NO754011L - - Google Patents

Abstract

"Fremgangsmåte for fremstilling av antibakterielle alkylerte derivater av antibiotikum BM123"

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en ny gruppe antibiotika og vedrører særlig en ny serie av•sterkt virkende antibakterielle midler som fremstilles ved reduktiv alkylering av antibiotikum BM123V med et aldehyd eller keton med de følgende generelle formler:

hvor R, er hydrogen, lavere alkyl, halogensubstituert lavere alkyl, lavere alkenyl, fenyl, monosubstituert fenyl, fenyl-lavere alkyl, 2-furyl, metylsubstituert 2-furyl, 2-tienyl, metyl-substituert 2-tienyl, 2-pyrryl, metylsubstituert 2-pyrryl, 2- pyridyl eller 2-kinoly.l; R 2 er lavere alkyl, halogen-substituert lavere alkyl eller fenyllavere-alky1; er lavere alkyl, halogensubstituert lavere alkyl, lavere alkenyl, lavere

cykloalkyl, fenyl, monosubstituert fenyl, fenyl-lavere-alkyl eller monosubstituert fenyl-lavere-alkyl; og R2og R3danner sammen tetrametylen, pentametylen eller heksametylen. Egnede lavere alkyl- og halogensubstituerte lavere alkylgrupper ifølge foreliggende oppfinnelse er forbindelser som inneholder opptil 6 karbonatomer hvor halogen kan være klor, brom og jod,

metyl, etyl, isopropyl, sek-butyl, n-amyl, diklormetyl, 2-brom-etyl, 2,3-dijodpropyl, y-klorpropyl etc.Egnede lavere alkenyl-grupper er forbindelser som inneholder opptil 4 karbonatomer, slik som vinyl, allyl, propenyl, isopropenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3- butenyl, isobutenyl etc. Egnede lavere cykloalkylgrupper er cyklopentyl, cykloheksyl og cykloheptyl. Egnede'monosubstituerte

fenylgrupper ifølge foreliggende oppfinnelse er f.eks. p-acetamidofenyl, m-nitrofenyl, m-merkaptofenyl, o-anisyl, p-anisyl, o-tolyl, p-tolyl og lignende, mens fenyl-lavere-

alkyl kan være benzyl, a-fenyletyl og B-fenyletyl. Egnede monosubstituerte fenyl-lavere alkylgrupper er o-, m- eller p-klorbenzyl, a-(p-aminofeny1)etyl, 3-(m-nitrofenyl)etyl etc. Egnede metylsubstituerte 2-furyl, 2-tienyl og 2-pyrrylgrupper er f.eks. 5-metyl-2-f ur.yl, 3 , 4-dimetyl-2-f uryl, 4-metyl-2-tienyl, 3,5-dimetyl-2-tieny1, 5-metyl-2-pyrryl, 1,3,4-trimetyl-2-pyrryl og lignende.

Den reduktive alkylering for fremstilling av nye antibakterielle midler ifølge foreliggende oppfinnelse kan utføres som følger. Antibiotisk BM12 3/, BMl23v1eller BM123/2 oppløses i et egnet løsningsmiddel, slik som vann, metanol, metylcellosolve eller blandinger derav, tilsettes derefter et overskudd ut over en ekvimolar mengde av ønsket aldehyd eller keton, efterfulgt av tilsetning av en tilstrekkelig reduserende mengde av natriumcyanoborhydrid. pH av reaksjonsblandingen holdes ved 6,0-8,0 med fortynnet mineralsyre i løpet av reaksjonen. Efter 1 til 24 timer ved omgivelsestemperatur (10-35°C) fordampes reaksjonsblandingen til tørrhet i vakuum og resten tritureres med metanol og filtreres. Filtratet fortynnes med aceton og det faste produktet som faller ut fjernes ved filtrering og tørkes i vakuum.

Aldehyder som kan anvendes ved fremgangsmåten er f.eks. acetaldehyd, propionaldehyd, butyraldehyd, isobutyraldehyd, krotonaldehyd, valeraldehyd, benzaldehyd, p-cyanobenzaldéhyd, salicylaldehyd, cinnamaldehyd, trikloracetaldehyd etc.

Ketoner som kan anvendes ved fremgangsmåten er f.eks. aceton, 2-butanon, 1,3-dibromaceton, kloraceton, acetofenon, m-klor-acetofenon, p-bromacetofenon, p-trifluormetylacetofenon, m-nitroacetofenon, p-dimetylaminoacetofenon, etc.

Produktene oppnås fra reaksjonsblandingene efter den reduktive alkyleringen efter standard fremgangsmåter slik som utfelning, konsentrering, løsningsmiddelekstraksjon eller en kombinasjon av disse metoder. Efter isolering kan produktene renses efter kjente rensemetoder. Disse omfatter rekrystalli-sasjon fra forskjellige løsningsmidler og blandede løsnings-middelsystemer, kromatografiske teknikker og motstrømsfordeling og alle disse kan vanligvis anvendes for formålet.

De nye antibakterielle midler ifølge foreliggende oppfinnelse er organiske baser og kan således danne syreaddisjonssalter med en rekke organiske og uorganiske saltdannende reagenser. Syreaddisjonssalter, fremstilt ved blanding av den antibakterielle frie basen med opptil tre ekvivalenter av en syre, passende i et nøytralt løsningsmiddel dannes således med slike syrer som svovelsyre, fosforsyre, hydrogenklorid, hydrogenbromid, sulfaminsyre, sitronsyre, maleinsyre, fumarsyre, vinsyre, eddik, benzoesyre, glukonsyre, askorbinsyre og beslektede syrer. Syreaddisjonssalter av antibakterielle midler ifølge foreliggende oppfinnelse er vanligvis krystalline, faste stoffer som er relativt løselige i vann, metanol og etanol, men er relativt uløselige i ikke-polare, organiske løsningsmidler slik som dietyleter, benzen, toluen og lignende. For formålene ifølge foreliggende oppfinnelse er de antibakterielle frie baser ekvivalente med deres ikke-giftige syreaddisjonssalter.

