CH626895A5 - Process for the preparation of alkyl derivatives of the antibiotics BM 123 - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer neuen Gruppe von Antibiotica mit starker antibakteriel-ler Wirkung, die man erhält, indem man das Antibioticum BM 123 gamma 1, gamma 2 oder deren Gemische mit einem Aldehyd oder einem Keton der Formel:

Ri-CHO oder R2-C-R3 worin

Ri für Wasserstoff, Niederalkyl, halogensubstituiertes Niederalkyl, Niederalkenyl, Phenyl, monosubstituiertes Phenyl, Phe-nylniederalkyl,Styryl, 2-Furyl, methylsubstituiertes 2-Furyl, 2-Thienyl, Methylsubstituiertes 2-Thienyl, 2-Pyrryl, methylsubstituiertes 2-Pyrryl, 2-Pyridyl oder 2-Chinolyl steht, R2 Niederalkyl bedeutet und

R3 für Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, N,N-Dipropyl-aminomethyl, 2-Chloräthyl, Benzyl, Styryl, Cyclohexyl, 4-Methylpenten-3-yl, 1,3-Dimethylhexyl, ß-Indolylmethyl, Cyclopenten-2-ylmethyl, n-Heptyl, n-Octyl, (o-Tolylcarba-moyl)-methyl, Propenyl, Methoxymethyl, Cyclohexylmethyl, 2-(4-hydroxyphenyl)äthyl, n-Nonyl, n-Dodecyl, 2-Methoxyvi-nyl, l-Methyl-2-hydroxyäthyl, 3,4-DimethoxybenzyI, N,N-Diäthylaminoäthyl, Carbäthoxychlormethyl, 1-MethyI-l-hydroxyäthyl, 4-Chlorbenzyl, (t-Butylcarbamoyl)methyl, Dimethoxymethyl, 2-, 3- oder 4-Methoxybenzyl, Phenoxyme-thyl, Äthinyl, N,N-Di-methylaminomethyl, N,N-Diäthylami-nopropyl, Cyclopropyl, 2,2-Dimethoxyäthyl, Acetonyl, ß-Phenyläthyl, 3-Chlorpropyl, 2-Chlorbenzyl, 3-Chlorb.enzyl, Buten-3-yl, 1-Acetamido-äthyl, 3-Pyridyl, Carbäthoxymethyl, 5-Norbornen-2-yl, Cyclopentyl, 1-Cärbäthoxyäthyl, 1-Hydro-xyäthyl, 3-Hydroxypropyl, Chlormethyl, Isobut-2-enyl, Phenyl, m-Chlorphenyl, p-Bromphenyl, p-Trifluormethylphenyl, m-Nitrophenyl oder p-Dimethylaminophenyl, oder R2 und R3 zusammen mit der Methylidingruppe Cyclobutyl, Cyclopentyl, Monomethylcyclopentyl, 2,4-Dimethylcyclopen-tyl, 2,4,4- oder 1,3,3-Trimethylcyclopentyl, Cyclohexyl, 3-Methylcyclohexyl, 3,5-Dimethylcyclohexyl, Cycloheptyl, Cyclooctyl, Cyclononyl, 2,2,4,4-Tetramethylcyclopentyl, 2-Cyclopentylcyclopentyl, 3-tert.Pentylcyclopentyl, 2-(l-Cyclo-hexen)cyclohexyl, 2-Cyclohexylcyclohexyl, 2-Äthyl-cyclohexyl, 2-Propylcyclohexyl, 4-Tetrahydrothiopyranyl, 2-Äthylcyclo-pentyl, 3-Methyl-6-isopropyl-cyclohexyl, 3,3-Dimethylcyclo-hexen-4-yl, 2-Phenyl-cyclohexyl, 2-Cyclohexenyl, 4-t.-Butyl-cyclohexyl, 2-Äthylidencyclohexyl, Decahydro-l-methyl-2-naphthyl, Decahydro-3-methyI-2-naphthyl, l-Benzyl-4-piperi-dyl, l-Methyl-4-piperidyl, Bicyclo[3.2.1]octan-2-yl, 3-Chinucli-dinyl, 5-Methoxy-2-tetralyl, 2-Adamantyl oder 2-Norbornyl bedeuten,

reduktiv alkyliert,wobei mit Aldehyden je nach Menge der Reagenzien die endständige Aminogruppe einfach oder zweifach und die dieser proximal stehende sekundäre Aminogruppe nicht oder auch alkyliert wird und mit Ketonen die endständige Aminogruppe einfach alkyliert wird.

Geeignete Niederalkylgruppen (Ri, R2 und R3) oder halo-s gensubstituierte Niederalkylgruppen (Ri) sind solche mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, worin Halogen in der Regel für Chlor, Brom oder Jod steht, wie Methyl, Äthyl, Isopropyl, sek.-Butyl, n-Amyl, Dichlormethyl, 2-Bromäthyl, 2,3-Dijodpropyl oder gamma-Chlorpropyl. Als Niederalkenylgruppen (Ri) kommen 10 beispielsweise solche mit bis zu vier Kohlenstoffatomen in Frage, wie Vinyl, Allyl, Propenyl, Isopropenyl, 1-Butenyl, 2-Butenyl, 3-Butenyl oder Isobutenyl. Als monosubstituierte Phenylgruppen (Ri) kommen beispielsweise p-Acetamidophe-nyl, m-Nitrophenyl, m-Mercaptophenyl, o-Anisyl, p-Anisyl, 0-is Tolyl oder p-Tolyl in Frage. Geeignete Phenylniederalkylgrup-pen (Ri) sind beispielsweise Benzyl, a-Phenyläthyl oder ß-Phenyläthyl, Geeignete methylsubstituierte 2-Furyl-, 2-Thie-nyl- oder 2-Pyrrylreste sind beispielsweise 5-Methyl-2-furyl, 3,4-Dimethyl-2-furyl, 4-Methyl-2-thienyl, 3,5-Dimethyl-2-20 thienyl, 5-Methyl-2-pyrryl oder l,3,4-Trimethyl-2-pyrryl.

Die reduktive Alkylierung, durch die man die neuen antibakteriellen Verbindungen herstellt, wird vorzugsweise wie folgt durchgeführt. Man löst ein Antibioticum BM123gamma, BM123gammai oder BM123gamma2 in einem geeigneten jts Lösungsmittel, wie Wasser, Methanol, Methylcellosolve oder Gemischen hieraus, versetzt die dabei erhaltene Lösung mit einer gegenüber einer äquimolaren Menge überschüssigen Menge des jeweils gewünschten Aldehyds oder Ketons und gibt im Anschluss daran eine zur Reduktion ausreichende 30 Menge an Natriumcyanoborhydrid zu. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird während der Umsetzung mit verdünnter Mineralsäure auf 6,0 bis 8,0 gehalten. Nach 1- bis 24-stündiger Umsetzimg bei Raumtemperatur (10 bis 35°C) dampft man das Reaktionsgemisch im Vakuum zur Trockne 35 ein, behandelt den Rückstand mit Methanol und filtriert das Ganze. Das Filtrat wird mit Aceton verdünnt, und der dabei ausfallende Feststoff wird durch Filtrieren entfernt und im Vakuum getrocknet.

Aldehyde, die sich bei obigem Verfahren verwenden lassen. 40 sind beispielsweise Acetaldehyd, Propionaldehyd, Butyralde-hyd, Isobutyraldehyd, Crotonaldehyd, Valeraldehyd, Benzaldehyd, p-Cyanobenzaldehyd, Salicylaldehyd, Zimtaldehyd oder Trichloracetaldehyd. Zu Ketonen, die bei obigem Verfahren verwendet werden können, gehören beispielsweise Aceton. 45 2-Butanon, Chloraceton, Acetophenon, m-Chloracetophenon. p-Bromacetophehori,' p-Trifluormethylacetophenon, m-Nitro-acetophenon oder p-Dimethylaminoacetophenon.

Aus den bei der reduktiven Alkylierung anfallenden Reaktionsgemischen lassen sich die gewünschten Produkte durch 50 übliche Verfahren gewinnen, wie Ausfällung, Konzentrierung, Lösungsmittelextraktion oder Kombinationen hieraus. Nach erfolgter Isolierung kann man diese Produkte durch irgendeines der allgemein bekannten Reinigungsverfahren reinigen. Solche Reinigungsverfahren bestehen beispielsweise in einer 55 Umkristallisation aus verschiedenen Lösungsmitteln und Lösungsmittelgemischen, chromatographischen Techniken oder Gegenstromverteilung, und diese Verfahren können gewöhnlich alle für diesen Zweck verwendet werden.

Die neuen antibakteriellen Verbindungen sind organische 60 Basen und können daher mit einer Reihe organischer oder anorganischer salzbildender Verbindungen Säureadditionssalze bilden. Die Herstellung solcher Salze erfolgt durch Vermischen der freien Base des jeweiligen antibakteriellen Mittels mit bis zu 3 Äquivalent einer Säure, zweckmässigerweise in einem 65 neutralen Lösungsmittel. Für die Salzbildung geeignete Säuren sind beispielsweise Schwefelsäure, Phosphorsäure, Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Sulfaminsäure, Zitronensäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Essigsäure, Ben

5

626895

zoesäure, Gluconsäure oder Ascorbinsäure. Die Säureadditionssalze der Verfahrensprodukte sind im allgemeinen kristalline Feststoffe, die sich im allgemeinen im Wasser, Methanol oder Äthanol verhältnismässig gut lösen, in nichtpolaren organischen Lösungsmitteln, wie Diäthyläther, Benzol oder Toluol, jedoch verhältnismässig unlöslich sind. Die freien Basen der antibakteriellen Mittel sind als äquivalent zu ihren nichttoxischen Säureadditionssalzen anzusehen.

Die Antibiotica mit den Bezeichnungen BM123ßi,

BM123ß2, BM123gammai und BM123gamma2 entstehen während der Züchtung eines neuen Stammes einer undetermi-nierten Species von Nocardia unter kontrollierten Bedingungen. Dieser neue Antibioticum produzierende Stamm wurde aus einer Probe Gartenerde isoliert, die bei Oceola, Iowa, gefunden wurde, und wird in der Kultursammlung der Lederle Laboratories Division, American Cyanamid Company, Pearl River, New York, als Kultur No. BM123 aufbewahrt. Eine lebende Kultur des neuen Mikroorganismus wurde bei Northern Utilization Research and Development Division, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt und in die ständige Kultursammlung aufgenommen. Sie ist von dort unter der Hinterlegungs-No. NRRL 5646 frei verfügbar. Die Angabe BM123ß bezieht sich vorliegend auf irgendein Gemisch aus BM123ßi und BM123ß2, und die Angabe BM123gamma bezieht sich im allgemeinen auf ein beliebiges Gemisch aus BM123gammai und BM123gamma2.

