DE1695945A1 - Verfahren zur Herstellung von N-Demethyl-N-aethyllincomycin C - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von N-Demethyl-N-aethyllincomycin CInfo
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Description
Dr, Walter Beil Alfred Koeppener
Dr. H"/is Joachim Wolf! Dr, Hans Chr. Beil
Frankfurt a- M.-Höchst
Unsere Nr. 13 8if8
The Upjohn Company, Kalamazoo (Michigan, USA)
Verfahren zur Herstellung von N-Demethyl-N-äthyllincomycin C
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindung N-Demethyl-N-äthyllincomycin C
auch Lincomycin S (U-25.468) genannt.
Lincomycin S ist eine organische Verbindung, die durch Züchtung einer lincomycinproduzierenden Actinomycete
in einem wässrigen Nährmedium in Gegenwart von Aethionin
Dr.Ti.-af - 1 - 15965
12.6.1967
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Λ f- O ~ O /,
1 υ W ν w· Ί
vinter aeroben Bedingungen herstellbar ist. Lincomycin S
hat die folgende Strukturformel:
CONH
worin R und R' Aethyl und R" n-Propyl sind.
Lincomycin S ist eine basische Verbindung, welche die Eigenschaft hat, das Wachstum von grampositiven und
gramnegativen Bakterien, beispielsweise Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus faecalis, Streptococcus hemolyticus,
Escherichia coli, KLebsielle pneumoniae und
Salmonella schottmuelleri, ungünstig zu beeinflussen. Dementsprechend
kann Lincomycin S allein oder in Verbindung mit anderen Antibiotika zur Verhinderung des Wachstums oder zur
Reduzierung der Zahl der Bakterien in verschiedenen Umgebungen, wie es hierin beschrieben wird, verwendet werden.
Es kann beispielsweise als Desinfektionsmittel für ver-
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schiedene zahnmedizinische und medizinische Geräte, die mit Staphylococcus aureus verunreinigt sind, verwendet
werden. Es ist auch nützlich in Waschlösungen für sanitäre Zwecke, wie zum Waschen der Hände und zum Reinigen von
Geräten, Pussböden oder Möbeln von infizierten Räumen oder
Laboratorien; es ist auch nützlich für industrielle Vorbeugungsmittel, beispielsweise als ein bakteriostatisches
Spülmittel für gewaschene Kleidungsstücke und zur Imprägnierung von Papier und Gewebe, und es ist nützlich zur Unter
drückung des Wachstums empfindlicher Organismen in Plattenproben und anderen mikrobiologischen Medien.
Die erfindungsgemäss zur Herstellung von Lincomycin S
verwendete Actinomycete ist Streptomyces lincolnensis var. lincolnensis. Dies ist eine bekannte Actinomycete, die in
der Sammlung der Northern Utilization and Research Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture,
Peoria, Illinois, U.S.A., deponiert ist. Sie ist in dieser Sammlung unter der Nummer NRRL 2936 hinterlegt. Lincomycin
S ist mit den Antibiotika Lincomycin, Lincomycin B (U-21.699) und Lincomycin C (U-Il.921) strukturell verwandt.
Unter Zugrundelegung der Formel I sind die Strukturen die folgenden:
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i69ES'i5
R R1 RM
| Lincomycin | B | CH3 | CH3 | C3H7 |
| Lincomycin | C | CH3 | CH3 | C2H5 |
| Lincomycin | S | CH3 | C2H5 | C3H7 |
| Lincomycin | C2H5 | C2H5 | C3H7 | |
Obwohl Lincomycin S dem Lincomycin, Lincomycin B und Lincomycin C strukturell ähnlich ist, ist es ein deutlich
verschiedenes Antibiotikum, das unerwartete antibakterielle Eigenschaften besitzt. Lincomycin, Lincomycin B und Lincomycin
C sind antibakteriell wirksam gegenüber grampositiven Organismen, wohingegen Lincomycin S nicht nur gegenüber
grampositiven Organismen sondern auch gegenüber gramnegativen Organismen wirksam ist. Die folgende Tabelle I
zeigt den Vergleich zwischen Lincomycin und Lincomycin S gegenüber gewöhnlichen grampositiven und gramnegativen
Organismen:
| TABELLE I | Test Organismen | Geringste Heu in μg/ml |