Antibiotika' som betegnes BM1233-L, BM12302 , BM123t1 og BM123Y2fremstilles ved dyrkning under regulerte betingelser

av en ny stamme av ikke-identifiserte arter av Nocardia. Denne nye, antibiotikum-produserende stamme ble isolert fra havejord uttatt vedOceola, Iowa og finnes i kultursamlingen hos Lederle Laboratories DiVision, American Cyanamid Company,

Pearl River, New York, som kultur nr. BM12 3. En levedyktig stamme av den nye mikroorganismen er deponert i Culture Collection Laboratory, Northern Utilization Research and Development Division, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, og.er inkludert i den .permanente samlingen. Den er fritt tilgjengelig, for offentligheten på deponeringsstedet under assesjonsnummeret NRRL 5646. BM1233 betegner en blanding i hvilket som helst forhold av BM123B1og BM12332, og BMl23y betegner en blanding i hvilket som helst forhold av BM123y-^og BM123Y2*

I det følgende gis en generell beskrivelse av mikroorganismen Nocardia sp., NRRL 5646 basert på observerte

diagnostiske egenskaper. Det ble gjort observasjoner av kultur-, fysiologiske og morfologiske trekk av organismen efter metoder som er beskrevet i detalj av Shirling og Gottlieb, Internat. Journ. of Syst. Bacteriol..16: 213-240 (1966). Den kjemiske sammensetningen av kulturen ble bestemt efter fremgangsmåter angitt av Lechevalier et al., Advan. Appl. Microbiol. 47-72

(1971). De understrekne farveangivelser og farveprøvebetegnelser

er tatt fra Jacobson et al., Color Harmony Manual, 3. utg.

(1948), Container Corp. of America, Chicago, Illinois.

Detaljer er angitt i tabellene I-V nedenfor.

Vekst

Moderat på gjærekstrakt, asparagin-dekstrose,

Benedicts, Bennetts, potets-dekstrose og Weinsteins agarer; ubetydelig på Hickey og Tresners, tomatpasta, havremel og pablumagarer, og spor av vekst på uorganiske salter-stivelse, Rusters havreflak, Czapeks løsning og risagarer.

Luft- mycelium

Hvitaktig luftmycelium når det finnes; fremstilt bare

på gjærekstrakt, asparagin-dekstrose, Benedicts, Bennetts og potet-dekstrose-agarer.

Løselige pigmenter

Det fremstilles ingen løselige pigmenter.

Revers farve

Farveløse til gulaktige nyanser.

Forskjellige fysiologiske reaksjoner

Gelatin blir ikke flytende; nitrater reduseres til nitriter på 7 dager; melanoide pigmenter dannes ikke på pepton-jernagar; ingen peptonisering eller ostedannelse i skummet melk; NaCl-toleranse i gjærekstraktagar >4% men <7%; optimal veksttemperatur 32°C. Utnyttelse av karbonkilde efter Pridham og Gottlieb-metoden (J. Bacteriol. 56: 107-114 (1948))

som følger: God utnyttelse av glycerol, salicin, d-trehalose og dekstrose; forholdsvis god utnyttelse av i-inositol og dårlig til ingen utnyttelse av d-fruktose, maltose, adonitrol, 1-arabinose, laktose, d-mannitol, d-melibiose, d-raffinose, 1-rhamnose, sukkrose og d-xylose.

Kjemisk sammensetning

Organismen hører til celleveggtype IV, dvs. inneholder meso-2,6-diamihopimelinsyre og har type A hel-celle sukker-mønster, dvs. inneholder arabinose og galaktose. Metylerte helcelle-ekstrakter viser, når de underkastes gasskromatografi, fettsyremønstre som ligner på de som man får av Nocardia asteroides ATCC 3308.

Mikromorfologi

Luft-myceliet som oppstår fra substratmycelium er lite forgrenede, moderat lange buktede elementer som vanligvis av-sluttes i forlengede primitive spiraler. De buktede elementer

■er uregelmessig segmentert i korte elliptiske til sylindriske deler (sporer?) som lett splittes opp. De spiralformede ende-delene er mindre tydelig segmenterte. Segmentene ligger vanligvis i området 0,8-l,7ym x 0,3-0,5 ym, gjennomsnittlig 0,4 ym x 1,2 ym.

Diagnose

De morfologiske egenskaper av kultur nr. BM123 er vanskelig å observere og fortolke, på grunn av dårlig utvikling av luftmycelium på de fleste.media. Den kjemiske analyse er således nødvendigvis av stor betydning for å bestemme organismens genetiske slektskap. På grunnlag av systemet som er foreslått av Lechevalier et al., inneholder kultur nr. BM123 meso-2,6-diaminopimelinsyre i helcellene og sukkeranalyser viser at det finnes arabinose og galaktose. Kulturen tilhører derfor celleveggtype IV. En sammenligning av gasskromatografimønsteret av kultur nr. BM 123 med gasskromatografimønsteret av Nocardia asteroides AT.CC 3308 viste at de to var bemerkelsesverdig like. Andre egenskaper av kultur nr. BM12 3 som stemmer overens med forestillingen om Nocardia er dens fragmenterende luftvekst på noen medier og den totale mangel på luftvekst på de fleste medier. I betraktning av at man mangler passende kriterier for karakterisering av Nocardia til artsnivået, er det ikke gjort noe forsøk på å utføre denne bestemmelsen. Kultur nr. BM123 vil derfor bli betraktet som en ikke bestemt art av Nocardia inntil en slik diagnose er mulig.

Fremstillingen av BM12 33 og BMl23y er ikke begrenset til denne spesielle organismen eller til organismer som helt ut til-svarer den angitte vekst og mikroskopiske egenskaper, som kun er gi-tt for å vise formålene. I virkeligheten kan det. også anvendes mutanter som er fremstilt fra denne organisme ved hjelp av forskjellige midler slik som anvendelse av røntgenstråling, ultrafiolett stråling, nitrogen-sennepsgass, actinofager o.l. En levedyktig kultur av en slik typisk mutantstamme er deponert i Culture Collection Laboratory, Northern Utilization Research and Development Division, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, og er blitt innlemmet i den permanente samlingen under assesjonsnummeret NRRL 8050. Skjønt kultur-, fysiologiske og morfologiske trekk av NRRL 8050 er hovedsakelig de samme som for NRRL 5646, gir den større mengder av MBl23y ved aerob fermentering. NRRL 8050 er også forskjellig fra NRRL 5646 som den stammer fra: (a) langsommere reduksjon av nitrater til nitriter, og (b) gir et rosentrefarvet, gulbrunt myceliepigment på Bennetts- og gjærekstraktagarer.

De nye antibakterielle midler ifølge foreliggende oppfinnelse er vanligvis krystallinske, faste stoffer av relativt begrenset løselighet i ikke-polare løsningsmidler, slik som dietyleter og heksan, men betraktelig mer løselige i løsnings-midler slik som vann og lavere alkoholer. Antibiotika BMl23y^og BM123Y2er strukturisomerer og har de følgende struktur-formler:

Den reduktive alkylering av BM123Yog BM123y-l eller BM123Y2me<^ betoner finner sted på spermadin-sidekjeden, og man får derivater av formelen:

og R 2 og R- er som angitt ovenfor. Den reduktive alkylering av BM123Y, BM123Y-L eller BM123y2med aldehyder finner sted på spermadin-sidekjeden, og man får mono-, di- og tri-substituerte derivater av formlene:

hvor R og R^er som angitt ovenfor.