Im folgenden wird der Mikroorganismus Nocardia sp., *. NRRL 5646, aufgrund der bei ihm festgestellter charakteristischer Merkmale allgemein beschrieben. Die Ermittlung der Kulturmerkmale, physiologischen Merkmale und morphologischen Merkmale des Organismus erfolgte nach den Methoden, wie sie im Internat. Journ. of Syst. Bacteriol. 16:213-240 (1966) näher beschrieben sind. Die chemische Zusammensetzung der Kultur wurde nach den in Advan. Appi. Microbiol. 14: 47-72 (1971) beschriebenen Verfahren bestimmt. Die unterstrichenen Farbangaben und die Farbbezeichnungen wurden nach Color Harmony Manual, 3. Auflage (1948), Container Corp. of America, Chicago, Illinois, ermittelt. Die Beschreibungseinzelheiten finden sich auf den folgenden Tabellen I bis V.

Stärke des Wachstums Mässiges Wachstum auf Hefeextrakt-, Asparagin-Dextrose-, Benedict-, Bennett-, Kartoffeldextrose- und Weinstein-Agar, leichtes Wachstum auf Hickey- und Tresner-, Tomatenpasten-Hafermehl- und Pablum-Agar, Spurenwachstum auf anorganischem Salze-Stärke- Kuster-Haferflocken-, Czapek-Lösungsund Reis-Agar.

Luftmycel

Das Luftmycel ist, falls vorhanden, weisslich, wird nur auf Hefeextrakt-, Asparagin-Dextrose-, Benedict-, Bennet- sowie Kartoffeldextrose-Agar gebildet.

Lösliche Pigmente Es werden keine löslichen Pigmente produziert.

Unterseitenfarbe Farblos bis gelbliche Schattierungen.

Verschiedene physiologische Reaktionen Keine Gelatineverflüssigung, Nitrate werden innerhalb von

Tal

Kulturcharakteristiken vc

7 Tagen zu Nitriten reduziert, auf Pepton-Eisen-Agar werden keine melanoide Pigmente gebildet, keine Peptonisierung oder Gerinnungsbildung in Purpurmilch, Natriumchloridtoleranz in Hefeextrakt-Agar,

s

>4% jedoch <7%,

optimales Wachstum bei einer Temperatur von 32°C; Kohlen-stoffutilisation nach J. Bacteriol. 56:107-114 (1948), gute io Utilisation von Glycerin, Salicin, d-Trehalose und Dextrose, leidliche Utilisation von Isoinosit und schlechte bis keine Utilisation von d-Fructose, Maltose, Adonit, 1-Arabinose, Lactose, d-Mannit, d-Melibiose, d-Raffinose, 1-Rhamnose, Saccharose und d-Xylose.

xs

Chemische Zusammensetzung Der Organismus gehört zum Zellwandtyp IV, d. h. er enthält meso-2,6-Diaminopimelinsäure und hat ein Gesamtzellen-zuckerspektrum vom Typ A, was besagt, dass er Arabinose 20 und Galactose enthält. Methylierte Ganzzellenextrakte zeigen im Gaschromatogramm Fettsäurespektren, die zu den von Nocardia asteroides ATCC 3308 gebildeten ähnlich sind.

Mikromorphologie 25 Das Luftmycel wächst aus dem Trägermycel in Form . schwach verzweigter langer gewundener Elemente heraus, die gewöhnlich in länglichen einfachen Spiralen enden. Die gewundenen Elemente sind unregelmässig in kurze elliptische bis zylindrische Sektionen (Sporen?) segmentiert, die sich 30 leicht zergliedern. Die Spiralendbereiche sind weniger deutlich segmentiert. Die Segmente haben im allgemeinen Abmessungen von 0,8 bis 1,7 fxm X 0,3 bis 0,5 (im, mit einem Mittelwert von 0,4 (im X 1,2 (im.

3s Identifizierung des Stammes

Die morphologischen Charakteristiken der Kultur No. BM123 sind wegen der schlechten Entwicklung von Luftmycel auf den meisten Medien nur schwierig zu beobachten und zu interpretieren. Der chemischen Analyse-zur Bestim-40 mung der allgemeinen Beziehungen des Organismus kommt daher notwendigerweise eine ziemliche Bedeutung zu. Auf Basis des von Lechevalier et al. vorgeschlagenen Systems enthält die Kultur No. BM123 meso-2,6-Diaminopimelinsäure in ihren Gesamtzellen, und bei der Zuckeranalyse ergibt sich 45 das Vorhandensein von Arabinose und Galactose. Die Kultur gehört daher dem Zellwandtyp IV an. Ein Vergleich des Gaschromatographenspektrums der Kultur No. BM123 mit demjenigen von Nocardia asteroides ATCC 3308 zeigt, dass sich beide beachtlich ähneln. Andere Charakteristiken der so Kultur No. BM123, die mit dem Nocardia-Konzept übereinstimmen, sind sein fragmentierendes Luftwachstum auf einigen Medien und das totale Fehlen von Luftwachstum auf den meisten Medien. Wegen des Fehlens adäquater Kriterien für die Charakterisierung von Nocardia hinsichtlich der Species ss erfolgte auch keine derartige Bestimmung. Die Kultur No. BM123 wird daher als eine nicht bestimmte Species von Nocardia angesehen, bis sich eine derartige Identifizierung machen lässt.

ellel i Nocardia sp. NRRL 5646

Medium

Inkubation: 14 Tage Ausmass des Luftmycel

Wachstums und/oder Sporen

Temperatur: 32°C lösliches Unterseiten-

Pigment färbe

Bemerkungen

Hefe-Extrakt-Agar mittelmässig

Luftmycel weisslich, hell keines senffarben dunkle Zonen im

(3 ie) Substratmycel; Coremie-

bildung auf der Mycel-oberfläche

626895 ö

Tabelle I (Fortsetzung) Kulturcharakteristiken von Nocardia sp. NRRL 5646

Inkubation: 14 Tage

Temperatur: 32°C

Medium

Ausmass des

Luftmycel lösliches

Unterseiten

Bemerkungen

Wachstums und/oder Sporen

Pigment farbe

Hickey- und Tresner-

gering kein Luftmycel keines farblos bis die peripheren Zonen der

Agar - .

gelblichgrün

Kolonien werden olivgrün

Asparagin-Dextrose-

mittelmässig

Spureines weisslichen keines amberfarben

Oberfläche leicht

Agar

Luftmycels

(31c)

gerunzelt

Benedict-Agar mittelmässig

Luftmycel weisslich keines durchsichtig auf der Myceloberfläche hell

lohfarben (4gc)

reichlich Coremiebildung

Bennett-Agar mittelmässig

Spur eines weisslichen keines camelfarben

Oberfläche leicht

Luftmycels

(3ie)

gerunzelt

Anorganischer Salz-

Spur kein Luftmycel keines farblos

Stärke-Agar

Kuster-Haferflocken-

Spur kein Luftmycel keines farblos

Agar

keines farblos

Czapek-Lösungs-Agar

Spur kein Luftmycel

Kartoffel-Dextrose-Agar mittelmässig

Luftmycel, weisslich,

keines camelfarben

hell

(3ie)

Tomatenpaste-Hafer-

gering kein Luftmycel keines farblos

mehl-Agar

Pablum-Agar gering kein Luftmycel keines farblos

Reis-Agar

Spur kein Luftmycel keines farblos

Weinstein-Agar mittelmässig kein Luftmycel keines farblos bis gelblich

Tabellen

Mikromorphologie von Nocardia sp. NRRL 5646 Medium Luftmycel und/oder Sporiferen-Strukturen

Hefeextrakt- Das Luftmycel tritt aus dem Trägennycel Agar in Form schwach verzweigter gewundener

Elemente aus, die gewöhnlich in länglichen einfachen Spiralen enden. Die gewundenen Elemente sind unregelmässig in kurze Sektionen (Sporen?) segmentiert, die leicht disartikulieren. Die Spiralendbereiche sind weniger deutlich segmentiert. Die Segmente haben im allgemeinen die Abmessungen 0,8 bis 1,7 p.m X 0,3 bis 0,5 |un, mit einem Mittelwert von 0,4 (im X 1,2 (im.

Tabelle III

Verschiedene physiologische Reaktionen von Nocardia sp. NRRL 5646

Medium

Inkubationszeit

Ausmass des Wachstums

Physiologische Reaktion

Gelatine

7 Tage gering keine Verflüssigung

Gelatine

14 Tage gut keine Verflüssigung

Organische Nitratbrühe

7 Tage gut

Nitrate wurden zu Nitriten

reduziert

Organische Nitratbrühe

14 Tage gut

Nitrate wurden zu Nitrilen

_ -

reduziert

Pepton-Eisen-Agar

24 bis 48 Stunden gut keine Reduzierung von Melanin

—

pigmenten

Purpurmilch

7 Tage gut keine Peptonisierung oder

Gerinnung _

Hefeextrakt-Agar

7 Tage mittelflüssig

NaCl Toleranz >4%

plus (4,7,10 und 13%) NaCl

jedoch <7%,

7

626 895

Tabelle IV

Kohlenstoffutilisationsverhalten von Nocardia sp. NRRL 5646

Incubation: 10 Tage

Temperatur: 32°C

Kohlenstoflquelle

Utilisation*

Adonit

0

1-Arabinose

0

Glycerin

3

d-Fructose

1

i-Inosit

2

Lactose

0

d-Mannit

0

Salicin

2

d-Melibiose

0

d-Raffinose

0

Rhamnose

0 ~

Maltose

1

Saccharose

0

d-Trehalose

3

d-Xylose

0

Dextrose

3

Negative Kontrolle

0

+3-Gute Utilisation

2-Leidliche Utilisation

1-Schlechte Utilisation

0-keine Utilisation

Tabelle V

Chemische Zusammensetzung von Nocardia sp. NRRL 5646

Zellwandtyp

Hauptbestandteile

Typ IV

meso-DAP

Arabinose

Galactose nolen, jedoch weit stärker lösen. Die Antibiotica BM123gammai und BM123gamma2 sind Strukturisomere, die sich durch folgende Strukturformeln darstellen lassen:

x«

15

20

25

30

35

(M

!a i

fN

£C U

I

K Z I

m

CM K U

Die Produktion von BM123ß und BM123gamma ist nicht auf diesen besonderen Organismus oder die Organismen beschränkt, die völlig dem oben beschriebenen Wachstumsverhalten und den angeführten mikroskopischen Eigenschaften genügen, welche lediglich zu Illustrationszwecken angegeben sind. Es werden aus diesem Organismus daher auch durch verschiedene Mittel Mutanten gebildet, wie beispielsweise durch Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung, Stickstofflost, Actinophage oder dergleichen. Eine lebende Kultur eines typischen derartigen Mutantenstammes wurde bei Northern Utilization Research and Development Division, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt und dort in die ständige Sammlung aufgenommen, von wo sie unter der Nummer NRRL 8050 bezogen werden kann. Obwohl die Kulturmerkmale, die physiologischen Merkmale und die morphologischen Merkmale von NRRL 8050 praktisch die gleichen sind wie diejenigen von NRRL 5646, produziert der erstere während einer aeroben Fermentation grössere Mengen an BM123gamma. Der Organismus NRRL 8050 unterscheidet sich ferner vom Stammorganismus NRRL 5646 durch folgende Merkmale:

(a) er reduziert Nitrate langsamer zu Nitriten und

(b) er bildet auf Bennett- sowie auf Hefeextrakt-Agar ein rosenholz-lohfarbenes Mycelpigment.