amungskonzentratioi |
| S. aureus | Lincomycin | Lincomycin S | |
| Streptococcus hemolyticus | 0,8 | 0,4 | |
| Streptococcus faecalis | 0,4 | 0,4 | |
| 0,4 | 0,4 | ||
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| Test Organismen | Lincomycin | Lincomycin S |
| E. coli | > 200 | 50 |
| K. pneumoniae | 50 | 12,5 |
| S. schottmuelleri | > 200 | 50 |
Es wurde festgestellt, dass bei Zugabe von Aethionin
zu einer Fermentation unter Verwendung von Mikroorganismus Streptomyces lincolnensis var. lincolnensis nicht nur
Lincomycin C und einiges Lincomycin und Lincomycin B pro-
dass
duziert, sondern4auch Lincomycin S erhalten wird. Bis zu unserer Entdeckung haben die gewöhnlichen und üblichen Verfahren zur Isolierung von Lincomycin, Lincomycin B und Lincomycin C aus Kulturbrühen, die dasselbe enthielten, das Lincomycin^ zerstört oder die Isolierung und Erkennung desselben verhindert. Bei der Aufarbeitung solcher Brühen wurden das Lincomycin, das Lincomycin B und Lincomycin C isoliert, und die Rückstände wurden verworfen. Daher wurde Lincomycin S, obwohl es als ein Begleiter von Lincomycin, Lincomycin B und Lincomycin C gebildet wurde, vor dieser Erfindung nicht bekannt, nicht erkannt, bzw. nicht in verwertbarer und erkennbarer Form gewonnen. Durch das erfindungsgemässe Verfahren sind wir jetzt in der Lage, Lincomycin S frei von Lincomycin, Lincomycin B, Lincomycin C und ähnlichen Begleitstoffen zu isolieren, abzutrennen und zu gewinnen.
duziert, sondern4auch Lincomycin S erhalten wird. Bis zu unserer Entdeckung haben die gewöhnlichen und üblichen Verfahren zur Isolierung von Lincomycin, Lincomycin B und Lincomycin C aus Kulturbrühen, die dasselbe enthielten, das Lincomycin^ zerstört oder die Isolierung und Erkennung desselben verhindert. Bei der Aufarbeitung solcher Brühen wurden das Lincomycin, das Lincomycin B und Lincomycin C isoliert, und die Rückstände wurden verworfen. Daher wurde Lincomycin S, obwohl es als ein Begleiter von Lincomycin, Lincomycin B und Lincomycin C gebildet wurde, vor dieser Erfindung nicht bekannt, nicht erkannt, bzw. nicht in verwertbarer und erkennbarer Form gewonnen. Durch das erfindungsgemässe Verfahren sind wir jetzt in der Lage, Lincomycin S frei von Lincomycin, Lincomycin B, Lincomycin C und ähnlichen Begleitstoffen zu isolieren, abzutrennen und zu gewinnen.
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Λ ρ Q Γ' ο A
I U ο ν «.' ι
Obwohl Lincomycin S durch eine Fermentation wie sie in Beispiel 1 der US-Patentschrift 3.086.912 beschrieben
ist, hergestellt werden kann, wenn Aethionin zugefügt wird, ist die Produktion von Lincomycin S in dieser Fermentation
nicht ausreichend, um es wirkungsvoll gewinnen zu können. Ein bevorzugtes Medium für die Herstellung von Lincomycin S
ist ein synthetisches Fermentationsmedium, wie in Beispiel 1 gezeigt wurde, zu dem Aethionin hinzugefügt wurde. Die
Kohlenstoffquelle in diesem Medium ist Glukosemonohydrat,
und die Stickstoffquelle ist Ammoniumnitrat. Spurenmetalle
wie Zink, Eisen und Magnesium werden dem Medium zugefügt. Obwohl das bevorzugte Medium gegenwärtig die grössten Ausbeuten
an gewinnbaren Lincomycin S ergibt, wird anerkannt, dass Veränderungen des Reaktionsmediums in bekannter Weise
durchgeführt werden können, so dass andere Kohlenstoff- und Stickstoffquellen verwendet werden können. Solche andere
Kohlenstoffquellen können Rohzucker, Saccharose, Glycerin,
Stärke, Maisstärke,' Galactose, Dextrin, Melasse und ähnliche sein. Andere Stickstoffquellen können Maisweichwasser, Hefe,
autolisierte Bierhefe ohne Feststoffe, Sojabohnenmehl,Baumwollsamenmehl,
Maismehl, Milchfeststoffe, Pancreashydrolisat von Kasein, Schlempe (distiller's solubles) Fischmehl, Tiereiweisslösungen,
Fleisch und Knochenüberreste und dgl. sein.
