DE2801399A1

DE2801399A1 - Fermentationsverfahren

Info

Publication number: DE2801399A1
Application number: DE19782801399
Authority: DE
Inventors: David Cecil Aldridge; Roger Bowling; John Charles Swait
Original assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Current assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Priority date: 1977-01-13
Filing date: 1978-01-13
Publication date: 1978-07-20
Also published as: DK4978A; NL7800243A; NZ186138A; IE45855B1; FR2377449A1; AU3225078A; IT1158425B; IT7819260A0; SE7800363L; ES465948A1; GR62086B; JPS53109995A; IE45855L; FI780041A; US4178213A; NO774408L; CA1108078A

Description

Dr. Richard Kneißl

Widenmayerstr.

8000 München 22

München, den 13. Januar 1978

Mappe 24381

ICI Case PH 29278/29408

IMPERIAL CHEMICAL INDUSTRIES LTD. London, Großbritannien

Fermentationsverfahren

Priorität: 13. Januar 1977, Großbritannien 14. März 1977 , Großbritannien

Die Erfindung bezieht sich auf ein Fermentationsverfahren und insbesondere auf ein Fermentationsverfahren für die Herstellung von (+)-2-(5ß-n-Butyl-4ß-hydroxy-2-oxo-tetrahydrofuran-3ßyl)-20t-methylessigsäure, welche wertvolle Geschwürheilungseigenschaften besitzt.

Die Herstellung von Dihydrocanadensolid zusammen mit bis zu 3 % (G/G) Canadensolid durch Fermentation von PenicLllium cana-

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dense und insbesondere des mit Nr. 95493 des Commonwealth Mycological Institute, Kew, England, identifizierten Stamms in einem wäßrigen Nährmedium ist in der GB-PS 1 434 595 beschrieben, wobei die Menge des Canadensolids bei längeren Fermentationszeiten verringert wird. Es wurde nunmehr festgestellt, und hierin liegt die Erfindung, daß unerwarteterweise das Monolacton (+)-2-(5ß-n-Butyl-4ß-hydroxy-2-oxo-tetrahydrofuran-3ßyl) -2<Z-methylessigsäure erhalten werden kann, wenn das Nährmedium aus einer solchen Fermentation (oder aus einer Fermentation eines verwandten Organismus) bei einem pH innerhalb eines bestimmten Bereichs einer Lösungsmittelextraktion unterworfen wird,

Demgemäß betrifft die Erfindung ein Fermentationsverfahren zur Herstellung von (+)-2-(5ß-n-Butyl-4ß-hydroxy-2-oxo-tetrahydrofuran-3ß-yl)-2OHmethylessigsäure der Formel:

welches dadurch ausgeführt wird, daß man einen Dihydrocanadensolid liefernden Stamm einer Spezies der Art Penicillium oder der Art Aspergillus in einem wäßrigen Nährmedium, das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff enthält, kultiviert, das Kulturfiltrat bei einem pH von 3,0-7,0 mit einem mit Wasser weitgehend unmischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert und schließlich den Extrakt zur Trockene eindampft.

Es wird darauf hingewiesen, daß die in Formel I angegebene Stereochemie relativ ist und daß die absolute Konfiguration in der Tat das Spiegelbild der angegebenen sein kann. Der Zweckmäßigkeit halber wird das ctß-System zur Darstellung der Stereochemie in der gesamten Beschreibung verwendet. Die Numerierung basiert auf 2-(2-Oxo-tetrahydrofuran-3-yl)essigsäure der Formel:

Rl; ^;M29/ UB73

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In dieser Beschreibung bedeutet der Ausdruck "Dihydrocanadensolid liefernder Stamm einer Spezies der Art Penicillium oder Aspergillus" eine Spezies der Art Penicillium oder Aspergillus, die bei Kultivierung in einem wäßrigen Nährmedium, wie es hier beschrieben wird, unter anschließender Extraktion des dabei erhaltenen Kulturfiltrats mit einem mit Wasser weitgehend unmischbaren organischen Lösungsmittel, wie es hier beschrieben ist, bei einem pH von weniger als 3,0 und abschließende Eindampfung des Extrakts zur Trockene Dihydrocanadensolid liefert.