Die neuen antibakteriellen Verbindungen sind im allgemeinen kristalline Feststoffe, die in nichtpolaren Lösungsmitteln, wie Diäthyläther oder Hexan, verhältnismässig begrenzt löslich sind, sich in Lösungsmitteln, wie Wasser oder niederen Alka-

40

so

60

65

626895

8

Die reduktive Alkylierung von BM123gamma und BM123gammai oder BM123gamma2 mit Ketonen findet an der Spermadin-Seitenkette unter Bildung von Derivaten der Formel statt:

(N ffi 2 I

CM

K U

«w»

1

ta

2 i

M

fM E U

O

SJ II ffi z— o—z f-

M H

S oa d Il /«2

R-V V-CH=CH-C-NH- (CH2) 3-NH- (CH2) 4-NH-CH

io worin R für einen Rest der Formeln

R2

^•R,

oder

25

30

35

h O H

H \

OH H/

\. V NH-

H NH 1

c=o

1

nh2

steht und die Substituenten R2 sowie R3 die oben angegebenen Bedeutungen haben.

40 Die reduktive Alkylierung von BM123gamma,

BM123gammai und BM123gamma2 mit Aldehyden findet an der Spermadin-Seitenkette unter Bildung von mono-, di- und trisubstituierten Derivaten der Formeln statt:

45

o trans ||

R-v^ y-CH=CH-C—NH- (CH2)^-NH-.tCHj)4~NH-CH2-R^

en // i\ trans ||

R-y y-CH=CH-C-NH-(CH,)3-NH- (CH2)4-N,

\—/ -i_n2~'vi

/ CH2-R! ^CH,-R,

55

60

O

/7~~\ trans |

i-^__y-CH=CH-C-NH- (CH2) 3-N- (CH2) 4-NH-CH2-R1

CH2-Rj

CH2-RI

^ch2-R1

/■;—trans 1) /

y-CH=CH-C-NH- (CH2) 3-N- (CHj) 4~N>

' CH2-Ri

65 worin die Substituenten R und Ri die oben angegebenen Bedeutungen haben.

Es waren antibiotisch wirkende Verbindungen schon bekannt (US-PS Nr. 3.350.387,3.784.541 und 3.978.041 und Brit.Pat.

9

626895

Nr. 1.033.394), welche durch ihre Herkunft oder ihre chemische Struktur eine gewisse Verwandtschaft mit den neuen Derivaten erkennen lassen.

Die neuen Verbindungen sind wertvolle Heilmittel und stellen, wie bereits erwähnt, interessante Antibiotica dar. Diese günstige Eigenschaft der Alkylderivate von BM 123gamma zeigt sich anhand ihrer Fähigkeit zur Bekämpfung systemischer letaler Infektionen bei der Maus. Die neuen Substanzen zeigen bei der Maus gegenüber Escherichia coli US311 in vivo eine starke antibakterielle Wirkung, wenn man sie durch subkutane Einzeldosis an Gruppen von Carworth

Farms (CF-l-Mäusen mit einem Gewicht von etwa 20 g verabreicht, die intraperitoneal mit einer letalen Dosis dieser Bakterien in einer 10"3-Verdünnung von Trypticase-Sojabrühe-TSP einer 5 Stunden alten TSP-Blutkultur infiziert sind. In der s folgenden Tabelle VI ist die in vivo-Aktivität typischer erfin-dungsgemäss erhältlicher Produkte, die aus den angegebenen Carbonylverbindungen hergestellt worden sind, gegenüber Escherichia coli US311 an der Maus aufgeführt. Die Aktivität ist in ED5o-Werten oder derjenigen Dosis in Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht angegeben, die zum Schutz von 50% der Mäuse gegenüber E. coli erforderlich ist.

10

Tabelle VI

Verwendete Carbonylverbindung

Name des Derivats

EDJ0 in i Körpergi l-DipropyIamino-2-propanon l-MethyI-2-(N,N-dipropylamino)äthyl-BM123gamma

0,3

l-Chlor-3-pentanon l-Äthyl-3-chlorpropyl-BM123gamma

0,12

Cyclooctanon

Cyclooctyl-BM123gamma

0,18

4-Methyl-2-pentanon l,3-Dimethylbutyl-BM123gamma

<0,12

Phenylaceton l-Methyl-2-phenyläthyl-BM123gamma

0,18

trans-4-Phenyl-3-buten-2-on l-Methyl-3-phenylpropen(-2-)yl-BM123gamma

0,25

1-CyclohexyI-l-propanon •

1 -Cyclohexylpropyl-BMl 2 3 gamma

0,37

6-Methyl-5-hepten-2-on l,5-Dimethylhexen(-4-)yl-BM123gamma

0,06

3-Methyl-2-pentanon

... l,2-Dimethylbutyl-BM123gamma

0,12

5-Methyl-2-hexanon l,4-Dimethylpentyl-BM123gamma

0,12

3-Äthyl-2-pentanon l-Methyl-2-äthylbutyl-BM123gamma

0,18

3,5-Dimethyl-2-octanon l,2,4-Trimethylheptyl-BM123gamma

0,37

3-Octanon l-Äthylhexyl-BM123gamma

0,18

3-Methyl-2-hexanon l,2-Dimethylpentyl-BM123gamma

0,18

3-IndoIylaceton l-Methyl-2-(ß-indoIyl)äthyl-BM123gamma

0,12

2-Pentanon

1 -Methylbutyl-BMl 2 3 gamma

<0,12

2-Butanon l-Methylpropyl-BM123gamma

<0,12

2-Cyclopenten(-l-)yl-aceton l-Methyl-2-cycIopenten(-2-)-yl-äthyl-BM123gamma

<0,12

Aceton

Isopropyl-BM123gamma

<0,12

3-Decanon l-Äthyloctyl-BM123gamma v

0,25

3-Undecanon l-Äthylnonyl-BM123gamma

0,38

o-Acetoacetotoluidid l-Methyl-2-o[tolylcarbamoyläthyl]-BM123gamma

0,25

Mesityloxid l,3-Dimethylbuten(-2-)yl-BM123gamma

0,3

Methoxyaceton l-Methyl-2-methoxyäthyl-BM123gamma

0,3

Cyclohexylaceton l-Methyl-2-cyclohexyläthyl-BM123gamma

0,18

4-(p-Hydroxyphenyl)-2-butanon l-Methyl-3-(4-hydroxyphenyl)propyl-BM123gamma

0,3

4-MethyI-2-hexanon l,3-Dimethylpentyl-BM123gamma

<0,12

2,2,4,4-Tetramethylcyclopentanon

2,2,4,4-Tetramethylcyclopentyl-BM123gamma

0,75

2,4,4-Trimethylcyclopentanon

2,4,4-Trimethylcyclopentyl-BM123gamma

0,3

2-Cyclopentylcyclopentanon

2-Cyclopentylcyclopentyl-BM123gamma

0,37

2-(Cyclo-l-hexenyl)cyclohexanon

2-(l-Cyclohexen)cyclohexyl-BM123gamma

0,19

3-tert.-Pentylcyclopentanon

3-tert.-Pentylcyclopentyl-BM123gamma

0,5

2-Cyclohexylcyclohexanon

2-Cyclohexylcyclohexyl-BM123gamma

0,75

2-Äthylcyclohexanon

2-Äthylcyclohexyl-BM123gamma

0,19

3,3-Dimethyl-2-butanon l,2,2-Trimethylpropyl-BM123gamma

<0,12

2-Undecanon

1 -Methyldecyl-BMl 23 gamma

>2

Tetrahydrothiopyran-4-on

4-Tetrahydrothiopyranyl-BM123gamma

0,38

3,5-Dimethylcyclohexanon

3,5-Dimethylcyclohexyl-BM123gamma

<0,12

2-Tetradecanon

1 -Methyltridecyl-BM123gamma

2,0

l-Methoxy-l-buten-3-on l-Methyl-3-methoxypropen(-2-)yl-BM123gamma

>2,0

4-Hydroxy-3-methyl-2-butanon l,2-Dimethyl-3-hydroxypropyl-BM123gamma

0,12

Menthon

3-Methyl-6-isopropylcyclohexyl-BM123gamma

0,38

Cyclononanon

Cyclononyl-BM123gamma

0,18

l-Methyl-2-decalon

Decahydro-l-methyl-2-naphthyl-BM123gamma

0,25

3,3-Dimethyl-4-cyclohexen-l -on

3,3-Dimethylcyclohexen(-4-)yl-BM123gamma

0,37

3-Methyl-2-decalon

Decahydro-3-methyl-2-naphthyl-BM123gamma

0,37

l-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-butanon l-Äthyl-2-(3,4-dimethoxyphenyl)äthyl-BM123gamma

1,0

l-Diäthylamino-3-butanon l-Methyl-3-(N,N-diäthylamino)propyl-BM123gamma

0,18

Äthyl-2-chloracetoacetat l-Methyl-2-chlor-2-carbäthoxyäthyl-BM123gamma

1,5

3 -Hydroxy-3 -methyl-2-butanon l,2,2-Dimethylhydroxypropyl-BM123gamma

0,18

3-Pentanon l-Äthylpropyl-BM123gamma

0,12

3-Methyl-2-butanon l,2-Dimethylpropyl-BM123gamma

0,19

626895

10

Tabelle VI (Fortsetzung)

Verwendete Carbonylverbindung Name des Derivats EDS0 in mg/kg

Körpergewicht p-Chlorphenylaceton l-Methyl-2-(4-chlorphenyl)äthyl-BM123gamma 0,25

N-(tert.-Butyl)acetoacetamid 2-(tert.-Butylcarbamoyl)-l-methyläthyl-BM123gamma 0,38

1,1-Dimethoxyaceton l-MethyI-2,2-dimethoxyäthyl-BM123gamma 0,5

4-Heptanon l-Propylbutyl-BM123gamma 0,25 3-Methoxyphenylaceton l-Methyl-2-(3-methoxyphenyl)äthyl-BM123gamma 0,30

2-PhenylcycIohexanon 2-Phenylcyclohexyl-BM123gamma 0,38 Phenoxy-2-propanon l-Methyl-2-phenoxyäthyl-B123gamma 0,3

3-Butin-2-on l-Methylpropin(-2-)yl-BM123gamma <2,0 Dimethylaminoaceton l-Methyl-2-(N,N-dimethylamino)äthyl-BM123gamma 1,5

5-Diäthylamino-2-pentanon l-Methyl-4-(N,N-diäthylamino)butyl-BM123gamma 0,5 2-Cyclohexen-l-on 2-Cyclohexenyl-BM123gamma 0,25 Cyclopropylmethylketon l-Cyclopropyläthyl-B123gamma 0.25 4,4-Dimetho~xy-2-butanon l-Methyl-3,3-dimethoxypropyl-BM123ganuna 0,75 2-Methoxyphenylaceton l-Methyl-2-(2-methoxyphenyl)äthyl-BM123gamma 0,7 Acetylaceton l-Methyl-2-acetyläthyl-BM123gamma 1,5 Cyclobutanon -• Cyclobutyl-BM123gamma 0,38 p-Chlorphenylaceton l-Methyl-2-(4-chlorphenyl)äthyl-BM123gamma 0,25 2-Octanon l-Methylheptyl-BM123gamma 0,38