Anvendelsen av de alkylerte derivater av BMl2 3y fremgår av deres evne til å regulere systemisk dødelige infeksjoner hos mus. Disse nye forbindelser har høy in vivo antibakteriell virkning hos mus mot Escherichia coli US311 når de administreres ved en enkel subkutan dose til grupper av mus av typen Carworth Farms CF-1, vekt ca. 20 g, som er infisert intra-peritonealt med en dødelig dose av denne bakterie i en 10 -3 tryptikase-soyabuljong-TSP-fortynning av en 5 timers TSP-blodkultur. I tabell VI nedenfor er angitt in vivo virkningen av typiske forbindelser ifølge oppfinnelsen (fremstilt fra de angitte karbonylreagenser) motEscherichia coli US311 hos mus. Virkningen er angitt som ED^q eiler dosen i mg/kg legemsvekt

som er nødvendig for å beskytte 50% av musene mot E. coli.

Valgt fermenteringsprosess for fremstilling av hovedsakelig BM1233 og BMl23y

Dyrkningen av Nocardia sp. NRRL 8050 kan utføres i en rekke flytende kulturmedier. Medier som er egnede for fremstilling av antibiotika omfatter en assimilerbar karbonkilde slike som stivelse, sukker, molasse, glycerol etc.; en assimilerbar nitrogenkilde slik som protein, proteinhydrolysat, polypeptider, aminosyrer, maisstøpevæske etc; og uorganiske anioner og kationer, slik som kalium, magnesium, kalsium, ammonium, sulfat, karbonat, fosfat, klorid etc. Sporelementer slik som bor, molybden, kobber etc. tilføres som forurensninger i andre bestanddeler av mediet. Gjennomlufting av tanker og kolber skjer ved å presse steril luft gjennom eller ned mot overflaten av fermenteringsmediet. Ytterligere omrøring i tankene utføres av mekaniske skovlhjul. Det kan om nødvendig tilsettes et anti-skumningsmiddel, slik som "Hodag FD82".

Pode- preparat for BM1233 og BM123y

Primært rystekolbe-podestoff av Nocardia sp. NRRL 8050 fremstilles ved å pode 100 ml sterilt, flytende medium i 500 ml kolber med utskrapninger eller utvaskninger av sporer fra et skrått-stivnet agarsubstrat av kulturen. Det følgende medium anvendes vanligvis:

Kolbene inkuberes ved en temperatur fra 25-29 C, fortrinnsvis 28°C, og omrøres kraftig i et roterende rysteapparat i 30-48 timer. Podestoffet overføres til sterile-kulturglass med skrukork og lagres ved temperaturer lavere enn-18°C. Dette forrådet av vegetativt podestoff anvendes istedenfor utskrapninger av skråstivnet substrat for podning av ytterligere rysteflasker for fremstilling av første trinns podestoff.

Disse kolbepodestoffer i første trinn anvendes for å pode 12 liters satser av samme medium i glassfermenterings-apparater på 20 liter. Podestoffmassen tilføres steril luft mens veksten fortsetter i 30-48 timer.

12 liters satsene av podestoff i annet trinn anvendes for å pode fermenteringstankene som inneholder.300 liter av det følgende sterile, flytende medium for fremstilling av podestoff i tredje og siste trinn:

Tredjetrinns podestoff g j ennomluf.tes med 0,4-0,8 liter steril luft pr. liter buljong pr. minutt, og fermenterings-blandingen omrøres ved hjelp av et skovlhjul som drives med 150-300 omdr./min. Temperaturen holdes ved 25-29°C, vanligvis 28°C. Veksten fortsetter i 48-72 timer, og derefter anvendes podestoffet for å pode en 3000 liters fermenteringstank.

Tankfermentering av BM1233 og BMl23y

For fremstilling av BM1233 og BM123y i fermenteringstanker anvendes fortrinnsvis det følgende fermenteringsmedium:

Hver tank podes med 5-10% av podestoffet fra tredje trinn fremstilt som angitt under podestoff-fremstillingen. Fermenteringsmassen holdes ved en temperatur på 25-28°C, vanligvis 26°C. Massen gjennomluftes med steril luft i en mengde på 0,3-0,5 liter steril luft pr. liter masse pr. minutt og omrøres med et skovlhjul som drives ved 70-100 omdr./min. Massen oppnås efter fortsatt fermentering i 65-90 timer.

Oppfinnelsen illustreres ytterligere av de følgende eksempler.

Eksempel 1

Podestoff- fremstilling fo r BM12 3B og BM123

Et typisk medium som anvendes for vekst av podestoff i første og annet trinn ble fremstilt efter følgende formulering:

To 500 ml flasker som hver inneholder 100 ml av det ovenfor nevnte sterile medium ble podet med 5 ml hver av et frosset, vegetativt podestoff av Nocardia sp. NRRL 8050. Flaskene ble plasert i et roterende rysteapparat og rystet kraftig i 48 timer ved 28°C Det resulterende kolbepodestoff ble overført til et 18,9 liters fermenteringsapparat av glass som inneholder 12 liter av det sterile medium ovenfor. Massen ble gjennomluftet med steril luft og veksten ble utført i

48 timer, og derefter ble innholdet anvendt for å pode en

378 liters fermenteringstank som inneholder 300 liter av det følgende sterile, flytende medium:

Tredjetrinns podestoffmasse ble gjennomluftet med steril luft som ble innført i fermenteringsapparatet i en mengde på 0,4 liter luft pr. liter masse pr. minutt. Omrøringen ble ut-ført ved hjelp av et skovlhjul ved 240 omdr./min. Massen ble holdt ved 28°C og det ble anvendt "Hodag FD82" som skumhindringsmiddel. Efter 48 timers veksttid ble podestoffmassen anvendt for å pode en 3000 liters fermentering.

Eksempel 2

Fermentering ved anvendelse av Nocardia sp. NRRL 8050 og medium som begunstiger fremstilling av BM1233 og BMl23y

Det ble fremstilt et fermenteringsmedium efter følgende formulering:

Fermenteringsmediet ble sterilisert ved 120 C med damp méd et trykk på 1,4 kg/cm 2 i 60 minutter. pH av mediet efter steriliseringen var 6,9. 3000 liter av sterilt medium i en 4000 liters fermenteringstank ble podet med 300 liter podestoff slik.som angitt i eksempel 1, og fermenteringen ble utført ved 26°C og det ble anvendt 'Hodag FD82" som skumhindringsmiddel. Gjennomluftningen var 0,35 liter steril luft pr. liter masse

pr. minutt. Massen ble omrørt ved hjelp av et skovlhjul ved 70-72 omdr./min. Massen ble oppnådd efter 67 timers fermentering.