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Die Herstellung von Lincomycin S kann bei jeder beliebigen Temperatur, die zufriedenstellendes Wachstum des
Mikroorganismus bewirkt, beispielsweise zwischen ca. 18 und 40° C, vorzugsweise zwischen 25° und 30°, durchgeführt
werden. Für gewöhnlich wird optimale Produktion der Verbindung in ca. 2 bis 10 Tagen bewirkt. Während der Fermentation
bleibt das Medium normalerweise ziemlich nahe am Neutralpunkt oder auf der basischen Seite. Der EndpH-Wert
ist teilweise, falls solche vorhanden sind, von den Puff er subs tanzen abhängig und teilweise von dem AnfangspH
des Kulturmediums, welcher vorteilhafterweise vor der Sterilisierung auf ungefähr 6 bis 8 eingestellt wird.
Wenn das Wachstum in grossen Gefässen und Tanks durchgeführt wird, wird vorgezogen, die vegetative Form des
Mikroorganismus anstelle ^er Sporenfcrri; zur Boimpfung z:i
verwenden, um eine deutlich ausgeprägte Verzögerung in der Produktion der neuen Verbindung und die damit verbundene
unwirtschaftliche Ausnutzung der Apparatur zu vermeiden. Dementsprechend ist es wünschenswert, ein vegetatives Inoculum
in einer Nährbrühe herzustellen, indem die Brühe mit einer aliquoten Menge aus einer Boden- oder Schrägkultur
geimpft wird. Wenn ein junges, aktives vegetatives Incolulum geschaffei worden ist, wird es aseptisch in grosse Gefässe
oder Tanks überführt. Das Medium, in dem das vegetative
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Inoculum hergestellt worden 1st, kann das gleiche sein, das für die Produktion der neuen Verbindung verwendet wird
oder es kann verschieden davon sein, so lange es nur so beschaffen ist, dass ein gutes Wachstum des Mikroorganismus
erhalten wird.
In einer bevorzugten Fermentation für Lincomycin S
Aethionin
werden nach 72 Stunden ungefähr 500 mg/Liter^zu der Fermentation
zugesetzt. Es können auch beliebige höhere oder niedrige Mengen, z.B. von ca. 0,5 mg/ml bis ca. 4 mg/ml,
die für die Herstellung von Lincomycin S wirksam-sind, verwendet
werden. Die Fermentation wird nach 6 Tagen aufgearbeitet. Es kann entweder DL-Aethionin oder L-Aethionin
verwendet werden, jedoch ergibt die Zugabe von L-Aethionin eine wirksamere Produktion von Lincomycin S. Unabhängig davon
welches Aethionin verwendet wird, kann ein gewisser Grad von Toxicität gegenüber dem Wachstum des Mikroorganismus
auftreten, wodurch die Endausbeute an Lincomycin während der Gärung vermindert werden kann. Die Toxizität kann dadurch
auf ein Minimum reduziert werden, dass das Aethionin zu der Fermentation zugesetzt wird, wenn diese ca. 48 bis
72 Stunden alt ist. Die Zugabe kann kontinuierlich, halbkontinuierlich oder auf andere Weise durchgeführt werden,
so lange die Konzentration an Aethionin in der Fermentation das Wachstum des Mikroorganismus nicht so weit beeinflusst,
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dass die Produktion an Lincomycin leidet.
Bei der Isolierung und Reinigung des Lincomycin S kann eine Vielzahl von Verfahren angewendet werden, beispielsweise
Lösungsmittelextraktion, Flüssig-Flüssig-Verteilung
in einer Craig-Apparatur, die Verwendung von
Adsorbentien, sowie Kristallisation aus Lösungsmitteln. In einem bevorzugten Verfahren wird die gesamte Brühe
einer Lincomycin-S-Fermentation unter Verwendung einer Filterhilfe, beispielsweise Kielselgur, falls erforderlich,
filtriert. Das Filtrat wird dann auf einen alkalischen pH-Wert von ca.. 10,0 eingestellt und mit einem mit Wasser
nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert. Methylenchlorid wird bevorzugt. Der Lösungsmittelextrakt wird zur
Trockne eingedampft und ergibt eine rohe, trockene Präparation, die Lincomycin, Lincomycin B, Lincomycin C und Lincomycin S
enthält. Lincomycin S kann von diesen anderen Lincomycinen durch Säulenchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelsyetems,
in welchem Lincomycin S löslich isb, um Lincomycin S aus der Säule zu eluieren, abgetrennt werden.
