obige Jnokulumbrei der dritten Stufe wird mit steriler Luft belüftet, die man mit einer Geschwindigkeit von 0,4 Liter pro Liter Brei pro Minute in den Fermenter einbläst. Der Fermenterinhalt wird mit einem Rührer unter einer Rührgeschwindigkeit von 240 Umdrehungen pr · Minute durchmischt. Der Brei wird auf einer Temperatur von 28° C gehalten, wobei man als Entschäumungsmittel ein Specköl verwendet. Nach einer 48stündigen Wachstumszeit verwendet man die erhaltene Inokulummaische zur Beimpfung einer 3000-Liter-Fermentation.

Beispiel 2

Fermentation unter Verwendung von

Nocardia sp. NRRL 8050 und eines die Bildung von

BM123/3 und BM 123gamma begünstigenden Mediums

Aus folgenden Bestandteilen wird ein Fermentationsmedium hergestellt:

Fleischextrakt	30 g
Ammoniumsulfat	6g
Kaliumdihydrogenphosphat	6g
Calciumcarbonat	2g
Magnesiumsulfat-heptahydrat	3g
Glucose	20 g
Wasser auf	1000 ml

Die Glucose wird getrennt sterilisiert.

Das Fermentationsmedium wird bei einer Temperatur von 120°C mit Dampf von 1,41 kg/cm² 60 Minuten lang sterilisiert. Der pH-Wert des Mediums nach Sterilisation liegt bei 6,9. In einem 4000-Liter-Tankfermenter werden 3000 Liter steriles Medium mit 300 Liter des im Beispiel 1 beschriebenen lnokulums beimpft, worauf man das Ganze bei einer Temperatur von 26° C unter Verwendung von Specköl als Entschäumer fermentiert. Der Tank wird mit steriler Luft bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,35 Liter pro Liier Maische pro Minute belüftet. Die Maische wird durch ein Rührwerk in Bewegung gehalten, das mit einer Geschwindigkeit von 70 bis 72 Umdrehungen pro Minute angetrieben wird. Nach insgesamt 67 Stunden langer Fermentation wird die Maische geerntet.

Beispiel 3
Isolierung von BM123/3 und BM123garnma

3000 Liter einer wie im Beispiel 2 beschrieben hergestellten Ferrnentationsmaische tiii; s'w.sw.

pH-Wert von 4,3 werden mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und unter Verwendung von 5% Diatomeenerde als Filterhilfe filtriert. Der Filterkuchen wird mit etwa 100 Liter Wasser gewaschen und dann verworfen. Die vereinigten Filtrate und Waschlaugen werden von unten nach oben durch drei parallel angeordnete Säulen aus rostfreiem Stahl mit den Abmessungen 21 χ 122 cm geführt, von denen jede 15 Liter CM Sephadex® C-25 [Na⁺]-Harz (ein vernetztes Dextran-Epichlorhydrin-Kationenaustauschergel) enthält. Die beladenen Säulen werden mit insgesamt etwa 390 Liter Wasser gewaschen, worauf man sie zuerst mit 200 Liter lprozentigem wäßrigem Natriumchlorid und anschließend mit 560 Liter 5prozentigem wäßrigem Natriumchlorid entwickelt. Das 5prozentige wäßrige Natriumchlorideluat wird geklärt, indem man es durch Diatomeenerde filtriert, und das dabei erhaltene geklärte Filtrat leitet man anschließend durch eine Glassäule mit den Abmessungen 20,3 χ 152,5 cm, die 25 Liter granulatartige Aktivkohle (0.37 bis 0,83 mm lichte Maschenweite) enthält Die beladene Säule wird mit 120 Liter Wasser gewaschen und dann zuerst mit 120 Liter 15prozentigem wäßrigem Methanol, hierauf mit 340 Liter 50prozentigem wäßrigem Aceton entwickelt. Das 15prozentige wäßrige Methanoleluat wird im Vakuum auf etwa 7 Liter einer wäßrigen Phase konzentriert, worauf man ihren pH-Wert mit Amerlite® 1R-45 (OH-)-Harz (einem schwach basischen Polystyrol-Polyamin-Anionenaustauscherharz) von pH 4,5 auf pH 6,0 eingestellt. Das Harz wird dann durch Filtrieren jh abgetrennt, und durch Konzentrieren des Filtrats im Vakuum auf etwa 1 Liter und anschließendes Lyophilisieren erhält man 38 g Material, das vorwiegend aus BM123/? besteht, zusammen mit einer geringen Menge BM123gamma (vorwiegend BM123gamma2). Das js 50prozentige wäßrige Methanoleluat stellt man mit Amberlite® IR-45 (OH-)-Harz von pH 4,65 auf pH 6,0 ein. Anschließend wird das Harz durch Filtrieren abgetrennt, und durch Einengen des Filtrats im Vakuum auf etwa 6,3 Liter und anschließendes Lyophilisieren -to erhält man 213 g Material, das vorwiegend aus BM123gamma besteht. Das 50prozentige wäßrige Acetoneluat wird mit Amberlite® IR-45 (OH)-Harz von pH 4,0 auf pH 6,0 eingestellt. Durch Abfiltrieren des Harzes, anschließendes Konzentrieren des erhaltenen 4-, Filtrats im Vakuum auf etwa 1,5 Liter und nachfolgendes Lyophilisieren erhält man 56 g unreines BM123gamma.