4-Phenyl-2-butanon l-MethyI-3-phenyIpropyl-BM123gamma 0,38

5-Chlor-2-pentanon l-Methyl-4-chlorbutyl-BM123gamma 0,37

0-Chlorphenylaceton - l-Methyl-2-(2-chlorphenyl)äthyl-BM123gamma 0,37 m-Chlorphenylaceton l-Methyl-2-(3-chlorphenyl)äthyl-BM123gamma 0,38 5-Hexen-2-on „ l-Methylpenten(-4-)yl-BM123gamma 0,38 Cyclohexanon Cycloliexyl-BM123gamma 0,75 2-Hexanon l-Methylpentyl-BM123gamma 0,38 2-Heptanon " l-Methylhexyl-BM123gamma 0,38 Cycloheptanon Cycloheptyl-BM123gamma 0,3 Cyclopentanon Cyclopentyl-BM123gamma 0,25 4,4-Dimethyl-2-pentanon l,3,3-Trimethylbutyl-BM123gamma 0,18

2-Acetamido-3-butanon 2-Acetamido-l-methylpropyI-BM123gamraa 0,50 2,6-Dimethyl-3-heptanon l-Isopropyl-4-methylpentyl-BM123gamma 0,39

4-Octanon l-Propylpentyl-BM123gamma 0,39

3-Acetylpyridin _ l-(3-Pyridyl)äthyl-BM123gamma 0,75

3-Heptanon l-Äthylpentyl-BM123gamma 0,25 Äthylbutyrylacetat l-(Carbätboxymethyl)butyl-BM123gamma 0,75

1-Benzyl-4-piperidon l-Benzyl-4-piperidyl-BM123gamma 0,18

1-Methyl-4-piperidon l-Methyl-4-piperidyl-BM123gamma 0,75 3 -Methylcyclopentanon 3-Methylcyclopentyl-BM123gamma 0,25

3.3-Dimethyl-2-butanon l-Methyl-2,2-dimethylpropyl-BM123gamma 0,18

2-Acetyl-5-norbornen ' l-[5-Norbonen(2)]äthyl-BM123gamma <0,12 BicycIo[3.2. l]octan-2-on Bicyclo[3.2.1]octanyl-2-BM123gamma <0,25 3 -Chinuclidinon 3-Chinuclidinyl-BM123gamma 0,39

5-Methoxyl-2-tetralon 5-MethoxyI-2-tetralyl-BM123gamma 0,18

4-Methyl-2-heptanon l,3-Dimethylhexyl-BM123gamma 0,5

3.4-Dimethyl-2-hexanon l,2,3-Trimethylpentyl-BM123gamma 0,39 1,3,3-TrimethylcycIopentanon l,3,3-Trimethylcyclopentyl-BM123gamma 0,37 Acetylcyclopentanon l-Cyclopentyläthyl-BM123gamma 0,18

5-Hexen-2-on l-Methylpenten-4-yl-BM123gamma 0,18 2-Methylcyclopentanoa 2-Methylcyclopentyl-BM123gamma 0,25 2,4-Dimethylcyclopentanon 2,4-Dimethylcyclopentyl-BM123gamma 0,18

2-Äthylcyclopentanon 2-ÄthyIcycIopentyl-BM123gamma 0,12 " 2-Adamanton Adamantyl-2-BM123gamma 0,25

3-Hexanon l-Äthylbutyl-BM123gamma 0,39 Äthyl-2-methyIacetoacetat l-Methyl-2-carboäthoxypropyl-BM123gamma 0,18 Norbornanon Norbomyl-BM123gamma 0,18 5-Hexen-2-on l-Methyl-4-pentenyl-BM123gamma 0,18

3-Hydroxy-2-butanon l-Methyl-2-hydroxypropyl-BM123gamma 0,37

4-Hydroxy-3-methyl-2-butanon l-Methyl-2-(3-hydroxy-2-methylpropyl)-BM123gamma 0,18 2-Nonanon l-Methyloctyl-BM123gamma 0,37

5-Hydroxy-2-pentanon l-Methyl-4-hydroxybutyl-BM123gamma 0,18 2-Decanon l-Methylnonyl-BM123gamma 0,18 4-tert.-ButylcycIohexanon 4-tert.-Butylcyclohexyl-BM123gamina 0,12 2-Äthylidencyclohexanon 2-Äthylidencyclohexyl-BM123gamma 0,12

11

Tabelle VI (Fortsetzung)

626 895

Verwendete Carbonylverbindung Name des Derivats EDJ0 in mg/kg

Körpergewicht

Phenylacetaldehyd

2-Phenyläthyl-BM123gamma

0,18

p-Methoxyphenylacetaldehyd

2-(p-Methoxyphenyl)äthyl-BM123gamma

0,18

2,2-Dimethylbutanal

2,2-Dimethylbutyl-BM123gamma

0,12

2,2-Dimethylpropanol

2,2-DimethyIpropyl-BM123gamma

0,18

2-Äthyl-2-butenal

2-Äthyl-2-butenyl-BM123gamma

0,18

trans-2-Methyl-2-butenal trans-2-Methyl-2-butenyl-BM123gamma

0,18

trans-2-Methyl-2-pentenal trans-2-Methyl-2-pentenyl-BM123gamma

0,18

Formaldehyd

Methyl-BM123gamma

0,12

Acetaldehyd

ÄthyI-BM123gamma

0,38

Zur Herstellung von vorwiegend BM123ß und BM123gamma ausgewähltes Fermentationsverfahren Die Züchtung von Nocardia sp. NRRL 8050 kann in einer Reihe verschiedener flüssiger Kulturmedien vorgenommen werden. Zur Bildung der Antibiotica geeignete Medien enthalten assimilierbare Kohlenstoffquellen, wie Stärke, Zucker, Melassen oder Glycerin, assimilierbare Stickstoffquellen, wie Protein, Proteinhydrolysat, Polypeptide, Aminosäuren oder Maisquellwasser, sowie anorganischen Anionen und Kationen, wie Kalium, Magnesium, Calcium, Ammonium, Sulfat, Carbo-nat, Phosphat oder Chlorid. Spurenelemente, wie Bor, Molybdän oder Kupfer, werden als Verunreinigungen anderer Bestandteile der Medien geliefert. Die Belüftung in Tanks oder Kolben erfolgt, indem man durch das Fermentationsmedium oder auf die Oberfläche des Fermentationsmediums unter Druck sterile Luft leitet. Eine weitere Durchmischung in Tanks erfolgt durch einen mechanischen Rührer. Gegebenenfalls kann man auch ein Mittel gegen Schaumbildung zusetzen, wie Hodag(R) FD 82.

Herstellung des Inokulums für BM123ß und BM123gamma

Ein primäres Schüttelflascheninokulum von Nocardia sp. NRRL 8050 wird hergestellt, indem man 100 ml steriles flüssi-

35

Fleischextrakt

15 g

Ammoniumsulfat

3g

Kaliumdihydrogenphosphat

3g

Calciumcarbonat lg

Magnesiumsulfat-heptahydrat

1,5 g

Glucose

10 g

Wasser auf

1000 ml

Die Glucose wird getrennt sterilisiert.

25

Das bei der dritten Stufe erhaltene Inokulum wird bei einer Geschwindigkeit von 0,4 bis 0,8 Liter steriler Luft pro Liter Brühe pro Minute belüftet, wobei man das Fermentationsgemisch durch einen Rührer mit einer Geschwindigkeit von 150 bis 300 Umdrehungen pro Minute durchmischt. Die Temperatur wird auf 25 bis 29°C, gewöhnlich auf 28°C, gehalten. Man lässt das Ganze 48 bis 72 Stunden wachsen, worauf man mit dem auf diese Weise erhaltenen Inokulum einen 3000 Liter fassenden Fermentationstank beimpft.

Tankfermentation zur Herstellung von BM123 ß und BM123gamma Für die Herstellung von BM123ß und BM123gamma in ges Medium durch Abkratzen oder Abwaschen von Sporen aus 40 Tankfermentern verwendet man vorzugsweise das folgende einer Agarschräge der Kultur in 500 ml Kolben inokuliert. Gewöhnlich verwendet man hierzu folgendes Medium:

Fermentationsmedium:

Bactotrypton Hefeextrakt Rinderextrakt Glucose Wasser auf

5g 5 g 3g

10 g 1000 ml

Die Kolben werden bei einer Temperatur von 25 bis 29°C, vorzugsweise 28°C, inkubiert und über eine Zeitspanne von 30 bis 48 Stunden kräftig auf einem Rotationsschüttler in Bewegung gehalten. Anschliessend wird das Inokulum in sterile Schraubverschlusskulturflaschen übertragen und bei unter -17,8 °C (0°F) gelagert. Dieser Vorrat an vegetativem Inokulum wird dann anstelle von Schrägagarpräparaten zur Inokulierung weiterer Schüttelkolben für die Herstellung dieses erststufigen Inokulums verwendet.

Die aus dieser ersten Stufe erhaltenen Kolbeninokula werden zur Beimpfung von jeweils 12 Liter Ansätzen des gleichen Mediums in 20 Liter Glasfermentern verwendet. Der Inoku-lumbrei wird mit steriler Luft belüftet, während man ihn 30 bis 48 Stunden weiter wachsen lässt.

Mit den 12 Liter Ansätzen der in der zweiten Stufe erhaltenen Inokula werden Tankfermenter beimpft, die 300 Liter des folgenden sterilen flüssigen Mediums enthalten, um auf diese Weise das dritte und letzte Inokulum zu bilden:

Fleischextrakt

30 g

Ammoniumsulfat

6g

Kaliumdihydrogenphosphat

6g

Calciumcarbonat

2g

Magnesiumsulfat-heptahydrat

3g

Glucose

20 g

Wasser auf

1000 ml

Die Glucose wird getrennt sterilisiert.

50

Jeder Tank wird mit 5 bis 10% des bei der oben beschriebenen Herstellung des Inokulums in der dritten Herstellungsstufe 55 erhaltenen Inokulums inokuliert. Der Fermentationsbrei wird auf einer Temperatur von 25 bis 28°C, gewöhnlich von 26°C, gehalten. Der Brei wird mit steriler Luft in einer Geschwindigkeit von 0,3 bis 0,5 Liter sterile Luft pro Liter Brei pro Minute belüftet und durch einen Rührer mit einer Rührgeschwindig-60 keit von 70 bis 100 Umdrehungen pro Minute in Bewegung gehalten. Man lässt die Fermentation 65 bis 90 Stunden laufen, worauf man die Maische erntet.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert.