Nach einem bevorzugten Verfahren wird eine rohe Präparation, die Lincomycin S und andere Lincomycine enthält, durch eine
Silikagel-Chromatographiesäule laufen gelassen. Die Säule wird mit einem Lösungsmit/'telsystem, das aus Methyläthylketon:Aceton:Wasser
im Verhältnis 100:30:5 besteht, eluiert.
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So kann die Säule eluiert werden, und Fraktionen können gesammelt werden und durch Dünnschichtchromatographie zur Erkennung
der Anwesenheit von Lincomycin S analysiert werden. Die Dünnschi cht Chromatographie wird an Silikagel G (E. Merck
A.G., Darmstadt) auf Platten von 0,12 bis 0,5 mm Dicke unter
Verwendung von Methyläthylketon:Aceton:Wasser (140:4Oj22 v/v)
als Elutionsmittel durchgeführt. Fraktionen, die nur Lincomycin S enthalten, können für das weitere Verfahren vereinigt
werden. Fraktionen, die Lincomycin S und andere Lincomycine enthalten, können vereinigt werden, und ein
zweites Mal durch die Säule gegeben werden. Es ist vorteilhaft, diejenigen Fraktionen, die Lincomycin S und andere
Lincomycine enthalten, zur Anreicherung des Lincomycin-S-Gehalts der Gegenstromverteilung in einer Crajg-Apparatur zu
unterwerfen, wobei ein Lösungsmittelsystem verwendet wird, das gleiche Volumina Butanol-(l) und Wasser enthält. Diese
durch Gegenstromverteilung angereicherten Fraktionen können dann wir oben beschrieben, durch eine Chromatographiesäule
laufen gelassen werden.
Wahlweise können rohe Präparationen von Lincomycin S,
die andere Lincomycine enthalten, vor der ersten Trennung an einer Chromatographiesäule wie oben beschrieben, der
Gegenstromverteilung in einer Craig-Apparatur unterworfen werden. Dieses Verfahren wird vorteilhafterweise angewendet,
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wenn eine rohe Präparation von Lincomycin S einen verhältnismässig
hohen Anteil anderer Lincomycine enthält.
Obwohl Silikagel-Chromatographie die bevorzugte Chromatographiemethode zur Isolierung von Lincomycin S
aus Materialien, die Lincomycin S und andere Lincomycine
Aist
enthalten, können im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens andere Chromatographieverfahren, wie Verteilungschromatographie und Adsorptionschromatographie angewendet werden. Kristallisation, ebenso wie Umkristallisation, des Lincomycin-S-Hydrochlorids wird durch Auflösung einer antibiotischen Präparation, die aus Lincomycin-S-Hydrochlorid besteht, in Wasser, Zugabe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, z.B. Aceton, Methanol, Aethanol, bzw. Propanol-(2), und anschliessender Abkühlung zur Einleitung oder Vervollständigung der Kristallisation durchgeführt=, Die. Kristalle werden abfiltriert und mit einem wässrigen Lösungsmittel und, falls gewünscht, mit einem wasserfreien Lösungsmittel gewaschen, und dann im Vakuum getrocknet. Die neue erfindungsgemäss hergestellte Verbindung kann aus der filtrierten Brühe auch durch Adsorption an Kationenaustauschharzen gewonnen werden. Sowohl die Carbonsäureals auch die Sulfonsäureharze können verwendet werden. [Geeignete Carbonsäureharze sind Polyacrylsäureharze, die durch Copolymerisation von Acrylsäure und Divinylbenzol
enthalten, können im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens andere Chromatographieverfahren, wie Verteilungschromatographie und Adsorptionschromatographie angewendet werden. Kristallisation, ebenso wie Umkristallisation, des Lincomycin-S-Hydrochlorids wird durch Auflösung einer antibiotischen Präparation, die aus Lincomycin-S-Hydrochlorid besteht, in Wasser, Zugabe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, z.B. Aceton, Methanol, Aethanol, bzw. Propanol-(2), und anschliessender Abkühlung zur Einleitung oder Vervollständigung der Kristallisation durchgeführt=, Die. Kristalle werden abfiltriert und mit einem wässrigen Lösungsmittel und, falls gewünscht, mit einem wasserfreien Lösungsmittel gewaschen, und dann im Vakuum getrocknet. Die neue erfindungsgemäss hergestellte Verbindung kann aus der filtrierten Brühe auch durch Adsorption an Kationenaustauschharzen gewonnen werden. Sowohl die Carbonsäureals auch die Sulfonsäureharze können verwendet werden. [Geeignete Carbonsäureharze sind Polyacrylsäureharze, die durch Copolymerisation von Acrylsäure und Divinylbenzol
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nach dem Verfahren, das auf Seite 87 von Kunin, Ion
Exchange Resins, 2nd Edition (1958), John Wiley and Sons Inc. angegeben ist, erhalten wurden. Carbonsäureaustauschharze
dieses Typs werden unter der Bezeichnung Amberlite IRC-50 and Zeokarb 226 in den Handel gebracht. Geeignete
Sulfonsäureharze sind unter anderem kernsulfonierte Polystyrolharze, die mit Divinylbenzol vernetzt sind und die
nach dem Verfahren, das auf Seite 84 des oben erwähnten Buches von Kunin angegeben ist, erhalten wurden. Sulfonierte
Kationenaustauschharze dieser Art werden unter den Bezeichnungen Dowex-50, Amberlite IR-120, Nalcite HCR,
Chempro C-20, Permutit Q, und Zeokarb 225 in den Handel gebracht ].