Eksempel 3

Isolering av BM123& og BM123Y

En 3000 liters porsjon av fermenteringsmasse, fremstilt som angitt i eksempel 2, pH 4,3, ble justert til pH 7,0 med natriumhydroksyd og filtrert under anvendelse av 5% diatoméjord som filtreringsmiddel. Kaken ble vasket med 100 liter vann og kastet. Det kombinerte filtrat og vaskevann ble pumpet opp-over gjennom tre parallelle, 20,9 cm x 121,9 cm rustfrie stål-kolonner som hver inneholder 15 liter "CM Sephadex C-25 [Na<+>]"-harpiks (en tverrbundet dekstra-epiklorhydrin-kationvekslergel, Pharmacia Fine Chemicals, Inc.). De belastede kolonner ble vasket med totalt ca. 390 liter vann og ble derefter fremkalt med 200 liter 1% vandig natriumklorid, efterfulgt av 560 liter

5% vandig natriumklorid. Det 5% vandige natriumklorideluatet ble klaret ved filtrering gjennom diatoméjord og det klarede filtratet ble ført gjennom en 22,9 cm x 152 cm glasskolonne som inneholder 25 liter granulær "Darco G-60" (20-40 mesh)

(et granulær aktivert karbon, Atlas Chemical Industries, Inc.).

Den belastede kolonnen ble vasket med 120 liter vann og ble derefter fremkalt med 120 liter av en 15% vandig metanolløsning efterfulgt av 340 liter av en 50% vandig metanolløsning og derefter av 120 liter av en 50% vandig acetonløsning. Det 15% vandige metanoleluatet ble konsentrert i vakuum til ca. 7 liter av en vandig fase og pH ble justert fra 4,5 til 6,0 med "Amberlite IR-45 (OH )"-harpiks (en svakt basisk anionveksler-harpiks av polystyren-polyamin-typen). Harpiksen ble fjernet ved filtrering og filtratet ble konsentrert i vakuum til

ca. 1 liter og ble derefter lyofilisert, og man får 38 g av et materiale som hovedsakelig består avBM1233, sammen med en liten mengde av BM123y (hovedsakelig BMl23y2). Det 50% vandige metanoleluatet ble justert fra pH 4,65 til 6,0 med "Amberlite IR-45 (OH )"-harpiks. Harpiksen ble fjernet ved filtrering og filtratet ble konsentrert i vakuum til ca. 6,3 liter og ble derefter lyofilisert, og man får 213 g av et materiale som hovedsakelig består avBM123y. Det 50% vandige acetoneluatet ble justert fra 4,0 til 6,0 med "Amberlite IR-45 (0H~)"-harpiks. Harpiksen ble fjernet ved filtrering og filtratet ble konsentrert

i vakuum til ca. 1,5 liter og ble derefter lyofilisert, og man får 56 g av urenset BM123y.

Eksempel 4

Ytterligere rensning av BM123y

En suspensjon av "CM Sephadex C-25 (NH^<+>)" i 2% vandig ammoniumklorid ble hellet ned i en glasskolonne med en diameter på 2,6 cm til en harpikshøyde på ca. 62 cm. Overskuddet av 2% vandig ammoniumklorid ble tappet av og en 5,0 g prøve av BMl23y fremstilt som angitt i eksempel 3 ble oppløst i ca. 10 ml av 2% vandig ammoniumklorid og tilført kolonnen. Kolonnen ble derefter eluert med en gradient mellom 6 liter av hver av■

2%ig og 4%ig vandig ammoniumklorid. Det ble hvert 15. minutt automatisk oppsamlet fraksjoner på ca. 75 ml. Antibiotisk BM123y ble lokalisert ved å styre kolonneutløpet i ultrafiolett og ved bioautografi av neddykkede papirskiver på store agarplater som var podet med Klebsiella pneumoniae stamme AD. Størsteparten av BM123y var i fraksjonene 71-107.

130 ml av granulær "Darco G-60" (2040 mesh) ble

suspendert i vann, overført til en glasskolonne, fikk lov til å sedimentere og overskuddet av vann ble tappet av. Fraksjonene 84-96

fra CM-Sephadex-kromatografien ovenfor ble slått sammen og ført gjennom den granulære karbonkolonnen. Den belastede kolonnen ble vasket med 600 ml vann og ble derefter fremkalt med 1 liter av 50% vandig aceton. Eluatene, som begge, inneholder BM12 3y,

ble konsentrert til vandige faser i vakuum og lyofilisert, og man får totalt 886 mg BMl23y som hydrogenkloridsalt. En mikroanalytisk prøve ble oppnådd ved å underkaste materialet ovenfor en gjentagelse av prosessen.

Antibiotisk BM12 3y har ikke et bestemt smeltepunkt, men gradvis spaltning begynner i nærheten av 200°C Mikroanalyse av en prøve som er bragt i likevekt i løpet av 24 timer ved 22°C

i en atmosfære som inneholder 23% relativ fuktighet, ga C 39,44%, H 6,10%, N 16,19%, Cl (ionisk) 11,54%; tørketap 8,19%.

1 %

BMl23y ga. et U.V.-absorpsjonsmaksimum ved 286 nm med E^ cm = 250. Stillingen av dette maksimum forandret seg ikke med pH: BM123y har en spesifikk rotasjon på [a]D 25° = +71 o(c = 0,97 i vann).

Antibiotisk BM123y viste karakteristisk absorpsjon i

det infrarøde området av spekteret ved dé følgende bølgelengder: 770, 830, 870, 930, 980, 1035, 1105, 1175, 1225, 1300, 1340,

1370, 1460, 1510, 1555, 1605, 1660, 1740, 2950 og 3350 cm"<1.>

Et standard infrarødt absorpsjonsspektrum av BM123y fremstilt

i en KBr-pellet er vist'i fig. 1.