Beispiel 4
Weitere Reinigung von BM123gamma ⁾⁰

Eine Aufschlämmung von CM Sephadex⁸ C-25 [NH4⁴] in 2prozentigem wäßrigem Ammoniumchlorid wird in eine Glassäule mit einem Durchmesser von 2,6 cm gegossen, bis man eine Harzhöhe von etwa 62 cm >ί hat. Der Überschuß an 2prozentigem wäßrigem Ammoniumchlorid wird abgeleitet. Hierauf löst man 5,0 g des nach Beispiel 3 hergestellten BM!23gamma in etwa 10 ml 2prozentigem wäßrigem Ammoniumchlorid und gibt das Ganze auf die Säule. Die Säule wird ω> anschließend mit einem Gradienten zwischen 6 Liter von jeweils 2prozentigem und 4prozentigem wäßrigem Ammoniumchlorid eluiert. AlIo 15 Minuten sammelt man automatisch Fraktionen von jeweils etwa 75 ml. Die Lag·: des Antibioticnms BM123gamma wird durch η5 ständige Untersuchung des Säulenabstroms im Ultraviolettlicht und durch Bioautographic getränkter Papier Sdiciücii tiui

i pu'.ucn. uie i'mi Klebsieila pneumoniae. Stamm AD, beimpft sind, überwacht Die Hauptmenge an BM123gamma kommt zwischen den Fraktionen 71 bis 107.

130 ml granulatartige Aktivkohle (037 bis 0,83 mm lichte Maschenweite) werden in Wasser suspendiert und in eine Glassäule gefüllt. Dort läßt man das Material absetzen und das überschüssige Wasser ablaufen. Die Fraktionen 84 bis 96 des obigen CM Sephadex-Chromatogramms werden vereinigt, und durch die mit Kohlegranulat gefüllte Säule geführt Die beladene Säule wird mit 600 ml Wasser gewaschen und dann m't 1 Liter 50prozentigem wäßrigem Aceton entwickelt Die Eluate, die beide BM123gamma enthalten, werden im Vakuum zu wäßrigen Phasen konzentriert und lyophilisiert, wodurch man insgesamt 886 mg BM123gamma als Hydrochloridsalz erhält. Zur Herstellung einer Probe für die Mikroanalyse wird das obige Material erneut dem oben angegebenen Verfahren unterzogen.

Das Antibioticum BM123gamma besitzt keinen ausgeprägten Schmelzpunkt, es begimt sich jedoch bei um 200⁰C allmählich zu zersetzen. Die Mikroanalyse einer Probe, die man vorher 24 Stunden bei einer Temperatur von 22,2° C und einer relativen Feuchtigkeit von 23% ins Gleichgewicht kommen läßt, führt zu folgenden Werten:C = 39,44%; H=6,10%; N = 16,19%; Cl (ionisch) = 11,54%. Der Gewichtsverlust beim Trocknen beträgt 8,19%. In Wasser zeigt BM123gamma ein UV-Absorptionsmaximum bei 286 nm mit einem Wert E \""„ = 250. Die Lage dieses Maximums ändert sich nicht mit dem pH-Wert. Das BM123gamma zeigt eine spezifische Drehung von [oi\f = +71° (C = 0,97 in Wasser).

Das Antibioticum BM123gamma zeigt im Infrarotbereich des Spektrums bei folgenden Wellenlängen eine charakteristische Absorption: 770, 830, 870, 930, 980, 1035, 1105, 1175,1225,1300, 1340, 1370, 1460, 1510,1555, 1605, 1660, 1740, 2950 und 3350 cm-¹. Ein übliches, mit einem KBr-Pellet hergestelltes Infrarotabsorptionsspektrum von BM123gamma geht aus der Fig. 1 hervor.