Das Antibiotikum wird von dem Harz mit einer Säure, vorteilhafterweise bei einem pH-Wert, der niedriger ist,
als der pKa-Wert des verwendeten Kationenaustauschharzes,
eluiert. Zufriedenstellende Ergebnisse werden bei einem pH-Wert zwischen 1 und 6 erhalten. Das Eluat wird mit einer
Base, z.B. Natriumhydroxyd oder mit einem starkbasischen Anionenaustauschharz auf einen pH-Wert von 7,5 bis 8,5 eingestellt.
Die Eluate können durch weitere Chromatographie an Säulen und Gegenstromverteilungsverfahren, wie oben
beschrieben, gerehigt werden. [Geeignete Anionenaustauschharze für diesen Zweck werden nach dem auf Seiten 88 und
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des oben erwähnten Buches von Kunin angegebenen Verfahren
durch Chlormethylierung von Polystyrol, falls gewünscht, mit Divinylbenzol vernetzt, hergestellt nach dem
auf Seite 84 des oben erwähnten Buches von Kunin, angegebenen Verfahren und mit Trimethylamin oder Dimethyläthanolamin
nach dem auf Seite 97 des oben erwähnten Buches von Kunin angegebenen Verfahren quatemisert. Anionenaustauschharze
dieser Art werden unter der Bezeichnung Dowex-2, Dowex-20, Amberlite IRA-400, Duolite A-102 und
Permutit S-I in den Handel gebracht].
Verschiedene Säureadditionssalze des lincomycin S können durch Neutralisierung der freien Base mit geeigneten
Säuren bis zu einem pH-Wert von weniger als 7 und vorteilhafterweise bis zu einem pH-Wert zwischen 2 und 6 hergestellt
werden. Geeignete Säuren für diesen Zweck sind unter anderem Chlorwasserstoff-, Schwefel-, Phosphor-, Essig-,
Bernstein-, Zitronen-, Milch-, Malein-, Pumar-, Pamoe-, Cholin-, Palmitin-, Schleim-, Kampfer-, Glutar-, Glykol-,
Phthal-, Wein-, Laurin-, Stearin-, Salicyl-, 3-Phenylsalicyl-,
5-Phenylsalicycl-, 3-Methylglutar-, Orthosulfobenzoe-,
Cyclohexansulfam-, Cyclopentanpropion-, 1,2-Cyclohexandicarbon-,
4-Cyclohexencarbon-, Octadecenylbernstein-, Octenylbernstein-,
Methansulfon-, Benzolsulfon-, Helianth-, Heinecke-,
Dimethyldithiocarbamin-, Sorbin-, Monochloreseig-Undecylen-,
4'-Hydroxyazobenzol-4-aulfon-, Octadecylschwefel-,
Pikrin-, Benzoe-, Zimtsäure und ähnliche Säuren.
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Salze des Lincomycin S, können für dieselben biologischen Zwecke wie die freie Base verwendet werden, oder
sie können zur Qualitätssteigerung des Antibiotikums durch aufeinanderfolgende Umwandlungen des Antibiotikums aus der
protonisierten in die nichtprotonisierten Formen und umgekehrt, insbesondere im Wechsel mit anderen Arten von Behandlungen,
beispielsweise Lösungsmittelextraktionen und
Waschungen, Chromatographie und fraktionierte Flüssigdienen
Flüssig-Extraktionen,*Das Antibiotikum kann beispielsweise
in ein unlösliches Salz, z.B. das Pikrat, umgewandelt werden, welches Reinigungsverfahren unterworfen werden kann,
und das dann dazu benutzt werden kann, durch Behandlung mit Alkali die freie Base des Antibiotikums zurückzugewinnen.