Eksempel 5

Isolering av BMl23y-^

En suspensjon av "CM Sephadex C-25 (Na<+>)" i 2% vandig natriumklorid ble hellet ned på en glasskolonne med en diameter på 2,6 cm til en harpikshøyde på ca. 70 cm. Overskuddet av 2% vandig natriumklorid ble tappet av og 4,11 g av en prøve som hovedsakelig inneholder BMl23y1 sammen med noe BMl23y2

og andre forurensninger, fremstilt som angitt i eksempel 3, ble oppløst i ca. 10 ml av en 2% vandig natriumklorid og tilført kolonnen. Hvert 15. minutt ble automatisk oppsamlet fraksjoner på ca. 75 ml. Antibiotisk BM123y ble lokalisert ved å styre kolonneutløpet i ultrafiolett og ved bioautografi av neddykkede papirskiver på store agarplater podet med Klebsiella pneumoniae stamme AD. Størsteparten av BMl23y var i fraksjonene 64-90;

de første fraksjonene (64-80) inneholder en blanding av BMl23<y>1og BM123<y>2, mens de senere fraksjoner (81-90) inneholder hovedsakelig ren BMl23y^.

100 ml av granulær "Darco G-60" (20-40 mesh) ble

suspendert i vann, overført til en glasskolonne, fikk lov til å sedimentere og overskuddet av vann ble tappet av. Fraksjonene 81-90 fra CM-Sephadex-kromatografien ovenfor ble slått sammen

og ført gjennom den granulære karbonkolonnen. Den belastede kolonnen ble vasket med 500 ml vann og ble derefter fremkalt med 500 ml av en 10% vandig metanol, efterfulgt av 1 liter av 50% vandig metanol. Det 50% vandige metanoleluatet, som inneholder størsteparten av BM123Y-, i ble justert fra pH 5,9 til 6,0

-1 1

med "Amberlite" IR-45 (OH )-harpiks. Harpiksen ble fjernet

ved filtrering og filtratet ble konsentrert i vakuum til en vandig fase og lyofilisert, og man får 294 mg av hvit, amorf BMl23y^ som hydrogenkloridsalt.

Antibiotisk BMl23y1 har ikke et bestemt smeltepunkt,

men spaltningen begynner gradvis i nærheten av 200 C. Mikroanalyse av en prøve bragt i likevekt i løpet av 24 timer ved 22°C

i en atmosfære som inneholder 60% relativ fuktighet, gir C 37,84%, H 5,73%, N 15,58%, Cl (ionisk) 10,01%, tørketap 10,45%.

I m%etanol ga MB123Y-, et U.V.-absorpsjonsmaksimum ved 286 nm på

Elcm = ^5. Stillingen av dette maksimum forandrer seg ikke

•med pH. BM123y-^har en spesifikk rotasjon på +55° (c=0,803 i vann). AntibiotiskBMl23y^viser karakteristisk absorpsjon i infrarødt område av spekteret ved de følgende bølgelengder: 770, 830, 870, 930, 980, 1045, 1080, 1110, 1125, 1175, 1225,

1305, 1345, 1380, 1465, 1515, 1560, 1605, 1660, 1730, 2950 og 3350 cm Et standard infrarødt absorpsjonsspektrum av BM123y-^fremstilt i en KBr-pellet er vist i fig. 2. Et standard protohmagnetisk resonansspektrum av BM12 3y^ bestemt i en D20-løsning i et 100 megacykler spektrometer er vist i fig. 4.

Eksempel 6

Isolering av BM123y2

En 25 g prøve som hovedsakelig inneholder BM123y2 °9

BM1233 fremstilt som angitt i eksempel 3 ble oppløst i ca. 120 ml av en 2% vandig natriumklorid og tilført til en kolonne som inneholder 1800 ml "CM Sephadex" C-25 (Na<+>) i 2% vandig natriumklorid. Kolonnen ble derefter eluert med en gradient mellom 20 liter av hver av 2% og 4% vandig natriumklorid. Det første

12 liter av eluatet ble oppsamlet i en stor kolbe og kastet. Derefter ble hvert 40. minutt automatisk oppsamlet fraksjoner på

ca. 800 ml.

Antibiotisk BMl2.3y ble lokalisert ved å styre kolonne-fraksjonene i ultrafiolett..Størsteparten av BMl23y var i fraksjonene 7-18; de første fraksjonene (7-15) inneholder hovedsakelig ren BM123y2°9de følgende fraksjoner (16-18) inneholder en blanding av BM123t1og BM123y2.

600 ml granulær "Darco G-60" (20-40 mesh) ble suspendert i vann, overført til en glasskolonne, fikk lov til å sedimentere og overskuddet av vann ble tappet av. Fraksjonene 7-15 fra CMrSephadex-kromatografi ovenfor ble slått sammen og ført gjennom den granulære karbonkolonnen. Den belastede kolonnen ble vasket med 3 liter vann og ble derefter fremkalt med 3 liter av 10% vandig metanol, efterfulgt av 6 liter 50% vandig metanol. Det 10% vandige metanoleluatet ble justert fra pH 5,8 til 6,0 med harpiksen "Amberlite IR 45 (OH )". Harpiksen ble fjernet ved filtrering og filtratet ble konsentrert i vakuum til en vandig fase og lyofilisert, og man får 595 mg av en hvit, amorf BM123y2som hydrogenkloridsalt. 50% vandig metanoleluat ble justert fra pH 4,6 til 6,1 med harpiksen "Amberlite IR 45 (0H~)". Harpiksen ble fjernet ved filtrering og filtratet ble konsentrert i vakuum til en vandig fase og lyofilisert, og man får 3,645 g av en noe mindre ren, hvit, amorf BM123Y2som hydrogenkloridsalt.

AntibiotiskBM123y2har ikke et definert smeltepunkt, men spaltningen begynner gradvis i nærheten av 200 C. Mikroanalyse av en prøve bragt i likevekt i løpet av 24 timer ved 22°C i en atmosfære som inneholder 60% relativ fuktighet, gir C 36,14%, H 5,67%, N 15,1%, Cl (ionisk) 11,11%, tørketap 10,87%. I metanol ga BM123y~et U.V.-absorpsjonsmaksimum ved 286 nm på

1%

El cm= ^20. Stillingen av dette maksimum forandrer seg ikke med pH. BM123y2har en spesifikk rotasjon på +60° (c = 0,851 i vann).

Antibiotisk BM123y2viser karakteristisk absorpsjon i det infrarøde området av spekteret ved de følgende bølgelengder: 770, 830, 870, 950, 980, 1035, 1110, 1175, 1225, 1285, 1345, 1380, 1470, 1515, 1560, 1605, 1660, 1755, 2950 og 33.50 cm"<1.>

Et standard infrarødt absorpsjonsspektrum av MBl23y2fremstilt i en KBr-pellet er vist i fig. 3. Et standard protonmagnetisk resonansspektrum av BMl23y2bestemt i en D20-løsning i et

.100 megacykler spektrometer er vist i fig. 5.