Eine geeignete Spezies der Art Penicillium ist beispielsweise die Spezies Penicillium canadense, wie z.B. der Stamm, der vom Commonwealth Mycological Institute (CMI), Kew, England, als Nr. 95493 identifiziert wird, oder die Spezies Penicillium arenicola, wie z.B. der Stamm, der vom Centraalbureaü voor Schimmelcultures (CBS), Baarn, Niederlande, als Nr. 555.70 identifiziert wird.

Eine geeignete Spezies der Art Aspergillus ist beispielsweise die Spezies Aspergillus terricola var. indicus, beispielsweise der als CBS Nr. 167.63 identifizierte Stamm.

Ein besonders bevorzugter Stamm einer Spezies der Art Penicillium ist jedoch der oben als CMI Nr. 95493 identifizierte Stamm.

Eine geeignete Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff ist beispielsweise Glucose, Sucrose oder Molasse, wovon Glucose bevorzugt wird. Die Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff ist im allgemeinen im Nährmedium in einer Konzentration von 2 bis 12 Gew.-% und vorzugsweise in einer Konzentration von 8 bis 10 Gew.-% vorhanden.

Eine geeignete Quelle für assimilierbaren Stickstoff kann zweck-

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mäßig beispielsweise durch ein Ammoniumsalz einer anorganischen Säure, wie z.B. Phosphor-, Salz- oder Schwefelsäure, durch ein Ammoniumsalz einer organischen Säure, wie z.B. Weinoder Essigsäure, oder durch eine Quelle für organischen Stickstoff, wie z.B. ein Hefeextrakt, geliefert werden. Die Quelle für assimilierbaren Stickstoff ist im allgemeinen im Nährmedium in einer solchen Menge vorhanden,daß eine Konzentration von 0,01 bis 0,10 Gew.-% elementarem Stickstoff und vorzugsweise 0,02 bis O,O4 Gew.-% elementarem Stickstoff im Medium verfügbar ist.

Zusätzlich wird das Medium im allgemeinen auch kleinere Mengen essentieller Elemente enthalten, wie z.B. Phosphor (beispielsweise als Kalium-dihydrogen-phosphat oder Diammonium-hydrogenphosphat), Magnesium (beispielsweise als Magnesiumcarbonat oder -sulfat), Schwefel (beispielsweise als ein Metallsulfat) und Kalium (beispielsweise als Kaliumcarbonat oder -chlorid), und zwar zusammen mit im allgemeinen noch kleineren Mengen ein oder mehrerer sog. Spurenelemente, wie z.B. Eisen, Kupfer, Zink, Mangan oder Molybdän, in Form geeigneter Salze.

Die Kultivierung wird zweckmäßig bei einer Temperatur im Bereich von beispielsweise 18-30 C ausgeführt, erfolgt jedoch vorzugsweise im Bereich von 24-27°C.

Das Fermentationsverfahren kann entweder unter Verwendung herkömmlicher Oberflächenkulturbedingungen oder unter Verwendung herkömmlicher belüfteter gerührter Kulturbedingungen, welche bevorzugt werden, ausgeführt werden. Wenn gerührte KuItürbedingungen verwendet werden, dann wird die Fermentation vorzugsweise mindestens 7 Tage ausgeführt, bevor die Filtration und Extraktion erfolgt.

Das Fermentationsverfahren wird vorzugsweise so ausgeführt, daß der pH des Nährmediums im allgemeinen pH-Bereich von 4,0-5,8 und zu Beginn bei oder in der Nähe von 4,5, beispielsweise bei 4,3-4,8, liegt. Der pH kann zweckmäßig beispielsweise durch äußere Maßnahmen eingestellt werden, beispielsweise durch perio-

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dischen Zusatz einer starken Base, wie z.B. Kaliumhydroxid, oder durch innere Maßnahmen, beispielsweise durch die Einverleibung eines geeigneten Puffers, wie z.B. Natrium-hydrogenmalat, Trinatrium-citrat oder Natriumlactat.