Oder das Antibiotikum kann in ein wasserlösliches Salz, z.B. das Hydrochlorid oder Sulfat, umgewandelt werden, und die
wässrige Lösung des Salzes kann mit verschiedenen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln extrahiert werden,-bevor
durch Behandlung mit Alkali die freie Base des Antibiotikums aus der so extrahierten sauren Lösung zurückgewonnen wird.
Lincomycin S kann dazu verwendet werden, Staphylococcus aureus auf gewaschenen und gelagerten Nahrungsmittelgerätschaften
zu bekämpfen. Es kann auch als Desinfektionsmittel für verschiedene zahnmedizinische und medizinische
Gerätschaften, die mit Staphylococcus aureus
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infiziert sind, verwendet werden. Lincomycin S ist gegen Bacillus subtilis wirksam und kann zur Behandlung der
Brutplätze der Seidenraupe verwendet werden, um Infektionen, die durch diesen Organismus verursacht werden, zu verhindern
oder zu verringern. Es kann auch dazu verwendet werden, Geruch, der durch diesen Organismus bei Fischen
und in Pischkisten verursacht wird, zu vermindern oder zu verhindern.
Die folgenden Beispiele beschrieben bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens. Alle
Prozentangaben sind Gewichtsprozente und alle Lösungsmittelmischungen werden in Volumenteilen angegeben, falls nicht
anders vermerkt.
Beispiel 1 - Lincomycin S Fermentation.
Eine Bodenschrägkultur von Strptomyces lincolnensis
var. lincolnensis, NRRL 2936, wird dazu verwendet, eine Reihe von 500-ml-Erlmeyerkolben zu beimpfen; jeder Kolben
enthält 100 ml eines Keimmediums der folgenden Zusammensetzung:
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Yeastolac* 10 g
Glucosemonohydrat 10 g
N-Z-Amin B** 5 g
Leitungswasser q.s. ad 1 Liter
* Yeastolac ist ein Proteinhydrolysat von Hefezellen.
** N-Z-Amin B ist.ein Sheffield's Enzymatisches Casein-Hydrolysat·
Der pH-Wert des Keimmediums ist nach der Sterilisation ungefähr 7,3. Die Keimung wird zwei Tage lang bei
28° C auf einer Gump-Rotationsschüttelmaschine bei 250 U/min,
bei einem Hub von 63»5 mm bebrütet.
Ein 5 f> Inokulum der oben beschriebenen Keimung
(5 ml) wird in eine Reihe von 500-ml-Erlmeyerkolben gegeben.
Jeder Kolben enthält 100 ml des folgenden Fennentat ionsmediums:
Glucosemonohydrat 30 g
Natriumeitrat 3g
ZnSO4.7H2O 0,001 g
PeSO4.7H2O 0,001 g
MgSO4 1 g
K2HPO4 2,5 g
NaCl 0,5 g
NH4NO3 2,0 g
Entönisiertes Wasser q.s. ad 1 Liter
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Das (Jlucosemo no hydra t und das Natriumeitrat werden
getrennt von den Salzen sterilisiert. Der pH-Wert des Fermentationsmediums liegt nach der Sterilisation im
Bereich von 7,3 bis 7,8. Die beimpften Fermentationskolben werden auf einer Gump-RotationsschUttelmaschine,
die mit"250 U/min, bei einem Hub von 63,5 mm arbeitet,
befestigt. Die Schüttelmaschine befindet sich in einem Brutraum, dessen Temperatur auf 28° C gehalten wird. Nach
72 Stunden Permentationszeit werden 500 mg/Liter DL-Aethionin
aseptisch in die Fermentationskolben gegeben. Die Fermentationskolben werden nach 6 Tagen aufgearbeitet.
In ähnlicher Weise können die Fermentationen mit L-Aethionin anstelle von DL-Aethionin durchgeführt werden.
Gewinnung.
Die Gesamtbrühe aus einer Lincomycin-S-Fermentation,
wie oben beschrieben, wird filtriert, wobei - falls erforderlich - ein Filterhilfsmittel, z.B. Kieselgur, verwendet
wird. Der Myzelkuchen wird mit Wasser gewaschen, und dann verworfen. Das mit der filtrierten Brühe vereinigte
Waschwasser wird mit einer 50 #igen Lösung von Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 10,0 eingestellt und dann
dreimal mit je einem Viertel dee Volumens an Methylenchlorid
extrahiert. Die Methylenchloridextrakte werden vereinigt
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und zu einem OeI eingedampft.