Beispiel 5
Isolierung von BM123gammai

Eine Aufschlämmung von CM Sephadex® C-25 [Na⁺] in 2prozentigem wäßrigem Natriumchlorid wird so in eine Glassäule mit einem Durchmesser von 2,6 cm gegossen, daß man eine Harzhöhe vor. etwa 70crrs erhält. Der Überschuß an 2prozentigem wäßrigem Natriumchlorid wird abgeleitet. Anschließend löst man 4,11g einer Probe, die vorwiegend BM123gammai zusammen mit etwas BM123gamrnaj und anderen Verunreinigungen enthiili und nach Beispiel 3 hergestellt worden ist, in etwa 10 ml 2prozentigcm wäßrigem Natriumchlorid und bringt das Ganze auf die Säule. Die Säule wird dann bei einem Gradienten zwischen 4 Liter mit jeweils 2prozent^;i!cm und 4prozentigem wäßrigem Natriumchlorid eluiert. Alle 15 Minuten sammelt man automatisch Fraktionen mit jeweils etwa 75 ml. Die Lage des Antibioticums BM123gamma wird durch ständige Überwachung des Säulenabstroms im Ultraviolettlicht und durch Bioauiogmphic getränkter Papierscheiben auf großen Agarplatten, die mit Klebsiella pneumoniae. Stamm AD. boimpft sind, überwacht und ermittelt. Der Hauptteil an BMI23gamma liegt zwischen den Fraktionen 64 und 90. Die Ärnflngsfi'äkiiOi'icii (04 — 80) Ci'iiuäiicii cm Gemisch aus

BM123gammai und BM123gamma2, und die letzten Fraktionen (81—90) enthalten praktisch reines BM123gammat.

100 ml granulatartige Aktivkohle (0,37 bis 0,83 mm lichte Maschenweite) werden in Wasser suspendiert und in eine Glassäule gefüllt In dieser läßt man die Suspension absetzen und das überschüssige Wasser ablaufen. Die Fraktionen 81—90 des obigen CM Sephadex^e-Chromatogramms werden vereinigt und durch die mit ICohlegranulat gefüllte Säule geschickt Die beladene Säule wird mit 500 ml Wasser gewaschen und dann zuerst mit 500 ml lOprozentigern wäßrigem Methanol und anschließend mit 1 Liter 50prozentigem wäßrigem Methanol entwickelt. Das 50prozentige wäßrige Methanoleluat, das die Hauptmenge an BM123gammsi enthält, wird mit Amberlite® IR-45 (OH-')-Harz auf pH 5,9 bis 6,0 eingestellt. Im Anschluß daran trennt man das Harz durch Filtrieren ab, konzentriert das Filirat im Vakuum auf eine wäßrige Phase und lyophylisiert dieses Filtrat, wodurch man 294 mg weißes amorphes BM123gammai in Form des Hydrochloridsalzes erhält.

Das Antibioticum BM123gammai besitzt keinen definierten Schmelzpunkt, es zersetzt sich jedoch allmählich bei einer Temperatur um 200° C. Die Mikroanalyse einer Probe, die man vorher 24 Stunden bei einer Temperatur von 21,1⁰C und einer relativen Feuchtigkeit von 60% ins Gleichgewicht kommen läßt, ergibt folgende Werte: C = 37,84°/o; H =5,73%; N = 15,58; Cl (ionisch) = 10,01%. Der Gewichtsverlust beim Trocknen beträgt 10,45%. In Methanol zeigt BM123gammai ein UV-Absorptionsmaximum bei 286 nm mit einem Wert E\";_m = 225. Die Lage dieses Maximums ändert sich nicht mit dem pH-Wert Das BM123gamma! zeigt eine spezifische Drehung von + 55° (c = 0,803 in Wasser).

Das Antibioticum BM 123gammai zeigt im Infrarotbereich des Spektrums bei folgenden Wellenlängen eine charakteristische Absorption: 770, 830, 870, 930, 980, 1045,1080,1110,1125,1175,1225,1305,1345,1380,1465, 1515, 1560, 1605, 1660, 1730, 2950 und 3350 cm-¹. Aus der Fig.2 geht ein übliches Infrarotabsorptionsspektrum von BM123gammai in einem KBr-Pellet hervor. Der Fig.4 ist ein übliches magnetisches Protonenresonanzspektrum von BM123gammai zu entnehmen, das an einer D₂O-Lösung in einem Spektrometer mit 100 Megazyklen bestimmt worden ist.