Zwar kann die Verbindung der Formel I aus dem KuIturfiltrat (erhalten aus der Fermentationsbouillon) durch Extraktion bei einem pH im Bereich von 3,0-7,0 mit einem weitgehend mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel isoliert werden, jedoch liegt ein bevorzugter pH, bei welchem die Extraktion des KuI-turfiltrats ausgeführt werden soll, im Bereich von beispielsweise 3,8-5,0 und insbesondere im Bereich von 4,0-4,5.

Ein geeignetes, weitgehend mit Wasser unmischbares organisches Lösungsmittel ist beispielsweise Chloroform, Äthylacetat oder Butylacetat. Von diesen wird Äthylacetat bevorzugt. Die Eindampfung der Extrakte zur Trockene wird vorzugsweise so rasch wie möglich unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30°C ausgeführt.

Wie bereits oben festgestellt besitzt die Verbindung der Formel I, welche durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich ist, wertvolle Geschwürheilungseigenschaften. Diese Eigenschaften können zweckmäßig anhand eines Tests demonstriert werden, bei welchem die zu untersuchende Verbindung oral oder subkutan täglich während 21 Tagen an Ratten verabfolgt wird, in welchen durch Anwendung von Essigsäure im Zwölffingerdarm ein Zwölffingerdarmgeschwür erzeugt worden ist. Die Geschwürheilungsaktivität wird dann auf der Basis einer wesentlichen Verringerung der Größe oder der Häufigkeit der Zwölffingerdarmgeschwüre im Vergleich zu Geschwüren einer undosierten Vergleichsgruppe bestimmt. Bei diesem Test zeigt die Verbindung der Formel I eine wesentliche Aktivität bei einer täglichen oralen Dosis von 5 mg/kg. Während der Testperiode wurden keinerlei Anzeichen von offensichtlicher Toxizität der Verbindung der Formel I festgestellt.

Wenn eine Verbindung der Formel I zur Erzielung eines Geschwür-

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heilungseffekts bei Warmblütern verwendet wird, dann wird sie, vorzugsweise als pharmazeutische Zusammensetzung, mit einer täglichen oralen oder subkutanen Dosis von 50 mg/kg oder weniger, vorzugsweise 0,25 bis 5 mg/kg, verabreicht, wobei diese Dosis nötigenfalls in Abständen von 4-5 st wiederholt wird. Beim Menschen entspricht dies einer Dosis von 12,5-250 mg viermal am Tag.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, worin "Oxoid", "Cerelose" und "Gas-chrom Q" Warenzeichen sind. Die ggf. angegebenen Ausbeuten sind rein erläuternd und sind nicht als maximal erreichbare Ausbeuten anzusehen.

Beispiel 1

Eine Agarnährmediumschrägkultur (45 ml) wurde hergestellt, die folgendes enthielt:

Kartoffelextrakt (von 200 g geschälten und zerkleinerten Kartoffeln, gekocht in 1 1 entsalztem Wasser während 20 min und dann ablaufen gelassen)

Glucose (Sorte "Cerelose") 20 g

Agar ("Oxoid" Nr. 3) 20 g

Entsalztes Wasser auf 1 1

Sie wurde durch 20 min dauerndes Kochen bei 1,05 at sterilisiert. Die Schrägkultur wurde mit Penicillium canadense C.M.I. 95493 (vorher auf einem Agarmedium gehalten, das 2,0 % G/V Kartoffelextrakt, 2,0 % G/V Karottenextrakt und 2,5 % G/V "Oxoid¹¹-Agar Nr. 3 enthielt) inokuliert und 24 Tage bei 25°C inkubiert. Das Mycel und die Sporen der Schrägkultur wurden in steriles Wasser (100 ml) abgerieben, und die dabei erhaltene Suspension wurde zu 1 1 Medium zugegeben, das folgendes enthielt:

D(+)-Weinsäure 0,266 % (G/V)

Diammonium-tartrat O,266 % (G/V)