Ein öliges Produkt, das Lincomycin S, wie oben beschrieben, enthält, wird in methanolischer Chlorwasserstoffsäure
bei einem pH-Wert von ca. 2,0 gelöst. Giesst man diese Lösung in Aether, so bildet sich ein
Niederschlag. Dieser Niederschlag, der aus Lincomycin, Lincomycin B, Lincomycin C und Lincomycin S besteht, wird
durch Filtration isoliert. Dieses Präparat wird dann auf eine Silikagelchromatographiesäule gegeben, die auf folgende
Weise hergestellt wird:
Silikagel (Merck-Darmstadt No. 7734, 0,05 - 0,20 mm) wird in ein Glasrohr (65 mm innerer Durchmesser) gefüllt
und unter Atmosphärendruck absitzen gelassen. Das Lincomycin S enthaltende Präparat, wie oben beschrieben, wird in absolutem
Methanol gelöst. Diese Lösung wird mit Silikagel zu einem Srei angerieben, und die Mischung wird im Vakuum ca.
Stunden lang getrocknet. Das Material wird oben auf die Silikagelsäule gegeben. Dann wird Silikagel über diese
Schicht gefüllt, und die Säule wird mit einem Lösungsmittelsystem,
das aus Methyläthylketon:Aceton:Wasser (100:30:5) besteht, eluiert.
Fraktionen, die nur Lincomycin S enthalten, werden - 18 -
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vor den anderen Lincomycinen aus der Säule eluiert. Das
Vorhandensein von Lincomycin S wird durch Dünnschicht Chromatographie,
wie oben beschrieben, bestimmt. Die Fraktionen, die nur Lincomycin S enthalten, werden gesammelt und zur
Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 1 η methanolischer Chlorwasserstoffsäure bei einem pH-Wert von ca. 2,0 gelöst.
Diese Lösung wird wiederum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in absolutem Methanol gelöst, und diese
Lösung wird mit Aether gemischt. Während die Mischung in einem Rotationsvakuumverdampfer langsam eingedampft wird,
kristallisiert ein farbloser Stoff, der durch Dünnschichtchromatographie als Lincomycin S identifiziert wird. Diese
Kristalle werden durch Filtration isoliert und getrocknet. Weiteres kristallines Lincomycin S wird aus dem Filtrat
der obigen Kristallisation durch Eindampfen des Filtrates zur Trockne gewonnen. Der Rückstand wird in absolutem
Methanol gelöst, und diese Lösung wird mit Aethyläther gemischt. Die Mischung wird ca. 4 Stunden lang gerührt.
Lincomycin-S-Kristalle, die sich bilden, werden durch Filtration
abgetrennt und getrocknet.
Chemische und physikalische Eigenschaften von Lincomycin S Hydrochlorid.
Kristallines Lincomycin S Hydrochlorid hat die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:
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P O Γ, Q /,
Ι·'»-» ν J Ar
Berechnet für C2OH38N2°6S·HC1#Η20ί C 49»12j H 8»47* ° 22»95j
N 5,74; S 6,57; Cl 7,27.
Molekulargewi cht: Optische Drehung:
IR-Spektrum:
. 488, 5 (berechnet).
[α]25 « :144,5° (c, 0,38 in
Wasser).
Bei der Aufnahme in KBr-Presslingen zeigt Lincomycin S Hydrochlorid Maxima bei den
folgenden Wellenlängen, die in reziproken Zentimetern angegeben sindt
| 3350 (S) | 1456 (M) | 993 | (M) |
| 3060 (M) | 1392 (M) | 977 | (M) |
| 2960 (S) | 1320 (M) | 900 | (W) |
| 2920 (S) | 1264 (M) | 867 | (W) |
| 2865 (M) | 1210 (W) | 801 | (M) |
| 2720 (W) | 1143 (M) | 750 | (W) |
| 1680 (S) | 1095 (S) | 707 | (W) |
| 1562 (S) | 1077 (S) | 675 | (M) |
| 1545 (M) | 1048 (S) |
Bei Aufnahme in Mineralölsuspension zeigt Lincomycin S Hydrochlorid Maxima bei den folgenden Wellenlängen, die
in reziproken Zentimetern angegeben sind:
- 20 -
ORIGINAL INSPECTED
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| 3310 | (S) | (OeI) | 1545 | (M) | 1095 | (S) |
| 3060 | (M) | (OeI) | 1460 | (S) (OeI) | 1077 | (S) |
| 2950 | (S) | (OeI) | 1378 | (S) (OeI) | 1049 | (S) |
| 2920 | (S) | (OeI) | 1365 | (M) | 991 | (M) |
| 2860 | (S) | 1338 | (M) | 977 | (M) | |
| 2850 | (S) | 1300 | (M) | 900 | (W) | |
| 2720 | (M) | 1262 | (M) | 867 | (M) | |
| 1683 | (S) | 1210 | (M) | 801 | (M) | |
| 1567 | (M) | 1142 | (M) | 713 | (M) | |
| 675 | (M) | |||||
Die Bandenintensitäten in den obigen IR-Spektren
werden mit MS", MM", bzw. "W11 bezeichnet und sind annähernd
in Begriffen des Hintergrunds in der Nähe der Banden ausgedrückt. Eine "S'^Bande ist eine Bande, die
die gleiche Grössenordnung der Intensität hat, wie die
stärkste Bande im Spektrum; "M"-Banden haben ein Drittel
bis zwei Drittel der Intensität wie die stärkste Bande und "W-Banden haben weniger als ein Drittel der Intensität
der stärksten Bande.