B e i s ρ i e i 6
Isolierung von BM123gamma2

50

25 g einer nach Beispiel 3 hergestellten Probe, die vorwiegend BM123gamma2 und BM1230 enthält, werden in etwa 120 ml 2prozentigem wäßrigem Natriumchlorid gelöst und dann in Form dieser Lösung auf eine Säule gegeben, die mit 1800 ml CM Sephadex® C-25 [Na⁺] in 2prozentigem wäßrigem Natriumchlorid gefüllt ist. Die Säule wird anschließend unter einem Gradienten zwischen 20 Liter von jeweils 2prozentigo.Ti und 4prozentigem wäßrigem Natriumchlorid eluiert bo Die ersten 12 Liter Eluat werden in einem großen Kolben aufgefangen und verworfen. Im Anschluß daran sammelt man alle 40 Minuten automatisch Fraktionen von jeweils etwa 800 ml. Die Lage des Antibioticums BM123gamma wird durch ständige Untersuchung der von der Säule kommenden Fraktionen im Ultraviolettlicht ermittelt Die Hauptmenge an BM123gamma liegt zwischen den Fraktionen 7 — 18. Die Anlangsfraktionen (7—15) enthalten praktisch reines BM123gamma2- Die Endfraktionen (16—18) enthalten ein Gemisch aus BM123gammai und BM123gamma2.

600 ml granulatartige Aktivkohle (0,37 bis 0,83 mm lichte Maschenweite) werden in Wasser suspendiert und dann in eine Glassäule gefüllt Hierin läßt man die Suspension absetzen und überschüssiges Wasser ablaufen. Die Fraktionen 7 — 15 aus dem obigen CM Sephadex^-Chromatogramm werden vereinigt und durch die mit Kohlegranulat gefüllte Säule geschickt Die beladene Säule wird mit 3 Liter Wasser gewaschen, worauf man sie zunächst mit 3 Liter lCprozentigem wäßrigem Methanol und dann mit 6 Liter 50prozentigem wäßrigem Methanol entwickelt. Das dabei enthaltene lOprozentige wäßrige Methanoleluat wird mit Amberlite® IR 45 yOH-)-Harz auf pH 5,8 bis 6,0 eingestellt. Das Harz wird anschließend durch Filtrieren abgetrennt Durch Einengen des Filtrats im Vakuum zu einer wäßrigen Phase und Lyophylisieren erhält man 595 mg weißes amorphes BM123gamma₂ in Form des Hydrochloridsalzes. Das 50prozentige wäßrige Methanoleluat stellt man mit Amberlite® IR 45 (OH-)-Harz von pH 4,6 auf 6,1 ein. Anschließend wird das Harz entfernt. Durch Einengen des Filtrats im Vakuum zu einer wäßrigen Phase und anschließendes Lyophylisieren erhält man 3,645 g an etwas weniger reinem weißem amorphem BM123gamma2 in Form des Hydrochloridsalzes.

Das Antibioticum BM123gamma2 besitzt keinen ausgeprägten Schmelzpunkt, zersetzt sich jedoch bei um 200°C allmählich. Die Mikroanalyse einer Probe, die man vorher 24 Stunden bei einer Temperatur von 21,1° C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60% ins Gleichgewicht kommen läßt, ergibt folgende Werte: C = 36,14%: H = 5,67%: N = 15,l%; Cl (ionisch) = 11,11%. Der Gewichtsverlust beim Trocknen beträgt 10,87%. In Methanol zeigt BM123gamma₂ ein UV-Absorptionsmaximum bei 286 nm mit einem Wert E \ ","„ = 220. Die Lage dieses Maximums ändert sich nicht mit dem pH-Wert. Das BM123gamma2 zeigt eine spezifische Drehung von +60° (c = 0,851 in Wasser).

Das Antibioticum BM123gamma2 weist im Infrarotbereich des Spektrums bei folgenden Wellenlängen eine charakteristische Absorption auf: 770, 830, 870, 950, 1035, 1110, 1175, 1225,1285, 1345,1380,1470, 1515, 1560, 1605, 1660, 1755, 2950 und 3350cm-'. Aus der Fig.3 geht ein übliches Infrarotabsorptionsspektrum von BM123gamma2 in einem KBr-Pellet hervor. Die F i g. 5 zeigt ein übliches magnetisches Protonenresonanzspektrum von BM123gamma2, bestimmt an einer D2O-Lösung in einem Spektrometer mit 100 Megazyklen.

Beispiel 7

Papierverteilungs- und Dünnschichtchromatographie
von BM123/3 und BM123gamma

Die Antibiotica BM123 lassen sich papierchromatographisch voneinander unterscheiden. Zu diesem Zweck bringt man auf Papierstreifen Tupfer von Wasser- oder Methanollösungen der jeweiligen Substanzen und äquilibriert das Ganze 1 bis 2 Stunden in Gegenwart von sowohl der oberen als auch der unteren Phase. Die Streifen werden dann über Nacht mit der unteren (organischen) Phase entwickelt, die ein Gemisch von 90prozentigem Phenol zu m-Cresol zu Essigsäure zu Pyridin zu Wasser (100:25:4:4:75, auf Volumen bezogen) ist. Die entwickelten Streifen werden aus der Chromatographenkammer entnommen, i bis 2 Stunden

an der Luft getrocknet, zur Entfernung von restlichem Phenol mit Äther gewaschen und auf großen Agarplatten, die mit Klebsiella pneumoniae. Stamm AD, beimpft sind, bioautographiert Die dabei erhaltenen typischen Ri-Werte gehen aus der folgenden Tabelle VlI hervor:

Tabelle Il	Rf-Wert
Komponente	0,85 0,50, 0,70
BM123gamma BM1230

Die />-Komponente ist ein Gemisch der beiden Anibiotica unter Verwendung dieses Systems. Das BM1230 setzt sich aus einer größeren Menge eines Antibioticums (Rf=0,50) mit der Bezeichnng BM12301 und einer kleineren Menge eines Antibioticums (R[ = 0,70) mit der Bezeichnung BM12302 zusammen.

Die Antibiotica BM123 lassen sich ferner auch durch Dünnschichtchromatographie voneinander unterscheiden. Zu diesem Zweck bringt man entsprechende Tupfer einer Wasserlösung der jeweils zu chromatographierenden Substanz (etwa 20 bis 40 Mikrogramm pro Tupfer) auf vorbeschichtete Cellulose F®-Platten (0,10 Millimeter stark) auf. Die Platten werden dann über Nacht mit einem Lösungsmittel entwickelt, das man durch Vermischen von 1-Butanol zu Wasser zu Pyridin zu Essigsäure (15:12:10:1, auf Volumen bezogen) erhält. Die entwickelten Platten werden anschließend aus der Chromatographenkammer entnommen und etwa eine Stunde an der Luft getrocknet. Die Detektion der Antibiotica erfolgt entweder unter Verwendung üblicher Ninhydrip.reagsnziep. oder unter Einsatz eines Sakaguchi-Sprühreagens. Die dabei erhaltenen typischen Rf-Werte gehen aus der folgenden Tabelle VIII hervor:

Tabelle III	Rf-Wert
Komponente	0,17,0,23 0,08,0,14
BM123gamma BM1230

auf etwa 7,0 gehalten. Die Reaktion wird bis zum Verschwinden von Bh/I123gamma dünnschichtchromatographisch überwacnt Das Reaktionsgemisch wird anschließend filtriert, worauf man das Filtrat zur Trockne eindampft. Der Rückstand wird mit 3 ml Methanol behandelt, worauf man das Ganze filtriert. Das Filtrat wird mit 50 ml Aceton verdünnt und der sich dabei bildende Niederschlag wird durch Filtrieren abgetrennt und dann getrocknet Das als Lösungsmittel verwendete Methanol läßt sich auch durch 20 ml Wasser ersetzen, sofern die als Ausgangsmaterialien verwendeten Ketone in Wasser löslich sind.

Beide Antibiotica BM1230 und BM123gamma sind unter Verwendung dieses Systems Gemische aus zwei Bestandteilen. Das BM1230 setzt sich aus einer größeren Menge einer Komponente (Rf=0,08), die als BM1230I bezeichnet wird, und einer kleineren Menge einer Komponente (R[=0,14), die als BM1230^ bezeichnet wird, zusammen. Die weniger polare Komponente von BM123gamma (Rf=0,23) ist BM123gammai, und die stärker polare Komponente [Rf=OM) ist das BM123gamma₂.

Beispiel 8

Allgemeines Verfahren für die reduktive
Alkylierung des Antibioticums BM123gamma

Eine Suspension von 100 mg Antibioticum BM123gamma in 20 ml Methanol wird unter Rühren mit 5 ml (oder 5 g) des jeweiligen Ketons und 100 mg Natriumcyanoborhydrid versetzt. Der pH-Wert der erhaltenen Lösung wird über eine Zeitspanne von 3 bis 24 Stunden mit O.i η meihanoiischem Chl"

Beispiel 9 Herstellung von Isopropyl-BM 123gamma

Eine Lösung von 200 mg BM123gamma in 30 ml Methanol wird mit 5 ml Aceton versetzt. Anschließend versetzt man diese Lösung mit 139 mg Natriumcyanoborhydrid und rührt das Reaktionsgemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert des Reaktionsgemisches durch Zugabe von 0,1 η methanolischem Chlorwasserstoff auf 7,4 bis 7,8. Die dabei anfallende geringe Menge Niederschlag wird durch Filtrieren abgetrennt, und das Filtrat dampft man dann im Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand wird mit 2 ml Methanol behandelt, worauf man das Ganze filtriert. Das Filtrat wird mit 100 ml Aceton verdünnt, und der dabei erhaltene Feststoff wird durch Filtrieren abgetrennt und getrocknet. Die Ausbeute beträgt 184 mg.