Diammonium-hydrogen-phosphat 0,04 % (G/V)

Kaliumcarbonat (wasserfrei) 0,04 % (G/V)

Magnesiumcarbonat-trihydrat 0,027 % (G/V)

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Ammoniumsulfat O,016 % (G/V)

Zinksulfat-heptahydrat 0,0042 % (G/V)

Eisen(II)-sulfat-heptahydrat 0,0042 % (G/V)

Hefeextrakt ("Oxoid") 0,10 % (G/V)

Glucose (Sorte "Cerelose") 5,0 % (G/V)

Entsalztes Wasser auf 100,0 %

und welches durch Zusatz von wäßriger Kaliumhydroxidlösung auf pH 5,6 eingestellt und dann 30 min in einem Autoklaven unter 1,05 at sterilisiert wurde. Das Gemisch wurde dann in einer 2 fassenden konischen Flasche unter Verwendung eines Drehschüttlers mit 200 U/min während 2 Tagen bei 25°C geschüttelt. Zwei gesonderte Portionen (200 ml) der resultierenden Bouillon wurden zur Inokulierung von zwei gesonderten Portionen (1 1) eines Inokulummediums A verwendet, das folgendes enthielt:

Glucoce (Sorte "Cerelose") 5,0 % (G/V)

Diammonium-tartrat 0,24 % (G/V)

Kalium-dihydrogen-phosphat 0,50 % (G/V)

Magnesiumsulfat-heptahydrat 0,1 % (G/V)

Spurenelementkonzentrat 0,2 % (V/V)

Entsalztes Wasser auf 100,0 %

und welches durch Zusatz von wäßriger Kaliumhydroxidlösung auf pH 5,6 eingestellt und dann in einem Autoklaven während 30 Min bei 1,05 at sterilisiert worden war.

Das Spurenelementkonzentrat enthielt folgende Bestandteile:

Eisen(II)-sulfat-heptahydrat 0,1 % (G/V)

Kupfer(II)-sulfat-pentahydrat 0,015 % (G/V)

Zinksulfat-heptahydrat 0,1 % (G/V)

Mangansulfat-tetrahydrat 0,01 % (G/V)

Kaliummolybdat 0,01 % (G/V)

Entsalztes Wasser auf 100,0 %

Das resultierende Gemisch wurde mit 200 U/min auf einem Drehschüttler 5 Tage bei 25°C geschüttelt.

Der Inhalt der Kolben wurde in einen 40 1 fassenden Glasfermentationsbehälter zugegeben, der 33 1 eines Produktionsmediums

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enthielt, welches dem oben beschriebenen Inokulummedium A ähnlich war, wobei aber weitere 5,0 % (G/V) Glucose (Sorte "Cerelose") und 0,45 % (G/V) Natrium-hydrogen-malat zugesetzt worden waren. (Der pH des Produktionsmediums war zunächst auf 5,6 eingestellt und das Produktionsmedium in einem Autoklaven sterilisiert worden, worauf der pH 5,75 betrug.)

Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von 25°C unter Rühren mit 410 ü/min und Belüftung mit einer Geschwindigkeit von 15 l/min ausgeführt. Nach einer Inkubationszeit von 10 Tagen wurde die Bouillon filtriert, worauf der pH des Kulturfiltrats von 5,8 durch Zusatz von Salzsäure auf 4,5 eingestellt wurde. Eine Portion (15 1) des Filtrats wurde dann mit Äthylacetat (2x5 1) extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, getrocknet (Na₂SO₄) und unter vermindertem Druck bei einer Temperatur nicht über 30 C zur Trockene eingedampft, wobei ein halbfester Rückstand (37,7 g) erhalten wurde. Der Rückstand wurde mit Äther (100 ml) trituriert und filtriert, und der so erhaltene Feststoff wurde mit Äther (2 χ 20 ml) gewaschen, wobei (+)-2-(5ß-n-Butyl-4ß-hydroxy-2-oxo-tetrahydrofuran-3ß-yl)-2a-methylessigsäure (10,3 g) erhalten wurde. Diese Verbindung wurde weiter gereinigt, indem sie in dem geringsten Volumen Aceton mit 2O-25°C aufgelöst und unter Rühren mit dem 5-10fachen Volumen an leichtem Petroläther (Kp 60-8O⁰C) versetzt wurde. Die resultierende reine kristalline Ausfällung wurde filtriert und mit leichtem Petroläther (Kp 6O-8O°C) gewaschen. Es wurde ein Material mit Fp 114-116°C, faj^ + 77 (c, 2,5; Methanol) von R_f 0,45 (auf 0,2 mm Silicagelplatten, entwickelt in Chloroform/ Methanol/Essigsäure 90:5:5) und mit dem folgenden charakteristischen NMR-Spektrum erhalten:

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Signal	6	Type	äg-Aceton	Kupplungs konstante <^Hz>	d^-Aceton + O	Type	TCAI
5ß-n-Butyl	0,89-1,72	m	Proton Nr.			m	Kupplungs konstante <^Hz>
5Ot-H	4,31	dt	9	J₁ = 3 ^J2 * ⁷	0,90-1,72	dt
3S-O-CO₂H H	1,46	d	1	J - 6,5	4,6	d	J₁ - 3 J₂ ¹ = 7
CH₃ 3S-C-CO₂H	2,86	m	3		1,46	dq	J = 6,5
3oC-H	4,49 2,86	dd m	1	J₁ = 3 ^J2 ^{= 4}'⁵	2,86	dd dd	J₁ = 6,5 J₂ = 10
		1 1	5,75 3,2	J₁ = 3 J₂ = 4,5 J₁ = 4,5 J₂ = 10

CD CO (JD

^" 2ÖÜ1399

Bemerkungen zur Tabelle

Das NMR-Spektrum wurde bei 100 MH bestimmt, wobei Tetramethylsilan als innerer Bezug verwendet wurde. Es wurden die üblichen Abkürzungen für komplexe Wechselwirkungen verwendet, wie z.B. :

m: Multiplet, d: Doublet, t: Triplet, q : Quartet. TCAI steht für Trichloroacetylisocyanat.

Beispiel 2

Glucose (Sorte "Cerelose") 20 g

Agar ("Oxoid" Nr. 3) 20 g

Entsalztes Wasser auf 1 1

Sie wurde durch 20 min dauerndes Kochen bei 1,05 at sterilisiert. Die Schrägkultur wurde mit Penicillium canadense C.M.I. 95493 (vorher auf einemAgarmedium gehalten, das 2,0 % G/V Kartoffelextrakt, 2,0 % G/V Karottenextrakt und 2,5 % G/V "Oxoid"-Agar Nr. 3 enthielt) inokuliert und 20 Tage bei 25°C inkubiert. Das Mycel und Sporen wurden dann von der Schrägkultur herunter in steriles Wasser (100 ml) gerieben, und die dabei erhaltene Suspension wurde zu 1 1 eines Inokulummediums der gleichen Zusammensetzung wie das Inokulummedium A in Beispiel 1 zugegeben, wobei dieses Medium vorher durch Zusatz von wäßriger Kaliumhydroxidlösung auf pH 5,6 eingestellt und dann in einem Auto-

2
klaven während 30 min bei 1,05 kg/cm sterilisiert worden war.

Das so erhaltene Gemisch wurde mit 200 U/min auf einem Drehschüttler 7 Tage bei 25°C geschüttelt.

Zwei solche Portionen des dabei erhaltenen Inokulumgemischs wur den in einen 40 1 fassenden Glasfermentationsbehälter eingebracht, der 33 1 eines Produktionsmediums enthielt, das dem In-

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okulummedium A von Beispiel 1 ähnlich war, das aber zusätzlich 5,0 % (G/V) Glucose (Sorte "Cerelose") und 0,45 % (G/V) Natrium-hydrogen-malat enthielt. (Der pH des Produktionsmediums war vorher auf 5,6 eingestellt und das Produktionsmedium in einem Autoklaven sterilisiert worden, worauf der pH 5,5 betrug.)

Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von 25°C unter Rühren mit 410 U/min und mit einer Belüftungsgeschwindigkeit von 15 l/min ausgeführt. Nach einer Inkubationszeit von 14 Tagen wurde die Kultur filtriert, worauf der pH des Kulturfiltrats von 5,3 durch Zusatz von Salzsäure auf 4,0 eingestellt wurde. Das Filtrat (12,5 1) wurde dann mit Äthylacetat (2x61) extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, getrocknet (Na-SO.) und unter vermindertem Druck bei einer Temperatur nicht über 30°C zur Trockene eingedampft, wobei ein halbfester Rückstand erhalten wurde. Dieser Rückstand wurde mit Äther (60 ml) trituriert und filtriert, und der so erhaltene Feststoff wurde mit Äther (2 χ 20 ml) gewaschen, wobei (+)-2-(5ß-n-Butyl~4ß-hydroxy-2-oxo-tetrahydrofuran-3ß-yl)-2a-methylessigsäure (10,4 g) erhalten wurde, die mit dem in Beispiel 1 isolierten Material identisch war, was durch IR- und NMR-Spektroskopie und TLC-Vergleich ermittelt wurde.

Beispiel 3

Ein Inokulum von Penicillium canadense (CMI Nr. 95493) wurde wie in Beispiel 2 hergestellt. Eine Portion (500 ml) dieses Inokulums wurde in einen 14 1 fassenden Glasfermentationsbehälter eingebracht, der 12 1 eines Produktionsmediums enthielt, das folgendes aufwies:

Glucose Sorte "Cerelose" 10 % (G/V)

Diammonium-tartrat 0,24 % (G/V)

Kalium-dihydrogen-orthophosphat 0,50 % (G/V)

Magnesiumsulfat-heptahydrat 0,10 % (G/V)

Spurenelementkonzentrat"¹" 0,20 % (V/V)

Entsalztes Wasser auf 100 %

( Identisch mit der Zusammensetzung von Beispiel 1).

/tier pH dieses Mediums war durch Zusatz von wäßriger Kalium-

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hydroxidlösung auf 5,6 eingestellt worden, und das wäßrige Medium war dann 30 min bei 1,05 at in einem Autoklaven sterilisiert worden .J

Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von 25 C unter Rühren mit 410 U/min und Belüftung mit einer Geschwindigkeit von 6 l/min ausgeführt. Während der ersten 5 Tage der Fermentation wurde der pH durch automatischen Zusatz von wäßriger Kaliumhydroxidlösung auf 4,3-4,6 gehalten, wobei ein pH-Meter für die Kontrolle verwendet wurde. Hierauf wurde der pH steigen gelassen, so daß nach einer 14tägigen Inkubation der pH der Bouillon 5,1 betrug. Die Bouillon wurde dann filtriert, wobei ein Kulturfiltrat (C) (6,5 1) erhalten wurde.

Eine Portion (6,0 1) des Filtrats C wurde durch Zusatz von Salzsäure auf pH 4,0 eingestellt und dann mit Äthylacetat (2 χ 3 1) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden getrocknet (Na₂SO ) und unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bei oder unter 30 C zur Trockene eingedampft. Der erhaltene halbfeste Rückstand wurde mit Äther (60 ml) trituriert. Das Gemisch wurde filtriert, und der so erhaltene Feststoff wurde mit Äther (2 χ 20 ml) gewaschen, wobei (+)-2-(5ß-n-Butyl-4ßhydroxy-2-oxo-tetrahydrofuran-3ß-yl)-2a-methylessigsäure (6,2 g) erhalten wurde, die mit dem in Beispiel 1 erhaltenen Produkt identisch war, was durch IR- und NMR-Spektroskopie und TLC-Vergleich bestimmt wurde.