Löslichkeit: Lincomycin S Hydrochlorid ist in Wasser und Methanol löslich. Es ist in 95 #igem Aethanol
oder absolutem Aethanol massig löslich und in Aceton, Aethylacetat, chlorierten und gesättigten Kohlenwasser-
- 21 -
109820/2231
Stofflösungsmitteln unlöslich.
Das antibakterielle Spektrum für die obige Tabelle I wurde unter Verwendung eines Röhrchen-Verdünnungs-Be- r
stimmungsverfahren bestimmt, wobei als Medium BHI (Brain
Heart Infusion Broth, Difco, Detroit, Michigan) verwendet wurde. Bestimmungsröhrchen (18 χ 150 mm ) wurden in üblicher
Weise hergestellt, wie es bei Snell, E.E., Vitamin Methods
Vol. I, Academic Press, Inc., New York 1950, S. 372 beschrieben ist. Testorganismen, die 18 Stunden lang bei
37° C gewachsen waren, wurden zur Beimpfung des Testmediums verwendet. Die Analyse wurde nach 20 Stunden abgelesen.
- 22 -
ORIGINAL INSPECTED
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Claims (1)
1695245
Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Lincomycin S,
CONH
dadurch gekennzeichnet, dass man einen lincomycinproduzierenden Mikroorganismus in Gegenwart einer ausreichenden Menge
Aethionin unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen NähriTiedium
züchtet, bis dem Medium durch die Produktion von Lincomycin S eine erhebliche Aktivität verliehen worden
ist, und das so produzierte Lincomycin S im wesentlichen frei von anderen Lin,comycinen isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als lincomycinproduzierenden Mikroorganismus
Streptomyces lincolnensis var. lincolnensis verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man das im wesentlichen reine und von anderen Lincomycinen
freie Lincomycin S isoliert, indem man ein Präparat, das Lincomycin S und andere Lincomycine enthält, durch eine
Chromatographiesaule fHessen lässt, die Chromatographiesäule
mit einem Lösungsmittelsystem für Lincomycin S eluiert
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und das Lincomycin S in seiner im wesentlichen reinen,
1695345
von anderen Lincomycinen freien Form aus den Sluaten gewinnt *
k* Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
dass man als Chromatagraphiesä'ule eine Silikagelsäule verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
dass man als Blutionslösungsmittel ein Gemisch aus Methylethylketon,
Aceton und Wasser im Verhältnis von 100:30:5
verwendet.
6. Lincomycin S, eine Verbindung der allgemeinen Formel
CONII
in ihrer praktisch reinen Form im wesentlichen frei von anderen Lincomycinen.
7. Bin Säureadditionssalz von Lincomycin S gemäß Anspruch
in seiner praktisch reinen Form im wesentlichen frei von anderen Lincomycinen.
ORIGINAL INSPECTED
109820/2231
1695345
8. Hydrochloric! von Lincomycin S gemäß Anspruch
in seiner praktisch reinen Form im wesentlichen frei von anderen Lincomyeinen,
9. Hydrochlorid gemäß Anspruch 8 in seiner praktisch
reinen, kristallinen Form im wesentlichen frei von anderen Lincomyeinen·
Für: The Upjohn Company
Kalamazoo, Mich., (USA)
Rech
109820/2231
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US558274A US3395139A (en) | 1966-06-17 | 1966-06-17 | Lincomycin s and process for producing the same |
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|---|---|
| DE1695945A1 true DE1695945A1 (de) | 1971-05-13 |
Family
ID=24228889
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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| DE (1) | DE1695945A1 (de) |
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