Die obige Verbindung hat einen LDso-Wert von über 1000 mg/kg Körpergewicht (einzelne orale Dosis, männliche und weibliche Albinoratien, Maus).

Beispiel IO Herstellung von l,3,3-TrimethyIbutyl-BM123gamma

Eine Lösung von 200 mg BM^Sgamma-Hydrochlorid in 50 ml Methanol wird mit 3 ml 4,4-Dimethyl-2-pentanon und 106 mg Natriumcyanoborhydrid versetzt. Die Reaktionslösung hält man durch tropfenweise Zugabe von methanolischem Chlorwasserstoff auf pH 7. Das Reaktionsgemisch wird 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann filtriert Das Filtrat wird im Vakuum zur Trockne eingedampft- Der Rückstand wird in 3 ml Methanol gelöst, worauf man die Lösung mit 50 ml Aceton verdünnt und filtriert Die Ausbeute beträgt 125 mg.

B e i s ρ i e! 11 Herstellung von l-Methylphenyläthyl-BM123gamma

Eine Lösung von 200 mg BM123gamma in 50 ml Methanol wird mit 5 ml Phenylaceton versetzt. Anschließend versetzt man die Lösung mit 170 mg Natriumcyanoborhydrid und rührt das Reaktionsgemisch 3,5 Stunden bei Raumtemperatur. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert des Reaktionsgemisches durch Zugabe von mit Chlorwasserstoffgas gefügtem Methanol bei 7,0. Das Reaktionsgemisch wird dann auf ein Volumen von etwa 5 ml eingeengt, mit 2 ml Methanol verdünnt und filtriert. Das Filtrat wird anschließend in 100 ml Aceton gegossen, worauf man den erhaltenen Feststoff durch Filtrieren abtrennt und U'oeknet Die Ausbeute beträgt 233 mg.

Beispiel 12

Herstellung von 1 -Methylnony 1- BM123gamma

Natriumcyanoborhydrid (100 mg) wird zu einer Lösung von BM123gamma (200 mg) und 2-Decanon (1 ml) in 40 ml Methanol gegeben. Der pH-Wert der Lösung wird durch Zugabe von 0,1 η methanolischem Chlorwasserstoffgas auf 7,0 eingestellt und durch bedarfsweise weitere Zugabe dieser Säure auf einen Wert von 7,0 ±0,2 gehalten. Nach 19,5 Stunden langer Umsetzung filtriert man das Reaktionsgemisch und engt das Filtrat im Vakuum bei 30⁰C ein. Der dabei erhaltene Rückstand wird in 5 ml Methanol aufgeschlämmt, worauf man das Ganze filtriert. Das Filtrat wird zu 50 m! Aceton gegeben. Der dabei ausfallende weißliche Niederschlag wird durch Filtrieren abgetrennt, mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an rohem l-Methylnonyl-BM123gamma beträgt 167 mg.

Beispiel 13
Herstellung von l,3-Dimethylbutyl-BM123gamma

Eine Lösung von 210 mg BM123gamma in 50 ml Methanol wird mit 5 ml Methylisobutylketon versetzt. Anschließend wird diese Lösung mit 166 mg Natriumcyanoborhydrid versetzt und das Reaktionsgemisch 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert des Reaktionsgemisches mit mit Chlorwasserstoffgas gesättigtem Methanol auf 7,0. Das Reaktionsgemisch wird dann im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit 2 ml Methanol behandelt, worauf man das Ganze filtriert. Das Filtrat wird mit 100 ml Aceton verdünnt, worauf man den abgeschiedenen Feststoff durch Filtrieren abtrennt und trocknet. Die Ausbeute beträgt 210 mg.

Beispiel 14
Herstellung von 2-NorbornyI-BM'i23gamma

Natriumcyanoborhydrid (100 mg) wird zu einer Lösung von BM123gamma (200 mg) und 2-Norbornanon (400 mg) in 40 m! Methanol gegeben. Der pH-Wert der Lösung wird mit 0,1 η methanolischem Chlorwasserstoff auf 7,0 eingestellt Durch bedarfsweise Zugabe von 0,1 π Chlorwasserstoff hält man den pH-Wert bei 7,0+0,2. Nach 214 Stunden langer Umsetzung wird das Reaktionsgemisch filtriert und das Filtrat im Vakuum bei 35° C eingeengt Der Rückstand wird in 5 ml Methanol aufgeschlämmt, worauf man das Ganze filtriert Das Filtrat wird zu 50 ml Aceton gegeben. Der dabei ausfallende weißliche Feststoff wird durch Filtrieren gesammelt, mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet Die Ausbeute an rohem 2-Norbornyl-BM123gamma beträgt 175 mg.