Beispiel 4

Eine Portion (500 ml) des Kulturfiltrats C, das in Beispiel 3 erhalten worden war, wurde bei verschiedenen pH-Werten extrahiert, und die erhaltene Menge an (+)-2-(5ß-n-Butyl-4ß-hydroxy-2-oxo-tetrahydrofuran-3ß-yl)-2cr-methylessigsäure (B) wurde durch GLC im Anschluß an die Umwandlung in das Bis(trimethylsilyl)-Derivat unter Verwendung des nachstehenden Verfahrens bestimmt:

Eine Portion des Filtrats C (50 ml) (aus Beispiel 3) wurde auf einen bestimmten pH eingestellt und zweimal mit Äthylacetat (30 ml, dann 15 ml, wobei jede Portion 1 min geschüttelt wurde)

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extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden getrocknet (Na₂SO., 10 g) und filtriert. Der Rückstand wurde mit Äthylacetat (5 ml) gewaschen, und die mit dem FiItrat vereinigten Waschflüssigkeiten wurden mit weiterem Äthylacetat auf ein Volumen von 50 ml gebracht. Eine Portion (50 μΐ) dieser Lösung wurde entnommen und mit analytisch reinem Pyridin (100 μΐ) gemischt, worauf eine Portion (50 ul) einer frisch hergestellten 10 % (V/V) Lösung von Trimethylchlorosilan in Bis(trimethylsilyl) acetamid zugegeben wurde. Nach 1 st bei 2O-25°C wurde dieses Gemisch auf das Bis(trimethylsilyl)-Derivat von B durch Gas/ Flüssigkeitschromatografie, A, untersucht, wobei eine Glaskolonne (1,5 m χ 4 mm) verwendet wurde, die einen Siliconkautschuk , Type E 301 (erhältlich von Phase Separations Ltd., Queensferry, Flintshire, U.K.) enthielt, der auf den teilchenförmigen Diatomeenerdeträger aufgeschichtet war, der als "Gaschrom" Q (80-100 mesh) (erhältlich von Field Instruments Ltd., Orchard Road, Richmond, Surrey, U.K.) bekannt ist.Dabei wurde eine Temperatur von 245°C und ein Stickstoffstrom von 60 ml/min angewendet und ein Flammenionisationsdetektor in einem Pye Uniqam Series 104 Gas Chromatograph (erhältlich von Pye Unicam Ltd., Cambridge, U.K.) herangezogen. Unter diesen Bedingungen hatte das Bis(trimethylsilyl)-Derivat von B eine Verweilzeit von 2,00 min.

Unter Verwendung des obigen Verfahrens wurde gezeigt, daß die folgenden Mengen B aus dem Kulturfiltrat C bei bestimmten pH-Werten extrahiert worden waren:

PH	80	mg von B/l von C
7,0	18
6,5	89
6,0	122
5,5	316
5,0	684
4,5	663
4,0	1275
3,5	1357
3,0	1263
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Beispiel 5

AS

Eine Agarnährmediumschrägkultur (hergestellt wie in Beispiel 1) wurde mit Penicillium arenicola (CBS Nr. 555.70) inokuliert und 12 Tage bei 25°C inkubiert. Das Mycel und die Sporen aus der Schrägkultur wurden in steriles Wasser (100 ml) gerieben. Eine Portion (5 ml) dieser Suspension wurde in einen 500 ml fassenden konischen Kolben eingebracht, der 100 ml des Produktionsmediums von Beispiel 1 enthielt. Der Kolben wurde auf einem Drehschüttler bei 25 C inkubiert.

Nach 14 Tagen wurde die Bouillon filtriert, worauf das Kulturfiltrat durch Zusatz von Salzsäure auf pH 4,0 eingestellt wurde. Das FiItrat wurde dann mit Äthylacetat (2 χ 20 ml) extrahiert. Die Extrakte wurden getrocknet und eingedampft, wie es in den Beispielen 1, 2 und 3 beschrieben ist, wobei ein festes Material erhalten wurde, das (+)-2-(5ß-n-Butyl-4ß-hydroxy-2-oxotetrahydrofuran-3ß-yl)-2a-methylessigsäure ergab, die mit der in Beispiel 1 erhaltenen identisch war, was durch IR- und NMR-Spektroskopie und TLC-Vergleich ermittelt wurde.