Eksempel 7

Papir fordelings- og tynnskiktskromatografi av BM1233 og BM123y

BM123 antibiotika kan adskilles ved papirkromatografi. For dette formål pådryppes strimler av "Whatman nr. 1" med en vann- eller metanol-løsning av stoffene og bringes i likevekt i løpet av 1-2 timer i nærvær av både øvre og nedre faser. Strimlene fremkalles natten over med den lave (organiske) fasen oppnådd ved blanding av 90% fenol:m-kresol:eddiksyre:pyridin:vann (100:25:4:4:75 på volumbasis). De fremkalte strimlene fjernes fra det kromatografiske kammer, lufttørkes i 1-2 timer, vaskes med eter for å fjerne resterende fenol og bioautograferes på store agarplater podet med Klebsiella pneumoniae stamme AD. Representative R^-verdier er angitt i tabell VII nedenfor:

3-komponenten var en blanding av to antibiotika når man anvender dette system.. BMl23y besto av en større mengde antibiotikum (Rf = 0,50) betegnet BMl23y^og en mindre mengde antibiotikum (Rf = 0,70) betegnet BM123y2-

BM123 antibiotika kan også adskilles ved tynnskikts-kromatograf i . For dette formål ble prebelagte plater av "Cellulose F" (0,10 mm tykke), en slags tykkskikts cellulose levert av EM Laboratories, Inc.,Elmsford, New York, pådryppet med en vannløsning av forbindelsen som skal kromatograferes

(ca. 20-40 mikrogram pr. flekk). Platene ble fremkalt natten over med løsningsmidlet oppnådd ved å blande 1-butanol:vann: pyridin:eddiksyre (15:12:10:1 på volumbasis). De fremkalte platene ble fjernet fra det kromatografiske kammer og lufttørket i ca. 1 time. Antibiotika ble bestemt ved å anvende enten standard ninhydrin eller Sakaguchi-sprøytereagenser.

Eksempler på Rf-verdier er angitt i tabell VIII nedenfor.

Både BM12 33 og BM12 3Y var en blanding av to komponenter ved anvendelse av dette system. BM1233 besto av en hoved-komponent (Rf = 0,08) som var BM1233-^og en komponent (Rf = 0,14) som var BM12332- Den minst polare komponenten av BMl2 3y (Rf = 0,2 3) var BM12 3y1 og den størst polare komponenten

(Rf =0,17) var BM123y2-

Eksempel 8

Generell fremgangsmåte for reduktiv alkylering av antibiotikum BM12 3Y

Til en omrørt løsning av 100 mg antibiotisk BM12 3y

i 20 ml metanol tilsettes 5 ml (eller 5 g) av det egnede aldehyd eller keton og 100 mg natriumcyanoborhydrid. pH av den resulterende løsningen holdes ved ca. 7,0 med 0,1N metanolisk hydrogenklorid i løpet av 3-24 timer. Reaksjonen styres ved tynnskiktskromatografi tilBM123y forsvinner. Reaksjonsblandingen filtreres derefter og filtratet fordampes til tørrhet. Resten tritureres med 3 ml metanol og filtreres. Filtratet fortynnes med 50 ml aceton og utfelningen som dannes fjernes ved filtrering og tørkes. Metanolløsningsmidlet kan erstattes av 20 ml vann når aldehydet eller ketonet som anvendes som utgangsmateriale er vannløselige.

Eksempel 9

Fremstilling av metyl- BMl2 3Y

Til en løsning av 1,0 gBM123y og 2,5 ml av en 37%

vandig formaldehydløsning i 50 ml vann tilsettes porsjonsvis 400 mg natriumcyanoborhydrid. pH av reaksjonsblandingen.holdes ved 7,0 med IN saltsyre under denne tilsetningen. Reaksjonsblandingen omrøres i ytterligere 10 minutter ved værelsestemperatur og fordampes derefter til tørrhet i vakuum. Resten tritureres med 20 ml metanol, filtreres og filtratet fortynnes med 250 ml aceton. Produktet som faller ut fjernes ved filtrering og tørkes; utbytte 667 mg.

Eksempel 10

Fremstilling av isopropyl- BMl23y

Til en løsning av 200 mg BM123y i 30 ml metanol tilsettes 5 ml aceton. Til denne løsningen tilsettes 139 mg natriumcyanoborhydrid og reaksjonsblandingen omrøres ved værelsestemperatur i 30 minutter. I løpet av denne tiden holdes pH av reaksjonsblandingen mellom 7,4 og 7,8 ved tilsetning av 0,1N metanolisk hydrogenklorid. Den lille mengde av utfelning som sedimenterer fjernes ved filtrering og filtratet fordampes til tørrhet i vakuum. Resten tritureres med 2 ml metanol og filtreres. Filtratet fortynnes med 100 ml aceton og det faste produktet som faller ut fjernes ved filtrering og tørkes;

utbytte 184 mg.

Eksempel 11

Fremstilling av [ j- fenyletyl- BMl23y

Til en løsning av 200 mgBMl23y i 15 ml vann og 25 ml acétonitril ble tilsatt en løsning av 2 ml fenylacetaldehyd i 4 ml etanol. Til denne ble tilsatt 103 mg natriumcyanoborhydrid. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved værelsestemperatur i 30 minutter og i løpet av denne tiden ble pH av blandingen holdt ved 7 med 0,2N saltsyre. Reaksjonsblandingen ble derefter filtrert og filtratet ble fordampet til tørrhet i vakuum.

Resten ble triturert med' 2 ml metanol og filtrert. Filtratet

ble fortynnet med 100 ml aceton og produktet som skilles ut ble fjernet ved filtrering og tørket, utbytte 180 mg.

Eksempel 12

Fremstilling av 1, 3, 3- trimetylbutyl- BM123y

Til en løsning av 200 mgBM123y-hydrogenklorid i 50 ml metanol ble tilsatt 3 ml 4,4-dimetyl-2-pentanon og 106 mg natriumcyanoborhydrid. Reaksjonsløsningen ble holdt ved pH 7 ved dråpevis tilsetning av metanolisk hydrogenklorid. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved værelsestemperatur i 18 timer og filtrert. Filtratet ble fordampet til tørrhet i vakuum. Resten ble oppløst i 3 ml metanol, fortynnet med 50 ml aceton og filtrert, utbytte 125 mg.