Beispiel 15
Herstellung von Isopropyl-BM123gammai

Ein Gemisch aus BM123gammai, 5 ml Aceton und 60 mg Natriumcyanoborhydrid in 35 ml Methanol wird 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt Den pH-Wert der Lösung hält man durch tropfenweise Zugabe von methanolischer Chlorwasserstofflösung bei einem Wert von 7. Das Gemisch wird dann im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit 5 ml Methano behandelt, worauf man die erhaltene Lösung mit 50 m Aceton verdünnt. Der dabei erhaltene Niederschlag j wird filtriert, gewaschen und im Vakuum getrocknet Die Ausbeute beträgt 49 mg.

Beispiel 16
Herstellung von Isopropyl-BM123gamma2

Ein Gemisch aus 41 mg BM123gamma2. 5 ml Acetor und 50 mg Natriumcyanoborhydrid in 35 ml Methano wird 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dei pH-Wert der Lösung wird durch tropfenweise Zugabe einer methanolischen Chlorwasserstofflösung (gesät tigt) bei einem Wert von 7 gehalten. Das dabei erhaltene Gemisch wird filtriert und dann im Vakuum zur Trocknt eingedampft. Der Rückstand wird mit 5 ml Methano behandelt, worauf man die erhaltene Lösung mit 50 m Aceton verdünnt. Hierbei erhält man 46 mg Produkt.

Beispiel 17

Herstellung von

l-Methyl-2-phenyläthyl-BM123gamma₂

Ein Gemisch aus 200 mg BM123gamma2, 5 m Phenylaceton und 170 mg Natriumcyanoborhydrid ir

ίο 50 ml Methanol wird 3,75 Stunden bei Raumtemperatui ' gerührt. Während dieser Zeit hält man den ρ H-Wert de: Reaktionsgemisches durch tropfenweisen Zusatz einei methanolischen Chlorwasserstofflösung (gesättigt) au: einem Wert von 7. Das Gemisch wird dann im Vakuurr

r. zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit 5 m Methanol behandelt, und die dabei erhaltene Methanol lösung verdünnt man dann mit etwa 50 ml Aceton. Au diese Weise erhält man 233 mg Produkt.

4» Beispie! 18

Herstellung von 2-Äthylcyclopentyl-BMI ?3gamma

Eine Lösung von 200 mg BM123gamma, 3 m 2-Äthylcyclopentanon und 101 mg Natriumcyanoborhy

4i drid in 50 ml Methylalkohol beläßt man 18 Stunden be Raumtemperatur. Während dieser Zeit wird de: pH-Wert der Lösung durch Zugabe einer gesättigter Lösung von Natriumchlorid in Methanol auf einen Wert von 7 gehalten. Das Reaktionsgemisch wird dam

so zur Trockne eingedampft Der Rückstand wird mit 3 m Methanol behandelt, worauf man das Ganze filtriert unc das Filtrat mit 40 ml Aceton verdünnt. Hierbei erhäl man 157 mg Produkt

Beispiel 19
Herstellung von 3,5-Dimethylcyclohexyl-BM 123gammi

Eine Lösung von 200 mg BM123gamma, 5 m S.S-Dimethylcyclohexanon und 200 mg Natriumcyano borhydrid in 50 ml Methanol wird eine Stunde be Raumtemperatur belassen. Während dieser Zeit hai man den pH-Wert der Lösung durch Zugabe eine gesättigten Lösung von Natriumchlorid in Methanol be einem Wert von 7. Das Reaktionsgemisch wird dann mi 3 ml Methanol behandelt und abfiltriert, worauf man da Filtrat mit 40 ml Aceton verdünnt Hierbei erhält mai 200 mg Produkt

Beispiel 20

Herstellung von
2.4-DimethyIcyclopentyl-BM123gamma

Eine Lösung von 206 mg BM123gamma, 3 ml 2,4-Dimethylcyclopentanon und 104 mg Natriumcyanoborhydrid in 50 ml Methanol wird 6 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert der Lösung durch Zugabe einer gesättigten Lösung von Natriumchlorid in Methanol auf ι ο einem Wert von 7. Das Reaktionsgemisch wird dann mit 3 ml Methanol behandelt und abfiltriert, worauf man das Filtrat mit 40 ml Aceton verdünnt. Die Ausbeute an gewünschtem Produkt beträgt 101 mg.

r> Beispiel 21

Herstellung von
2-Äthylcyclohexyl-BM123gamma

Eine Lösung von 200 mg BM123gamma, 5 ml 2-Äthylcyclohexanon und 213 mg Natriumcyanoborhydrid in 50 ml Methanol wird 3 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert der Lösung durch Zugabe einer gesättigten Lösung von Natriumchlorid in Methanol auf 7. Das Reaktionsgemisch wird dann mit 3 ml Methanol behandelt und filtriert, worauf man das Filtrat mit 40 ml Aceton verdünnt. Hierbei erhält man die Titelverbindung in einer Ausbeute von 200 mg.