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Claims

Patentansprüche;

1. Fermentationsverfahren zur Herstellung von (+)-2-(5ß-n-Butyl-4ß-hydroxy-2-oxo-tetrahydrofuran-3ß-yl)-2a-methylessigsäure der Formel:

ⁿ~^Bu H OH

dadurch gekennzeichnet, daß man einen Dihydrocanadensolid erzeugenden Stamm einer Spezies der Art Penicillium oder der Art Aspergillus in einem wäßrigen Nährmedium, das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff enthält, kultiviert, das Kulturfiltrat bei einem pH von 3,0-7,0 mit einem mit Wasser weitgehend unmischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert und den Extrakt zur Trockene eindampft.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Spezies der Art Penicillium die Spezies Penicillium canadense oder arenicola verwendet wird und daß als Spezies der Art Aspergillus die Spezies Aspergillus terricola var. indicus verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm der Spezies Penicillium canadense derjenige ist, der als CMI Nr. 9549£ identifiziert ist, daß der Stamm der Spezies Penicillium arenicola derjenige ist, der als CBS Nr. 555.70 identifiziert ist und daß der Stamm der Spezies Aspergillus terricola var. indicus derjenige ist, der als CBS Nr. 167.63 identifiziert ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Spezies der Art Penicillium die Spezies Penicillium canadense ist und daß die Spezies der Art Aspergillus die Spezies Aspergillus terricola var. indicus ist.

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Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm der Spezies Penicillium canadense derjenige ist, der als CMI Nr. 9549# identifiziert ist, und daß der Stamm der Spezies Aspergillus terricola var. indicus derjenige ist,
der als CB

S Nr. 167.63 identifiziert ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm der Spezies Penicillium canadense, der als CMI Nr.
95495 identifiziert ist, verwendet wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion bei einem pH im Bereich von 3,8-5,0 ausgeführt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion bei einem pH im Bereich von 4,0-4,5 ausgeführt wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsmittel Chloroform, Äthylacetat oder Butylacetat verwendet wird.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der pH des Nährmediums auf einem pH im allgemeinen Bereich von 4,0-5,8 gehalten wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 4-6, dadurch gekennzeichnet, daß der pH des Nährmediums auf einem pH im Bereich von 4,0-5,O gehalten wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß der pH des Nährmediums zu Beginn auf einem
Wert von 4,3-4,8 gehalten wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10-12, dadurch gekennzeichnet, daß der pH des Nährmediums durch äußere Maßnahmen durch periodischen Zusatz einer starken Base eingehalten wird.

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14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß als starke Base Kaliumhydroxid verwendet wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10-12, dadurch gekennzeichnet, daß der pH des Nährmediums durch innere Maßnahmen durch Einschluß eines geeigneten Puffers eingehalten wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß als Puffer Natrium-hydrogen-malat, Trinatriumcitrat oder Natriumlactat verwendet wird.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung unter Verwendung belüfteter gerührter KuItürbedingungen ausgeführt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß

die Kultivierung während mindestens 7 Tagen ausgeführt wird, bevor die Filtration und Extraktion ausgeführt wird.

19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff aus Glucose, Sucrose oder Molasse besteht.

20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff im Nährmedium in einer Konzentration von 8-10 Gew.-% vorliegt.

21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Quelle für assimilierbaren Stickstoff aus einem Ammoniumsalz von Phosphor-, Salz-, Schwefel-, Wein- oder Essigsäure oder aus einem Hefeextrakt besteht.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Quelle für assimilierbaren Stickstoff im Nährmedium in einer solchen Menge vorliegt, daß eine Konzentration von

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" 28Q1399

0,02-0,04 Gew.-% elementarem Stickstoff im Nährmedium verfügbar ist.

23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einer Temperatur im Bereich von 18-30 C ausgeführt wird.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-22, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einer Temperatur im Bereich von 24-27°C ausgeführt wird.

25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Eindampfen des Extrakts zur Trokkene so rasch wie möglich unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur unter 30 C ausgeführt wird.

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