Eksempel 13

Fremstilling av 1- metylfenetyl- BM! 23y

Til en løsning av 200 mg BMl23y i 50 ml metanol ble tilsatt 5 ml fenylaceton. Til denne løsningen ble tilsatt 170 mg natriumcyanoborhydrid og reaksjonsblandingen ble omrørt ved værelsestemperatur i 3,5 timer. I løpet av denne tiden ble pH av reaksjonsblandingen holdt ved 7,0 med metanol mettet med hydrogenkloridgass. Reaksjonsblandingen ble konsentrert til et volum på ca. 5 ml, fortynnet med 2 ml metanol og filtrert. Filtratet ble hellet ned i 100 ml aceton og det faste produktet som skilles ut ble fjernet ved filtrering og tørket, utbytte 233 mg.

Eksempel 14

Fremstilling av l- metylnonyl- BMl23y

Natriumcyanoborhydrid (100 mg) ble tilsatt til en løsning av BM123y (200 mg) og 2-dekanon (1 ml) i 40 ml metanol. pH av løsningen ble justert til 7,0 og holdt ved 7,0 0,2 ved tilsetning av 0,IN metanolisk hydrogenklorid om nødvendig.

Efter 19,5 timer ble reaksjonsblandingen filtrert og filtratet ble konsentrert i vakuumved 30°C. Resten ble suspendert i 5 ml metanol og filtrert. Filtratet ble tilsatt til 50 ml aceton. Det nesten hvite, faste stoffet som falt ut ble oppsamlet ved filtrering, vasket med aceton og tørket i vakuum. Utbytte av urenset l-metylnonyl-BMl23y var 167 mg.

Eksempel • 15

Fremstilling av 1, 3- dimetylbuty1- BM123y

Til en løsning av 210 mg BM123y i 50 ml metanol ble tilsatt 5 ml metylisobutylketon. Til denne løsningen ble tilsatt 166 mg natriumcyanoborhydrid og reaksjonsblandingen ble omrørt ved værelsestemperatur i 5 timer. I løpet av den tiden ble pH av reaksjonsblandingen holdt ved 7,0 med metanol mettet med hydrogenkloridgass. Reaksjonsblandingen ble fordampet til tørrhet i vakuum. Resten ble triturert med 2 ml metanol og filtrert. Filtratet ble fortynnet med 100 ml aceton og det faste produktet som falt ut ble fjernet ved filtrering og tørket; utbytte 210 mg.

Eksempel 16

Fremstilling av 2- norbornyl- BMl23y

Natriumcyanoborhydrid (100 mg) ble tilsatt til en løsning av BM123y (200 mg) og 2-norbornanon (400 mg) i 40 ml metanol. pH av løsningen ble justert til 7,0 méd 0,1N metanolisk hydrogenklorid. pH ble holdt ved 7,0 ± 0,2 ved tilsetning av 0,1N hydrogenklorid om nødvendig. Efter 21,5 timer ble reaksjonsblandingen filtrert og filtratet ble konsentrert i vakuum ved 35°C. Resten ble suspendert i 5 ml métanol og filtrert. Filtratet ble tilsatt til 50 ml aceton. Det nesten hvite, faste stoffet som falt ut ble oppsamlet ved filtrering, vasket med aceton og tørket i vakuum. Utbytte av urenset 2-norbornyl-BMl23y var 175 mg.

t

E ksempel 17

Fremstilling av isopropyl- BMl23Y-|

En blanding av 50 mg MB123y1, 5 ml aceton og 60 mg natriumcyanoborhydrid i 35 ml metanol ble omrørt ved værelsestemperatur i 40 minutter. pH av løsningen ble holdt ved 7

ved dråpevis tilsetning av en metanolisk hydrogenkloridløsning. Blandingen ble fordampet til"tørrhet i vakuum. Resten ble triturert med 5 ml metanol og den resulterende løsningen ble fortynnet med 50 mb aceton, utbytte 49 mg.

Eksempel 18

Fremstilling av isopropyl- BM123y2

En blanding av 41 mg BM123y2»5 ml aceton og. 50 mg natriumcyanoborhydrid i 35 ml metanol ble omrørt ved værelsestemperatur i 40 minutter. pH av løsningen ble holdt ved 7

ved dråpevis tilsetning av en metanolisk hydrogenkloridløsning (mettet). Blandingen ble filtrert og fordampet til tørrhet i vakuum. Resten ble triturert med 5 ml metanol og den resulterende løsningen ble fortynnet med 50 ml aceton; utbytte 46 mg.

Eksempel 19

Fremstilling av l- metyl- 2- fenyl- ety1- BM123y2

En blanding av 200 mg BM123Y/5 ml fenylaceton og 170 mg natriumcyanoborhydrid i 50 ml metanol ble omrørt ved værelsestemperatur i 3 timer og 45 minutter. I løpet av denne tid ble pH av reaksjonsblandingen holdt ved 7 under dråpevis tilsetning av en metanolisk hydrogenkloridløsning (mettet). Blandingen ble fordampet til tørrhet i vakuum. Resten ble triturert med 5 ml metanol og den resulterende metanolløsningen ble fortynnet med ca. 50 ml aceton; utbytte 2 33 mg.

Eksempel 20

Fremstilling av ( 2- etylcyklopentyl) BM123y

En løsning av 200 mg BM123Y/3 ml 2-etylcyklopentanon

og 101 mg natriumcyanoborhydrid i 50 ml metylalkohol ble opp-bevart ved værelsestemperatur i 18 timer. I løpet av denne

tiden ble pH av løsningen holdt ved 7 under tilsetning av en mettet løsning av hydrogenklorid i metanol. Reaksjonsblandingen ble fordampet til tørrhet. Resten ble triturert med 3 ml metanol, filtrert og filtratet ble fortynnet med 40 ml aceton, utbytte 157 mg.

t

Eksempel 21

Fremstilling av 3, 5- dimetyicykloheksyl- BMl23y

En løsning av 200 mg BM12 3Y/ 5 ml 3,5-dimetylcyklo-heksanon og 200 mg natriumcyanoborhydrid i 50 ml metanol ble lagret ved værelsestemperatur i 1 time. I løpet av denne tiden ble pH av løsningen holdt ved 7 under tilsetning av en mettet løsning av hydrogenklorid i metanol. Reaksjonen ble triturert med 3 ml metanol, filtrert og filtratet ble fortynnet med 40 ml aceton, utbytte 200 mg.

Eksempel 22

Fremstilling av 2, 4- dimetylcyklopenty1- BM123y

En løsning av 206 mg BM123Y, 3 ml 2,4-dimetylcyklo-pentanon og 104 mg natriumcyanoborhydrid i 50 ml metanol ble lagret ved værelsestemperatur i 6 timer. I løpet av denne tiden ble pH av løsningen holdt ved' 7 under tilsetning av en mettet løsning av hydrogenklorid i metanol. Reaksjonen ble triturert med 3 ml metanol, filtrert og filtratet ble fortynnet med 40 ml aceton, utbytte 101 mg.