65

Beispiel 1

Herstellung des Inokulums für BM123ß und BM123gamma Unter Verwendung des folgenden typischen Nährmediums

626 895

12

lässt man die erste und die zweite Stufe eines Inokulums wachsen:

Bactotrypton 5 g

Hefeextrakt 5 g

Rinderextrakt 3 g

Glucose 10 g

Wasser auf 1000 ml

Zwei 500 ml-Kolben, die jeweils 100 ml des obigen sterilen Mediums enthalten, werden jeweils mit 5 ml eines gefrorenen vegetativen Inokulums von Nocardia sp. NRRL 8050 beimpft. Die Kolben werden dann auf einen Rotationsschüttler gegeben und über eine Zeitspanne von 48 Stunden bei einer Temperatur von 28°C kräftig geschüttelt. Anschliessend überträgt man das erhaltene Kolbeninokulum in einen 22,7 Liter fassenden Glasfermenter, der 12 Liter des obigen sterilen Mediums enthält. Der Brei wird während des etwa 48stündigen Wachsens mit steriler Luft belüftet, worauf man mit dem Fermenter-inhalt einen 455 Liter fassenden Tankfermenter beimpft, der 300 Liter des folgenden sterilen flüssigen Mediums enthält:

Fleischextrakt 15 g

Ammoniumsulfat 3 g

Kaliumdihydrogenphosphat 3 g

Calciumcarbonat 1 g

Magnesiumsulfat-heptahydrat 1,5 g

Glucose 10 g

Wasser auf 1000 ml

Die Glucose wird getrennt sterilisiert.

Die Glucose wird getrennt sterilisiert.

Der obige Inokulumbrei der dritten Stufe wird mit steriler Luft belüftet, die man mit einer Geschwindigkeit von 0,4 Liter pro Liter Brei pro Minute in den Fermenter einbläst. Der Fermenterinhalt wird mit einem Rührer unter einer Rührgeschwindigkeit von 240 Umdrehungen pro Minute durchmischt. Der Brei wird auf einer Temperato von 28cC gehalten, wobei man als Entschäumungsmittel Hodag(R) FD82 verwendet. Nach einer 48stündigen Wachstumszeit verwendet man die erhaltene Inokulummaische zur Beimpfung einer 3000 Liter Fermentation.

Beispiel 2

Fermentation unter Verwendung von Nocardia sp.

NRRL 8050 und eines die Bildung von BM123ß und BM123gamma begünstigenden Mediums

Aus folgenden Bestandteilen wird ein Fermentationsmedium hergestellt:

Fleischextrakt 30 g

Ammoniumsulfat 6 g

Kaliumdihydrogenphosphat 6 g

Calciumcarbonat 2 g

Magnesiumsulfat-heptahydrat 3 g

Glucose 20 g

Wasser auf 1000 ml

Die Glucose wird getrennt sterilisiert.

Die Glucose wird getrennt sterilisiert.

Das Fermentationsmedium wird bei einer Temperatur von 120°C mit Dampf von 1,41 kg/cm2 (20 pounds) 60 Minuten lang sterilisiert. Der pH-Wert des Mediums nach Sterilisation liegt bei 6,9. In einem 4000 Liter-Tankfermenter werden 3000 Liter steriles Medium mit 300 Liter des in Beispiel 1 beschriebenen Inokulums beimpft, worauf man das Ganze bei einer Temperatur von 26°C unter Verwendung von Hodag(R) FD82 als Entschäumer fermentiert. Der Tank wird mit steriler Luft bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,35 Liter pro Liter s Maische pro Minute belüftet. Die Maische wird durch ein Rührwerk in Bewegung gehalten, das mit einer Geschwindigkeit von 70 bis 72 Umdrehungen pro Minute angetrieben wirt Nach insgesamt 67 Stunden langer Fermentation wird die Maische geerntet.

10

Beispiel 3

Isolierung von BM123ß und BM123gamma 3000 Liter einer wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellten Fermentationsmaische mit einem pH-Wert von 4,3 werden mi is Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und unter Verwendung von 5 % Diatomeenerde als Filterhilfe filtriert. Der Filterkuchen wird mit etwa 100 Liter Wasser gewaschen und dann verworfen. Die vereinigten Filtrate und Waschlaugen werden von unten nach oben durch drei parallel 20 angeordnete Säulen aus rostfreiem Stahl mit den Abmessungen 21X122 cm geführt, von denen jede 15 Liter CM Sepha-dex® C-25[ Na+]-Harz (ein vernetztes Dextran-Epichlorhydrin Kationenaustauschergel von Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) enthält. Die beladenen Säulen werden mit insgesamt etwa 390 2s Liter Wasser gewaschen, worauf man sie zuerst mit 200 Liter 1-prozentigem wässrigem Natriumchlorid und anschliessend mit 560 Liter 5-prozentigem wässrigem Natriumchlorid entwickelt. Das 5-prozentige wässrige Natriumchlorideluat wird geklärt, indem man es durch Diatomeenerde filtriert, und das 30 dabei erhaltene geklärte Filtrat leitet man anschliessend durch eine Glassäule mit den Abmessungen 20,3 X 152,5 cm, die 25 Liter granulatartiges Darco® G-60 (0,37 bis 0,83 mm lichte Maschenweite) (eine granulatartige Aktivkohle von Atlas Chemical Industries, Inc.) enthält. Die beladene Säule wird m: 3s 120 Liter Wasser gewaschen und dann zuerst mit 120 Liter 15prozentigem wässrigem Methanol, hierauf mit 340 Liter 50prozentigem wässrigem Methanol und abschliessend mit 12i Liter 50prozentigem wässrigem Aceton entwickelt. Das 15pro-zentige wässrige Methanoleluat wird im Vakuum auf etwa 7 40 Liter einer wässrigen Phase konzentriert, worauf man ihren pH-Wert mit Amberlite® IR-45 (OH~)-Harz (einem schwach basischen Polystyrol-Polyamin-Anionenaustauscher-harz) von pH 4,5 auf pH 6,0 eingestellt. Das Harz wird dann durch Filtrieren abgetrennt, und durch Konzentrieren des 45 Filtrats im Vakuum auf etwa 1 Liter und anschliessendes Lyophilisieren erhält man 38 g Material, das vorwiegend aus BMl23ß besteht, zusammen mit einer geringen Menge BM123gamma (vorwiegend BM123gamma2). Das 50prozen-tige wässrige Methanoleluat stellt man mit Amberlite® IR-so 45 (OH~)-Harz von pH 4,65 auf pH 6,0 ein. Anschliessend wird das Harz durch Filtrieren abgetrennt, und durch Einengen des Filtrats im Vakuum auf etwa 6,3 Liter und anschliessendes Lyophilisieren erhält man 213 g Material, das vorwiegend aus BM123gamma besteht. Das 50prozentige wässrige ss Acetoneluat wird mit Amberlite® IR-45 (OH~)-Harz von pH 4,0 auf pH 6,0 eingestellt. Durch Abfiltrieren des Harzes, anschliessendes Konzentrieren des erhaltenen Filtrats im Vakuum auf etwa 1,5 Liter und nachfolgendes Lyophilisieren erhält man 56 g unreines BM123gamma.

60

Beispiel 4

Weitere Reinigung von BM123gamma Eine Aufschlämmung von CM Sephadex® C-25 [NHÎ] in 2prozentigem wässrigem Ammoniumchlorid wird in eine Glas-65 säule mit einem Durchmesser von 2,6 cm gegossen, bis man eine Harzhöhe von etwa 62 cm hat. Der Überschuss an 2-prozentigem wässrigem Ammoniumchlorid wird abgeleitet. Hierauf löst man 5,0 g des nach Beispiel 3 hergestellten

13

626 895

BM123gamma in etwa 10 ml 2prozentigem wässrigem Ammoniumchlorid und gibt das Ganze auf die Säule. Die Säule wird anschliessend mit einem Gradienten zwischen 6 Liter von jeweils 2prozentigem und 4prozentigem wässrigem Ammoniumchlorid eluiert. Alle 15 Minuten sammelt man automatisch Fraktionen von jeweils etwa 75 ml. Die Lage des Antibioti-cums BM123gamma wird durch ständige Untersuchung des Säulenabstroms im Ultraviolettlicht und durch Bioautographie getränkter Papierscheiben auf grossen Agarplatten, die mit Klebsiella pneumoniae, Stamm AD, beimpft sind, überwacht. Die Hauptmenge an BM123gamma kommt zwischen den Fraktionen 71 bis 107.

130 ml granulatartiges Darco® G-60 (0,37 bis 0,83 mm lichte Maschenweite) werden in Wasser suspendiert und in eine Glassäule gefüllt. Dort lässt man das Material absetzen und das überschüssige Wasser ablaufen. Die Fraktionen 84 bis 96 des obigen CM Sephadex-Chromatogramms werden vereinigt, und durch die mit Kohlegranulat gefüllte Säule geführt. Die beladene Säule wird mit 600 ml Wasser gewaschen und dann mit 1 Liter 50prozentigem wässrigem Aceton entwickelt. Die Eluate, die beide BM123gamma enthalten, werden im Vakuum zu wässrigen Phasen konzentriert und lyophilisiert, wodurch man insgesamt 886 mg BM123gamma als Hydrochlo-ridsalz erhält. Zur Herstellung einer Probe für die Mikroanalyse wird das obige Material erneut dem oben angegebenen Verfahren unterzogen.

Das Antibioticum BM123gamma besitzt keinen ausgeprägten Schmelzpunkt, es beginnt sich jedoch bei um 200°C allmählich zu zersetzen. Die Mikroanalyse einer Probe, die man vorher 24 Stunden bei einer Temperatur von 22,2 ° C und einer relativen Feuchtigkeit von 23% ins Gleichgewicht kommen lässt, führt zu folgenden Werten: C = 39,44%; H = 6,10%; N = 16,19%; Cl (ionisch) = 11,54%. Der Gewichtsverlust beim Trocknen beträgt 8,19%. In Wasser zeigt BM123gamma ein UV-Absorptionsmaximum bei 286 nm mit einem Wert EJot = 250. Die Lage dieses Maximums ändert sich nicht mit dem pH-Wert. Das BM123gamma zeigt eine spezifische Drehung von [alpha]^?° = +71° (C = 0,97 in Wasser).

Das Antibioticum BM123gamma zeigt im Infrarotbereich des Spektrums bei folgenden Wellenlängen eine charakteristische Absorption: 770, 830, 870, 930, 980,1035, 1105,1175, 1225,1300,1340,1370,1460, 1510,1555, 1605, 1660,1740, 2950 und 3350 cm"1. Ein übliches, mit einem KBr-Pellet hergestelltes Infrarotabsorptionsspektrum von BM123gamma geht aus der anliegenden Figur 1 hervor.

Beispiel 5 Isolierung von BM123gammai

Eine Aufschlämmung von CM Sephadex(R) C-25 [Na+] in 2prozentigem wässrigem Natriumchlorid wird so in eine Glassäule mit einem Durchmesser von 2,6 cm gegossen, dass man eine Harzhöhe von etwa 70 cm erhält. Der Überschuss an 2prozentigem wässrigem Natriumchlorid wird abgeleitet. Anschliessend löst man 4,11 g einer Probe, die vorwiegend BM123gammai zusammen mit etwas BM123gamma2 und anderen Verunreinigungen enthält und nach Beispiel 3 hergestellt worden ist, in etwa 10 ml 2prozentigem wässrigem Natriumchlorid und bringt das Ganze auf die Säule. Die Säule wird dann bei einem Gradienten zwischen 4 Liter mit jeweils 2pro-zentigem und 4prozentigem wässrigem Natriumchlorid eluiert. Alle 15 Minuten sammelt man automatisch Fraktionen mit jeweils etwa 75 ml. Die Lage des Antibioticums BM123gamma wird durch ständige Überwachung des Säulenabstroms im Ultraviolettlicht und durch Bioautographie getränkter Papierscheiben auf grossen Agarplatten, die mit Klebsiella pneumoniae, Stamm AD, beimpft sind, überwacht und ermittelt. Der Hauptteil an BM123gamma liegt zwischen den Fraktionen 64 und 90. Die Anfangsfraktionen (64-80)

enthalten ein Gemisch aus BM123gammai und BM123gamma2, und die letzten Fraktionen (81-90) enthalten praktisch reines BM123gammai.