Beispiel 22

Herstellung von
2,4,4-Trimethylcyclopentyl-BM123gamma

Eine Lösung von 200 mg BM123gamma, 5 ml 2,4,4-Trimethy!cyclopentanon und 179 mg Natriumcyanoborhydrid in 50 ml Methanol wird 24 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert der Lösung durch Zugabe einer gesättigten Lösung von Natriumchlorid in Methanol auf 7. Das Reaktionsgemisch wird dann mit 3 ml Methanol behandelt und filtriert, worauf man das Filtrat mit 40 ml Aceton verdünnt. Hierbei erhält man die gewünschte Verbindung in einer Ausbeute von 176 mg.

Beispiel 23

Herstellung von
2-Methylcyclopentyl-BM123gamma

Eine Lösung von 211mg BM123gamma, 3 ml 2-Methylcyclopentanon und 98 mg Natriumcyanoborhydrid in 50 ml Methanol wird 3,5 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert der Lösung durch Zugabe einer gesättigten Lösung von Natriumchlorid in Methanol auf 7. Das Reaktionsgemisch wird dann mit 3 ml Methanol behandelt und filtriert, worauf man das Filtrat mit 40 ml Aceton verdünnt. Hierbei erhält man die Titelverbindung in einer Ausbeute von 157 mg.

Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche:

1. An der Spermidin-Seitenkette N-terminal substituierte Derivate von Antibioticum BM 123gamma der allgemeinen Formel

H O

in der bedeuten:

R¹ einen Rest der Formel

NH₂

oder

R2 Ci-WsC₃-AIkVl, R3 Ci-bisCe-Alkyl, n-Nonyl,

n-Dodecyl,

1,3-Dimethylhexyl, 2-fviethyi-propenyi,

Buten-3-yi,

4-Methylpenten-3-yl, Styryl,

Äthinyl,

Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl,

Cyclohexylmethyl, Cyclopenten-2-ylmethyl, 5-Norbornen-2-yl, Benzyl,

2-Methoxybenzyl, 3-Methoxybenzyl, 3,4-Dimethoxy-benzy], 2-Chlorbenzyl, 3-Chlorbenzyl, 4-Chlorbenzyl, j3-Phenyläthyl, 1-Hydroxyäthyl,

NH—(CH₂)₃ — NH—(CH₂U—NH—CH

J -Methyl-) -hydroxy-äthyl, l-Methyl-2-hydroxy-äthyl, 3-Hydroxypropyl, M sthoxymethy 1, Phenoxymethyl, Dimethoxymethyl, 2,2-Dimethoxyäthyl, 2-Methoxyvinyl, 2-Chloräthyl, 3-Chlorpropyl, N,N-Dimethylaminomethyl, N,N-Dipropylaminomethyl, 2-(N,N-Diäthylamino)-äthyl, 3-(N,N-Diäthylamino)-propyl, 3-Pyridyl,

/3-Indolylmethyl, 1 - Acetamidoäthyl, Acetonyl,

Carbäthoxymethyl, 1 -Carbäthoxyäthyl, Carbäthoxy-chlormethyl, [N-(terL-Butyl)-carbamoyl]-methyl,

R² und R³ zusammen mit der Methylidingruppe

Cyclobutyl,
Cyclopentyl, 2,4-Dimethylcyclopentyl, 2,4,4-Trimethylcyclopentyl, Cyclohexyl,

3,5-Dimethylcyclohexyl, so Cycloheptyl,

Cyclooctyl,

Cyclononyl,

2,2,4,4-TetramethyIcyclopentyl, 2-Cyclopentyl-cyclopentyl, 3-(tert.-Pentyl)-cyclopentyl, 2-(l -Cyclohexenyl)-cyclonexyl, 2-Cyclohexylcyclohexyl,

2-Äthyl-cyclohexyl,

4-Tetrahydrothiopyranyl, bo 2-Äthylcyclopentyl,

S-Methyl-ö-isopropylcyclohexyl, S.S-Dimethylcyclohexen-S-yl, 2-Phenylcyclohexyl,

2-Cyclohexenyl, b5 4-(tert.-Butyl)-cyclohexyl,

2-Äthylidencyclohexyl, Decahydro-1-methyl-2-naphthyl, Decaiiydru-3-inethyl-2-riaphthyi,

1 -Benzyl-4-piperidyl,

1 -Methyl-4-piperidyl,

Bicyclo-[3.2.1]-octan-2-yl,

3-Chinuclidinyl,

5-Methoxy-2-tetralyl,

2-AdamantyI oder

2-Norbonyl