Eksempel 23

Fremstilling av 2- etylcykloheksyl- BMl23Y

En løsning av 200 mg BM123Y/5 ml 2-etylcykloheksanon og 213 mg natriumcyanoborhydrid i 50 ml metanol ble lagret ved

værelsestemperatur i 3 timer. I løpet av denne tiden ble pH av løsningen holdt ved 7 under tilsetning av mettet hydrogenklorid i. metanol. Reaksjonen ble triturert med 3 ml metanol, filtrert og filtratet ble fortynnet med 40 ml aceton, utbytte 200 mg.

Eksempel 24

Fremstilling av 3- metylcykloheksyl- BM123Y

En løsning av 200 mg BM123Y/ 1/5 ml 3-metylcykloheksanon og 200 mg natriumcyanoborhydrid i. 50 ml metanol ble lagret ved værelsestemperatur i 2 timer. I løpet av denne tiden ble pH av løsningen holdt ved 7 under tilsetning av en mettet løsning av hydrogenklorid i metanol. Reaksjonen ble triturert med 3 ml metanol, filtrert og filtratet ble fortynnet med 40 ml aceton, utbytte 200 mg.

Eksempel 25

Fremstilling av 2, 4, 4- trimetylcyklopenty1- BM123y

En løsning av 200 mg BM123Y/5 ml 2,4,4-trimetylcyklo-pentanon og 17 9 mg natriumcyanoborhydrid i 50 ml meta«nol ble lagret ved værelsestemperatur i 24 timer. I løpet av denne tiden ble pH av løsningen holdt ved 7 under tilsetning av en mettet løsning av hydrogenklorid i metanol. Reaksjonen ble triturert med 3 ml metanol, filtrert og filtratet ble fortynnet med 40 ml aceton, utbytte 176 mg.

Eksempel 26

Fremstilling av 2- propylcykloheksyl- BMl23y

En løsning av 200 mg BMl23y, 3 ml 2-propylcykloheksanon

og 157 mg natriumcyanoborhydrid i 50 ml metanol ble lagret ved værelsestemperatur i 4 timer. Under denne tiden ble pH av løsningen holdt ved 7 under tilsetning av en mettet løsning av hydrogenklorid i metanol. Reaksjonsblandingen ble triturert med 3 ml metanol, filtrert og filtratet ble fortynnet med 40 ml aceton, utbytte 75 mg.

Eksempel 27

Fremstilling av 2- metylcyklopenty1- BM123y

En løsning av 211 mg BM123y, 3 ml 2-metylcyklopentanon

og 98 mg natriumcyanoborhydrid i 50 ml metanol ble lagret ved værelsestemperatur i 3,5 timer. Under denne tiden ble pH av løsningen holdt ved 7 under tilsetning av en mettet løsning av hydrogenklorid i metano.l. Reaks jonsblandingen ble triturert med 3 ml metanol, filtrert og filtratet ble fortynnet med 40 ml aceton, utbytte 157 mg.

Claims (4)

1. Forbindelse valgt fra gruppen som har formlene:

hvor R er en gruppe som ér valgt fra gruppen som har formlene:

og.

hvor er valgt fra gruppen som består av hydrogen, lavere alkyl, halogen-substituert lavere alkyl, lavere alkenyl, fenyl, monosubstituert fenyl, fenyl lavere alkyl, 2-furyl, metyl-substituert 2-furyl, 2-tienyl, metyl-substituert 2-tienyl, 2-pyrryl, metyl-substituert 2-pyrryl, 2-pyridyl og 2-kinolyl; og farmakologisk aksepterbare syreaddisjonssalter derav.

2. Forbindelse valgt fra gruppen som har formelen:

hvor R er en gruppe valgt fra gruppen som har formlene:

og

hvor R_ er valgt fra gruppen som består av lavere alkyl, halogensubstituert lavere alkyl <p> g fenyl-lavere alkyl; R^ er valgt fra gruppen som består av lavere alkyl, halogen-substituert lavere alkyl, lavere alkenyl, lavere cykloalkyl, fenyl, monosubstituert fenyl, fenyl-lavere-alkyl og monosubstituert •fenyl-lavere-alkyl; og R2 og R^ sammen med den til-knyttede metylidyngruppen er cyklopentyl, mono-lavere-alkyl- substituert cyklopentyl, di-lavere-alkyl-substituert cyklopentyl, tri-lavere-alkyl-substituert cyklopentyl, cykloheksyl, mono-lavere-alkyl-substituert cykloheksyl, di-laveré-alkyl-substituert cykloheksyl eller tri-lavere-alkyl-substituert■cyklo-heksyl; og farmakologisk aksepterbare syreaddisjonssalter derav.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser av formlene:

hvor er hydrogen, lavere alkyl, halogensubstituert lavere alkyl, lavere alkenyl, fenyl, monosubstituert fenyl, fenyl-lavere-alkyl, 2-furyl, metyl-substituert 2-furyl, 2-tienyl, metyl-substituert 2-tienyl, 2-pyrryl, metyl-substituert 2-pyrryl, 2-pyridyl eller 2-kinolyl; og R er en gruppe med formelen:

karakterisert ved at man alkylerer et. amin av formelen:

hvor R er som angitt ovenfor, med aldehyd av formelen: R-L - CHO hvor R^ er som angitt ovenfor, i nærvær av et reduksjonsmiddel i et løsningsmiddel som er inert overfor reaksjonsdeltagerne i tilstrekkelig lang tid til at det finner sted en vesentlig grad av reduktiv alkylering.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser av formelen:

hvor R2 er lavere alkyl, halogensubstituert lavere alkyl eller fenyl-lavere alkyl; R^ er lavere alkyl, halogensubstituert lavere alkyl, lavere alkenyl, lavere cykloalkyl, fenyl, monosubstituert fenyl, fenyl-lavere alkyl eller monosubstituert fenyl-lavere alkyl; og R^ og R^ sammen er tetrametylen, pentametylen eller heksametylen; og R er en gruppe av formelen:

karakterisert ved at man alkylerer et amin med formelen:

hvor R er som ovenfor angitt, med et keton av formelen:

hvor R2 og R^ er som ovenfor angitt i nærvær av et reduksjonsmiddel i et lø sningsmiddel som er inert overfor reaksjonsdeltagerne i tilstrekkelig lang tid til at det finner sted en vesentlig grad av reduktiv alkylering.