100 ml granulatartiges Darco® G-60 (0,37 bis 0,83 mm s lichte Maschenweite) werden in Wasser suspendiert und in eine Glassäule gefüllt. In dieser lässt man die Suspension absetzen und das überschüssige Wasser ablaufen. Die Fraktionen 81-90 des obigen CM Sephadex-Chromatogramms werden vereinigt und durch die mit Kohlegranulat gefüllte Säule io geschickt. Die beladene Säule wird mit 500 ml Wasser gewaschen und dann zuerst mit 500 ml 10-prozentigem wässrigem Methanol und anschliessend mit 1 Liter 50prozentigem wässrigem Methanol entwickelt. Das 50prozentige wässrige Methanoleluat, das die Hauptmenge an BM123gammai enthält, wird 15 mit Amberlite® IR-45 (OH_1)-Harz auf pH 5,9 bis 6,0 eingestellt. Im Anschluss daran trennt man das Harz durch Filtrieren ab, konzentriert das Filtrat im Vakuum auf eine wässrige Phase und lyophylisiert dieses Filtrat, wodurch man 294 mg weisses amorphes BM123gammai in Form des Hydrochlorid-20 salzes erhält.

Das Antibioticum BM123gammai besitzt keinen definierten Schmelzpunkt, es zersetzt sich jedoch allmählich bei einer Temperatur um 200°C. Die Mikroanalyse einer Probe, die man vorher 24 Stunden bei einer Temperatur von 21,1°C und 25 einer relativen Feuchtigkeit von 60 % ins Gleichgewicht kommen lässt, ergibt folgende Werte: C = 37,84%; H = 5,73%; N = 15,58; Cl (ionisch) = 10,01%. Der Gewichtsverlust beim Trocknen beträgt 10,45%. In Methanol zeigt BM123gammai ein UV-Absorptionsmaximum bei 286 nm mit einem Wert 30 E lOT = 225. Die Lage dieses Maximums ändert sich nicht mit dem pH-Wert. Das BM123gammai zeigt eine spezifische Drehung von +55° (c = 0,803 in Wasser).

Das Antibioticum BM123gammai zeigt im Infrarotbereich des Spektrums bei folgenden Wellenlängen eine charakteristi-3s sehe Absorption: 770, 830, 870, 930, 980,1045,1080,1110, 1125,1175,1225,1305,1345,1380,1465, 1515,1560,1605, 1660,1730, 2950 und 3350 cm-1. Aus der anliegenden Figur 2 geht ein übliches Infrarotabsorptionsspektrum von BM123gammai in einem KBr-Pellet hervor. Der anliegenden 40 Figur 4 ist ein übliches magnetisches Protonenresonanzspek-trum von BM123gammai zu entnehmen, das an einer D2O-Lösung in einem Spektrometer mit 100 Megazyklen bestimmt worden ist.

Beispiel 6

45 Isolierung von BM123gamma2

. 25 g einer nach Beispiel 3 hergestellten Probe, die vorwiegend BM123gamma2 und BM123ß enthält, werden in etwa 120 ml 2-prozentigem wässrigem Natriumchlorid gelöst und dann in Form dieser Lösung auf eine Säule gegeben, die mit so 1800 ml CM Sephadex® C-25 [Na+] in 2prozentigem wässrigem Natriumchlorid gefüllt ist. Die Säule wird anschliessend unter einem Gradienten zwischen 20 Liter von jeweils 2pro-zentigem und 4prozentigem wässrigem Natriumchlorid eluiert. Die ersten 12 Liter Eluat werden in einem grossen Kolben ss aufgefangen und verworfen. Im Anschluss daran sammelt man alle 40 Minuten automatisch Fraktionen von jeweils etwa 800 ml. Die Lage des Antibioticums BM123gamma wird durch ständige Untersuchung der von der Säule kommenden Fraktionen im Ultraviolettlicht ermittelt. Die Hauptmenge an 60 BM123gamma liegt zwischen den Fraktionen 7-18. Die Anfangsfraktionen (7-15) enthalten praktisch reines BM123gamma2. Die Endfraktionen (16-18) enthalten ein Gemisch aus BM123gammai und BM123gamma2.

600 ml granulatartiges Darco® G-60 (0,37 bis 0,83 mm « lichte Maschenweite) werden in Wasser suspendiert und dann in eine Glassäule gefüllt. Hierin lässt man die Suspendion absetzen und überschüssiges Wasser ablaufen. Die Fraktionen 7-15 aus dem obigen CM Sephadex-Chromatogramm werden

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14

vereinigt und durch die mit Kohlegranulat gefüllte Säule geschickt. Die beladene Säule wird mit 3 Liter Wasser gewaschen, worauf man sie zunächst mit 3 Liter lOprozentigem wässrigem Methanol und dann mit 6 Liter 50prozentigem wässrigem Methanol entwickelt. Das dabei enthaltene lOpro-zentige wässrige Methanoleluat wird mit Amberlite® IR-45 (OH~)-Harz auf pH 5,8 bis 6,0 eingestellt. Das Harz wird anschliessend durch Filtrieren abgetrennt. Durch Einengen des Filtrats im Vakuum zu einer wässrigen Phase und Lyophylisie-ren erhält man 595 mg weisses amorphes BM123gamma2 in Form des Hydrochloridsalzes. Das 50prozentige wässrige Methanoleluat stellt man mit Amberlite® IR-45 (OH_)-Harz von pH 4,6 auf 6,1 ein. Anschliessend wird das Harz entfernt. Durch Einengen des Filtrats im Vakuum zu einer wässrigen Phase und anschliessendes Lyophylisieren erhält man 3,645 g an etwas weniger reinem weissem amorphem BM123gamma2 in Form des Hydrochloridsalzes.

Das Antibioticum BM123gamma2 besitzt keinen ausgeprägten Schmelzpunkt, zersetzt sich jedoch bei um 200°C allmählich. Die Mikroanalyse einer Probe, die man vorher 24 Stunden bei einer Temperatur von 21,1°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60% ins Gleichgewicht kommen lässt, ergibt folgende Werte: C = 36,14%; H = 5,67%; N = 15,1%; Cl (ionisch) = 11,11%. Der Gewichtsverlust beim Trocknen beträgt 10,87 %. In Methanol zeigt BM123gamma2 ein UV-Absorptionsmaximum bei 286 nm mit einem Wert E iSi •= 220. Die Lage dieses Maximums ändert sich nicht mit dem pH-Wert. Das BM123gamma2 zeigt eine spezifische Drehung von +60° (c = 0,851 in Wasser).

Das Antibioticum BM123gamma2 weist im Infrarotbereich des Spektrums bei folgenden Wellenlängen eine charakteristische Absorption auf: 770, 830, 870, 950, 980,1035, 1110, 1175,1225,1285,1345,1380,1470,1515,1560,1605,1660, 1755, 2950 und 3350 cm-1. Aus der anliegenden Figur 3 geht ein übliches Infrarotabsorptionsspektrum von BM123gamma2 in einem KBr-Pellet hervor. Die anliegende Figur 5 zeigt ein übliches magnetisches Protonenresonanzspektrum von BM123gamma2, bestimmt an einer D20-Lösung in einem Spektrometer mit 100 Megazyklen.

Beispiel 7

Papierverteilungs- und Düimschichtchromatographie von BM123ß und BM123gamma Die Antibiotica BM123 lassen sich papierchromatogra-phisch voneinander unterscheiden. Zu diesem Zweck bringt man auf Whatman No. 1-Papierstreifen Tupfer von Wasseroder Methanollösungen der jeweiligen Substanzen und äquilibriert das Ganze 1 bis 2 Stunden in Gegenwart von sowohl der oberen als auch der unteren Phase. Die Streifen werden dann über Nacht mit der unteren (organischen) Phase entwickelt, die ein Gemisch von 90prozentigem Phenol : m-Cresol : Essigsäure : Pyridin : Wasser (100 : 25 : 4 : 4 : 75, auf Volumen bezogen) ist. Die entwickelten Streifen werden aus der Chromatographenkammer entnommen, 1 bis 2 Stunden an der Luft getrocknet, zur Entfernung von restlichem Phenol mit Äther gewaschen und auf grossen Agarplatten, die mit Klebsiella pneumoniae, Stamm AD, beimpft sind, bioautographiert. Die dabei erhaltenen typischen Rf-Werte gehen aus der folgenden Tabelle VII hervor:

Tabelle VII

Komponente

Rf-Wert

BM123gamma

0,85

BM123ß

0,50, 0,70

Die ß-Komponente ist ein Gemisch der beiden Antibiotica unter Verwendung dieses Systems. Das BM123ß setzt sich aus einer grösseren Menge eines Antibioticums (Rf = 0,50) mit der Bezeichnung BM123ßi und einer kleineren Menge eines Antibioticums (Rf = 0,70) mit der Bezeichnung BM123ß2 zusammen.

Die Antibiotica BM123 lassen sich ferner auch durch Dünnschichtchromatographie voneinander unterscheiden. Zu diesem Zweck bringt man entsprechende Tupfer eine Wasserlösung der jeweils zu chromatographierenden Substanz (etwa 20 bis 40 Mikrogramm pro Tupfer) auf vorbeschichtete Cellulose F®-Platten (0,10 Millimeter stark) auf, nämlich eine Form einer starken Celluloseschicht, wie sie von EM Laboratories, Inc., Elmsford, New York, geliefert wird. Die Platten werden dann über Nacht mit einem Lösungsmittel entwickelt, das man durch Vermischen von 1-Butanol : Wasser : Pyridin : Essigsäure (15 :12 : 10 :1, auf Volumen bezogen) erhält. Die entwickelten Platten werden anschliessend aus der Chromatographenkammer entnommen und etwa eine Stunde an der Luft getrocknet. Die Detektion der Antibiotica erfolgt entweder unter Verwendung üblicher Ninhydrinreagenzien oder unter Einsatz eines Sakaguchi-Sprühreagens. Die dabei erhaltenen typischen Rf-Werte gehen aus der folgenden Tabelle VIII hervor:

Tabelle VIII

Komponente

Rf-Wert

BM123gamma

0,17, 0,23

BM123ß

0,08, 0,14

Beide Antibiotica BM123ß und BM123gamma sind unter Verwendung dieses Systems Gemische aus zwei Bestandteilen. Das BM123ß setzt sich aus einer grösseren Menge einer Komponente (Rf = 0,08), die als BM123ßi bezeichnet wird, und einer kleineren Menge einer Komponente (Rf = 0,14), die als BM123ß2 bezeichnet wird, zusammen. Die weniger polare Komponente von BM123gamma (Rf = 0,23) ist BM123gammai, und die stärker polare Komponente (Rf = 0,17) ist das BM123gamma2.

Beispiel 8

Allgemeines Verfahren für die reduktive Alkylierung des Antibioticums BM123gamma Eine Suspension von 100 mg Antibioticum BM123gamma in 20 ml Methanol wird unter Rühren mit 5 ml (oder 5 g) des jeweiligen Aldehyds oder Ketons und 100 mg Natriumcyano-borhydrid versetzt. Der pH-Wert der erhaltenen Lösung wird über eine Zeitspanne von 3 bis 24 Stunden mit 0,1 n methanolischem Chlorwasserstoff auf etwa 7,0 gehalten. Die Reaktion wird bis zum Verschwinden von BM123gamma dünn-schichtchromatographisch überwacht. Das Reaktionsgemisch wird anschliessend filtriert, worauf man das Filtrat zur Trockne eindampft. Der Rückstand wird mit 3 ml Methanol behandelt, worauf man das Ganze filtriert. Das Filtrat wird mit 50 ml Aceton verdünnt, und der sich dabei bildende Niederschlag wird durch Filtrieren abgetrennt und dann getrocknet. Das als Lösungsmittel verwendete Methanol lässt sich auch durch 20 ml Wasser ersetzen, sofern die als Ausgangsmaterialien verwendeten Aldehyde oder Ketone in Wasser löslich sind.

Beispiel 9

Herstellung von Methyl-BM123gamma Eine Lösung von 1,0 g BM123gamma und 2,5 ml einer 37prozentigen wässrigen Formaldehydlösung in 50 ml Wasser s

io

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

15

626 895

wird portionsweise mit 400 mg Natriumcyanoborhydrid versetzt. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird während dieser Zugabe mit In Chlorwasserstoffsäure auf 7,0 gehalten. Das Reaktionsgemisch wird anschliessend weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit 20 ml Methanol behandelt, worauf man das Ganze abfiltriert und das Filtrat mit 250 ml Aceton verdünnt. Das dabei ausfallende Produkt wird durch Filtrieren abgetrennt und getrocknet. Die Ausbeute beträgt 667 mg.

Beispiel 10 Herstellung von Isopropyl-BM123gamma Eine Lösung von 200 mg BM123gamma in 30 ml Methanol wird mit 5 ml Aceton versetzt. Anschliessend versetzt man diese Lösung mit 139 mg Natriumcyanoborhydrid und rührt das Reaktionsgemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert des Reaktionsgemisches durch Zugabe von 0,ln methanolischem Chlorwasserstoff auf 7,4 bis 7,8. Die dabei anfallende geringe Menge Niederschlag wird durch Filtrieren abgetrennt, und das Filtrat dampft man dann im Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand wird mit 2 ml Methanol behandelt, worauf man das Ganze filtriert. Das Filtrat wird mit 100 ml Aceton verdünnt, und der dabei erhaltene Feststoff wird durch Filtrieren abgetrennt und -getrocknet. Die Ausbeute beträgt 184 mg.

Beispiel 11

Herstellung von ß-Phenyläthyl-BM123gamma Eine Lösung von 200 mg BM123gamma in 15 ml Wasser und 25 ml Acetonitril wird mit einer Lösung von 2 ml Phenyl-äcetaldehyd in 4 ml Äthanol versetzt. Anschliessend werden 103 mg Natriumcyanoborhydrid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird dann 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, wobei man den pH-Wert des Gemisches mit 0,2 n Chlorwasserstoffsäure auf 7 hält. Anschliessend filtriert man das Reaktionsgemisch und dampft das Filtrat im Vakuum zur Trockne ein. Der erhaltene Rückstand wird mit 2 ml Methanol behandelt, worauf man das Ganze filtriert. Das Filtrat wird mit 100 ml Aceton verdünnt, und das dabei erhaltene Produkt wird durch Filtrieren abgetrennt und getrocknet. Die Ausbeute beträgt 180 mg.

Beispiel 12

Herstellung von l,3,3-Trimethylbutyl-BM123gamma Eine Lösung von 200 mg BM123gamma-HydrochIorid in 50 ml Methanol wird mit 3 ml 4,4-Dimethyl-2-pentanon und 106 mg Natriumcyanoborhydrid versetzt. Die Reaktionslösung hält man durch tropfenweise Zugabe von methanolischem Chlorwasserstoff auf pH 7. Das Reaktionsgemisch wird 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wird im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 3 ml Methanol gelöst, worauf man die Lösung mit 50 ml Aceton verdünnt und filtriert. Die Ausbeute beträgt 125 mg.

Beispiel 13

Herstellung von l-Methylphenyläthyl-BM123gamma Eine Lösung von 200 mg BM123gamma in 50 ml Methanol wird mit 5 ml Phenylaceton versetzt. Anschliessend versetzt man die Lösung mit 170 mg Natriumcyanoborhydrid und rührt das Reaktionsgemisch 3,5 Stunden bei Raumtemperatur. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert des Reaktionsgemisches durch Zugabe von mit Chlorwasserstoffgas gesättigtem Methanol bei 7,0. Das Reaktionsgemisch wird dann auf ein Volumen von etwa 5 ml eingeengt, mit 2 ml Methanol verdünnt und filtriert. Das Filtrat wird anschliessend in 100 ml Aceton gegossen, worauf man den erhaltenen Feststoff durch mit 50 ml Aceton verdünnt und filtriert. Die Ausbeute beträgt 233 mg.

Beispiel 14

Herstellung von l-Methylnonyl-BM123gamma Natriumcyanoborhydrid (100 mg) wird zu einer Lösung von BM123gamma (200 mg) und 2-Decanon (1 ml) in 40 ml Methanol gegeben. Der pH-Wert der Lösung wird durch Zugabe von 0,ln methanolischem Chlorwasserstoffgas auf 7,0 eingestellt und durch bedarfsweise weitere Zugabe dieser Säure auf einen Wert von 7,0±0,2 gehalten. Nach 19,5 Stunden langer Umsetzung filtriert man das Reaktionsgemisch und engt das Filtrat im Vakuum bei 30 °C ein. Der dabei erhaltene Rückstand wird in 5 ml Methanol aufgeschlämmt, worauf man das Ganze filtriert. Das Filtrat wird zu 50 ml Aceton gegeben. Der dabei ausfallende weissliche Niederschlag wird durch Filtrieren abgetrennt, mitnAceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an rohem 1-Methylnonyl-BM 123gamma beträgt 167 mg.

Beispiel 15

Herstellung von l,3-Dimethylbutyl-BM123gamma Eine Lösung von 2,10 mg BM123gamma in 50 ml Methanol wird mit 5 ml Methylisobutylketon versetzt. Anschliessend wird diese Lösung mit 166 mg Natriumcyanoborhydrid versetzt und das Reaktionsgemisch 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert des Reaktionsgemisches mit mit Chlorwasserstoffgas gesättigtem Methanol auf 7,0. Das Reaktionsgemisch wird dann im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit 2 ml Methanol behandelt, worauf man das Ganze filtriert. Das Filtrat wird mit 100 ml Aceton verdünnt, worauf man den abgeschiedenen Feststoff durch Filtrieren abtrennt und trocknet. Die Ausbeute beträgt 210 mg.

Beispiel 16

Herstellung von 2-Norbornyl-BM123gamma Natriumcyanoborhydrid (100 mg) wird zu einer Lösung von BM123gamma (200 mg) und 2-Norboraanon (400 mg) in 40 ml Methanol gegeben. Der pH-Wert der Lösung wird mit 0,ln methanolischem Chlorwasserstoff auf 7,0 eingestellt.

Durch bedarfsweise Zugabe von 0,ln Chlorwasserstoff hält man den pH-Wert bei 7,0±0,2. Nach 21,5 Stunden langer Umsetzung wird das Reaktionsgemisch filtriert und das Filtrat im Vakuum bei 35°C eingeengt. Der Rückstand wird in 5 ml Methanol aufgeschlämmt, worauf man das Ganze filtriert. Das Filtrat wird zu 50 ml Aceton gegeben. Der dabei ausfallende weissliche Feststoff wird durch Filtrieren gesammelt, mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an rohem 2-Norbornyl-BM123gamma beträgt 175 mg.

Beispiel 17 Herstellung von Isopropyl-BM123gammai Fin Gemisch aus BM123gammai, 5 ml Aceton und 60 mg Natriumcyanoborhydrid in 35 ml Methanol wird 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Den pH-Wert der Lösung hält man durch tropfenweise Zugabe von methanolischer Chlorwasserstofflösung bei einem Wert von 7. Das Gemisch wird dann im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit 5 ml Methanol behandelt, worauf man die erhaltene Lösung mit 50 ml Aceton verdünnt. Der dabei erhaltene Niederschlag wird filtriert, gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute beträgt 49 mg.

Beispiel 18 Herstellung von Isopropyl-BM123gamma2 Ein Gemisch aus 41 mg BM123gamma2, 5 ml Aceton und s

10

IS

20

25

30

35

40

45 ■

SO

SS

60

65

626895

16

50 mg Natriumcyanoborhydrid in 35 ml Methanol wird 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Der pH-Wert der Lösung wird durch tropfenweise Zugabe einer methanolischen Chlorwasserstofflösung (gesättigt) bei einem Wert von 7 gehalten. Das dabei erhaltene Gemisch wird filtriert und dann im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit 5 ml Methanol behandelt, worauf man die erhaltene Lösung mit 50 ml Aceton verdünnt. Hierbei erhält man 46 mg Produkt.

Beispiel 19

Herstellung von l-Methyl-2-phenyläthyl-BM123gamma2 Ein Gemisch aus 200 mg BM123gamma2, 5 ml Phenylace-ton und 170 mg Natriumcyanoborhydrid in 50 ml Methanol wird 3,75 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert des Reaktionsgemisches durch tropfenweisen Zusatz einer methanolischen Chlorwasserstofflösung (gesättigt) auf einem Wert von 7. Das Gemisch wird dann im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit 5 ml Methanol behandelt, und die dabei erhaltene Methanollösung verdünnt man dann mit etwa 50 ml Aceton. Auf diese Weise erhält man 233 mg Produkt.

Beispiel 20 ■

Herstellung von 2-Äthylcyclopentyl-BM123gamma Eine Lösung von 200 mg BM123gamma, 3 ml 2-Äthylcy-clopentanon und 101 mg Natriumcyanoborhydrid in 50 ml Methylalkohol belässt man 18 Stunden bei Raumtemperatur. Während dieser Zeit wird der pH-Wert der Lösung durch Zugabe einer gesättigten Lösung von Natriumchlorid in Methanol auf einem Wert von 7-gehalten. Das Reaktionsgemisch wird dann zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit 3 ml Methanol behandelt, worauf man das Ganze filtriert und das Filtrat mit 40 ml Aceton verdünnt. Hierbei erhält man 157 mg Produkt.

Beispiel 21

Herstellung von 3,5-Dimethylcyclohexyl-BM123gamma Eine Lösung von 200 mg BM123gamma, 5 ml 3,5-Dime-thylcyclohexanon und 200 mg Natriumcyanoborhydrid in 50 ml Methanol wird eine Stunde bei Raumtemperatur belassen. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert der Lösung durch Zugabe einer gesättigten Lösung von Natriumchlorid in Methanol bei einem Wert von 7. Das Reaktionsgemisch wird dann mit 3 ml Methanol behandelt und abfiltriert, worauf man das Filtrat mit 40 ml Aceton verdünnt. Hierbei erhält man 200 mg Produkt.

Beispiel 22

Herstellung von 2,4-Dimethylcyclopentyl-BM123gamma Eine Lösung von 206 mg BM123gamma, 3 ml 2,4-Dime-thylcyclopentanon und 104 mg Natriumcyanoborhydrid in 50 ml Methanol wird 6 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert der Lösung durch Zugabe einer gesättigten Lösung von Natriumchlorid in Methanol auf einem Wert von 7. Das Reaktionsgemisch wird dann mit 3 ml Methanol behandelt und abfiltriert, worauf man das Filtrat mit 40 ml Aceton verdünnt. Die Ausbeute an gewünschtem Produkt beträgt 101 mg.

Beispiel 23

Herstellung von 2-Äthylcyclohexyl-BM123gamma Eine Lösung von 200 mg BM123gamma, 5 ml 2-Äthylcy-clohexanon und 213 mg Natriumcyanoborhydrid in 50 ml Methanol wird 3 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Wäi rend dieser Zeit hält man den pH-Wert der Lösung durch Zugabe einer gesättigten Lösung von Natriumchlorid in Methanol auf 7. Das Reaktionsgemisch wird dann mit 3 ml Methanol behandelt und filtriert, worauf man das Filtrat mit 40 ml Aceton verdünnt. Hierbei erhält man die Titelverbindung in einer Ausbeute von 200 mg.

Beispiel 24

Herstellung von 3-Methylcyclohexyl-BM123gamma Eine Lösung von 200 mg BM123gamma, 1,5 ml 3-Methyl-cyclohexanon und 200 mg Natriumcyanoborhydrid in 50 ml Methanol wird 2 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Wäh rend dieser Zeit hält man den pH-Wert der Lösung durch Zugabe einer gesättigten Lösung von Chlorwasserstoff in Methanol auf 7. Das Reaktionsgemisch wird dann mit 3 ml Methanol behandelt und filtriert, worauf man das Filtrat mit 40 ml Aceton verdünnt. Hierbei erhält man die Titelverbindung in einer Ausbeute von 200 mg.

Beispiel 25

Herstellung von 2,4,4-Trimethylcyclopentyl-BM123gamma Eine Lösung von 200 mg BM123gamma, 5 ml 2,4,4-Trime thylcyclopentanon und 179 mg Natriumcyanoborhydrid in 50 ml Methanol wird 24 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert der Lösung durch Zugabe einer gesättigten Lösung von Natriumchlorid in Methanol auf 7. Das Reaktionsgemisch wird dann mit 3 ml Methanol behandelt und filtriert, worauf man das Filtrat mit 40 ml Aceton verdünnt. Hierbei erhält man die gewünschte Verbindung in einer Ausbeute von 176 mg.

Beispiel 26

Herstellung von 2-Propylcyclohexyl-BM123gamma Eine Lösung von 200 mg BM123gamma, 3 ml 2-Propylcy-clohexanon und 157 mg Natriumcyanoborhydrid in 50 ml Methanol wird 4 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert der Lösung durch Zusatz einer gesättigten Lösung von Natriumchlorid in Methanol auf 7. Das Reaktionsgemisch wird dann mit 3 ml Methano behandelt und filtriert, worauf man das Filtrat mit 40 ml Aceton verdünnt. Die Ausbeute an gewünschtem Produkt beträgt hierbei 75 mg.

Beispiel 27

Herstellung von 2-Methylcyclopentyl-BM123gamma Eine Lösung von 211 mg BM123gamma, 3 ml 2-Methylcy-clopentanon und 98 mg Natriumcyanoborhydrid in 50 ml Methanol wird 3,5 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert der Lösung durch Zugabe einer gesättigten Lösung von Natriumchlorid in Methanol auf 7. Das Reaktionsgemisch wird dann mit 3 ml Methanol behandelt und filtriert, worauf man das Filtrat mit 40 ml Aceton verdünnt. Hierbei erhält man die Titelverbindung in einer Ausbeute von 157 mg.

s

10

IS

20

25

30

35

40

45

50

55

60

B

3 Blatt Zeichnunge

Claims (4)

1. 626895 2

   PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung neuer Alkyl- und substituierter Alkyiderivate der Antibiotica BM 123 gamma 1, gamma 2 und deren Gemische, sowie deren Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, dass man besagte Antibiotica oder besagte s Gemische mit einem Aldehyd oder einem Keton der Formel:

   O

   II

   Ri-CHO oder R2-C-R3, 10

   worin

   Ri für Wasserstoff, Niederalkyl, halogensubstituiertes Nieder-alkyl, Niederalkenyl, Phenyl, monosubstituiertes Phenyl, Phe-nylniederalkyl, Styryl, 2-Furyl, methylsubstituiertes 2-Furyl, 15 2-Thienyl, methylsubstituiertes 2-ThienyI, 2-Pyrryl, methylsubstituiertes 2-Pyrryl, 2-Pyridyl oder 2-Chinolyl steht. R2 Niederalkyl bedeutet und

   R3 für Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, N-N-Dipropyl-aminomethyl, 2-Chloräthyl, Benzyl, Styryl, Cyclohexyl, 4- 20 Methylpenten-3-yl, 1,3-Dimethylhexyl, ß-Indolylmethyl, CycIopenten-2-ylmethyl, n-Heptyl, n-Octyl, (o-Tolylcarba-moyl)-methyl, Propenyl, Methoxymethyl, Cyclohexylmethyl, 2-(4-Hydroxyphenyl)äthyl, n-Nonyl, n-Dodecyl, 2-Methoxyvi-. nyl, l-Methyl-2-hydroxyäthyl, 3,4-Dimethoxybenzyl, N,N- 2S Diäthylaminoäthyl, Carbäthoxychlormethyl, 1-Methyl-l-hydroxyäthyl, 4-Chlorbenzyl, (t-Butylcarbamoyl)methyl, Dimethoxymethyl, 2-, 3- oder 4-Methoxybenzyl, Phenoxyme-thyl, Äthinyl, N,N-Dimethylaminomethyl, N,N-DiäthyIamino-

   propyl, Cyclopropyl, 2,2-Dimethoxyäthyl, Acetonyl, ß-Phenyl-äthyl, 3-Chlorpropyl, 2-Chlorbenzyl, 3-Chlorbenzyl, Buten-3-yl, 1-Acetamidoäthyl, 3-Pyridyl, Carbäthoxymethyl, 5-Norbor-nen-2-yl, Cyclopentyl, 1-Carbäthoxyäthyl, 1-Hydroxyäthyl, 3-Hydroxypropyl, Chlormethyl, Isobut-2-enyl, Phenyl, m-Chlor-phenyl, p-Bromphenyl, p-Trifluormethylphenyl, m-Nitrophe-nyl oder p-Dimethylaminophenyl, oder R2 und R3 zusammen mit der Methylidingruppe Cyclobutyl, Cyclopentyl, Monomethylcyclopentyl, 2,4-DimethyIcyclopen-tyl, 2,4,4- oder 1,3,3-Trimethylcyclopentyl, Cyclohexyl, 3-Methylcyclohexyl, 3,5-Dimethylcyclohexyl, Cycloheptyl, Cyclooctyl, Cyclononyl, 2,2,4,4-Tetramethylcyclopentyl, 2-Cyclopentyl-cyclopentyl, 3-tert.Pentylcyclopentyl, 2-(l-Cyclo-hexen)cyclohexyl, 2-Cyclohexylcyclohexyl, 2-ÄthylcyclohexyI, 2-Propylcyclohexyl, 4-Tetrahydrothiopyranyl, 2-ÄthylcycIo-pentyl, 3-Methyl-6-isopropyl-cyclohexyl, 3,3-Dimethylcyclo-hexen-4-yl, 2-Phenyl-cyclohexyl, 2-Cyclohexenyl, 4-t.-Butyl-cyclohexyl, 2-Äthylidencyclohexyl, Decahydro-l-methyl-2-naphthyl, Decahydro-3-methyl-2-naphthyl, l-Benzyl-4-piperi-dyl, l-Methyl-4-piperidyl, Bicyclo[3.2.1]-octan-2-yl, 3-Chinu-clidinyl, 5-Methoxy-2-tetralyl, 2-Adamantyl oder 2-Norbomyl bedeuten,

   reduktiv alkyliert, wobei mit Aldehyden je nach Menge der Reagenzien die endständige Aminogruppe einfach oder zweifach und die dieser proximal stehende sekundäre Aminogruppe nicht oder auch alkyliert wird und mit Ketonen die endständige Aminogruppe einfach alkyliert wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von Verbindungen der Formeln:

   0

   r. \ trans |1

   VCH=CH-C-NH-(CH2)
3. 3-NH-CCHa) »-NH-SHa-Ri

   (I)

   0

   „ XX trans II ^ CH2-RX

   R-// XVCH=CH-C-NH-(CH2)3-NH-(CHz)^-Nn

   CH2-RI

   (II)

   • 0 CH2-RI

   f. \ trans |] I

   R-v^ >CH=CH-C-NH- (CH2)3-N- (CH2) 4-NH-CH2-

   Rj

   (HD oder

   0 CH2-R1

   r—n trans || | ^.CHz-Ri

   R-C XVCÎ^CH-C-NH-(CH2)3-N-(CH2)U-NX

   CH2-RI

   (IV)

   626 895

   worin Ri die obige Bedeutung hat und R einen Rest der Formeln oder

   H

   H / 0\ / 0 H

   r» V, V» N

   CH-

   0

   II 0

   N

   .OH

   NH .

   I

   •C=0

   I

   NH_

   Vi

   H

   NH

   I

   C=0

   I

   NHo

   \ OH

   NH-C-Ì1N V II O

   0\j i

   0 —

   H

   NH

   I

   C=NH

   I

   NH-

   bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Amin der Formel

   R

   0

   /.: i.\ trans ||

   (f CH=CH-C-NH-(CH2) 3-NH-(CH2) 4~NH2 #

   worin R die oben angegebene Bedeutung hat, mit einem Aldehyd der Formel Ri-CHO,

   worin Ri obige Bedeutung besitzt, in Gegenwart eins Reduk- chende Zeitspanne alkyliert.

   tionsmitels in einem gegenüber den Reaktanten inerten so 3. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von Verbin-

   Lösungsmittel über eine für die reduktive Alkylierung ausrei- düngen der Formel:

   O

   R

   trans Jf

   ^_J^-ch=ch-c-nh-(ch2) 3-nh- (ch2) 4-n-ch^

   r2

   worin R, R2 und R3 die obigen Bedeutungen haben, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Amin der Formel:

   O

   trans

   R

   /7~~\ trans ||

   y-CH=CHrC-NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH2

   worin R obige Bedeutung hat, mit einem Keton der Formel:

   626895

   O

   II

   R2-C-R3

   worin R2 und R3 die oben angegebenen Bedeutungen haben, in Gegenwart eines Reduktionsmittels in einem gegenüber den Reaktanten inerten Lösungsmittel über eine für die reduktive Alkylierung ausreichende Zeitspanne alkyliert.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1,2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass man erhaltene Verbindungen durch Umsetzung mit einer Säure in das entsprechende Salz überführt.