DE3147726A1 - Antibiotische komplexe, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische mittel, die diese verbindungen enthalten - Google Patents
Antibiotische komplexe, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische mittel, die diese verbindungen enthaltenInfo
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- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
Description
PROF. DR. DR. J. REITSTÖTTER DR. WERNER KINZEBACH
DR. ING. WOLFRAM BUNTE (,β8β-ιβ7β)
REITSTÖTTEH. KINZEBACH ft PARTNER
POSTFACH 7ΘΟ. D-BOOO MÜNCHEN 43
PATENTANWÄLTE
ZUGELASSENEVERTRETER BEIM
EUROPÄISCHEN PATENTAMT EUROPEAN PATENT ATTORNEYS
VNR 104 523
TELEFON: (OBB) 2 71 IB 83 TELEX: ΟΕΖ102ΟΘ ISAR D
BAUERSTRASSE 22. D-BOOO MÜNCHEN AO
BETREFF:
RE
2. Dezember 1981
OURREF: M/2 2 261
LEO PHARMACEUTICAL PRODUCTS LTD. A/S (L0VENS KEMISKE FABRIK PRODUKTIONSAKTIESELSKAB)
Industriparken 55
-DK-2750 Ballerup
Antibiotische Komplexe, Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische Mittel, die diese Verbindungen
enthalten
Μ/22 261 ~8~
Die Erfindung betrifft antibiotisch wirkende Verbindungen und insbesondere einen antibiotisch wirkenden Komplex,
der eine Gruppe nahe verwandter Verbindungen umfaßt. Dieser Komplex wird in der vorliegenden Anmeldung als
Komplex PR-1350 oder einfach PR-1350 bezeichnet.
' Dieser Komplex weist interessante Eigenschaften auf
"bezüglich seiner Verwendung in der Human- und Tiermedizin und als Futtermittelzusatz.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung
von PR-1350, pharmazeutische Mittel, die PR-1350 enthalten, Verfahren zur Herstellung solcher
Mittel und die Verwendung von PR-1350 zur Behandlung von Menschen und Tieren. Die Erfindung betrifft auch
Stämme die PR-1350 produzieren und deren Mutanten.
Der antibiotisch wirkende Komplex PR-1350 wird von einem Pilz produziert, der im Zusammenhang mit der Gewinnung
von Antibiotika produzierenden Pilzen in den Laboratorien der Anmelderin von einer infizierten Agar-Platte isoliert
wurde. Der Organismus wurde taxonomisch vom Centraal-
3^ bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande, als
neuer Stamm von Oidiodendron truncatum Barron klassifiziert und dort unter der Bezeichnung Oidiodendron
truncatum Barron, HL-972, ZP-88 unter der Nummer
CBS 475.78 hinterlegt.
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35
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Oidiodendron gehört zur Gruppe der Fungi imperfecti. Nach N. F. Buchwald in Fungi Imperfecti und unter
Verwendung der Klassifizierungsmethode von Saccardo gehört die Gattung Oidiodendron zu der Familie der
Dematiaceae und zu der Ordnung Hyphomycetales.
Oidiodendron truncatum Barron HL-972, ZP-88 züchtet man in wäßrigem Nährmedium unter submersen aeroben
Bedingungen, bis man einen bestimmten Grad an antibiotischer Aktivität erhält. Zur Herstellung von
kleinen Mengen des Pilzes kann man auch Oberflächenkulturen und Schüttelkolben verwenden. D'er Stamm wird
in einem Nährmedium gezüchtet, das als"Kohlenstoffquelle
beispielsweise ein assimilierbares Kohlenhydrat, und als Stickstoffquelle,'beispielsweise eine assimilierbare
Stickstoffverbindung oder ein proteinhaltiges Material enthält. Bevorzugte Kohlenstoff
lieferende Verbindungen sind Glucose, Saccharose, Glycerin, Malzextrakt, Dextrin, und dergleichen. Bevorzugte
Stickstoff liefernde Substanzen sind Maisquellwasser, Hefe, autolysierte Bierhefe, Sojabohnenmehl,
Baumwollsamenmehl, Fischmehl, Maismehl, Milch-Feststoff,
pankreatisch angedautes Casein, Brennereischlempe, tierische Peptonliquors, Fleisch- und Knochenmasse,
und dergleichen. Vorteilhafterweise werden Kombinationen dieser kohlenstoff- und stickstoff-liefernden Substanzen
verwendet. Es können auch rein "synthetische" Mediaverwendet werden, sie haben jedoch häufig niedrige
Ausbeuten zur Folge. Es ist nicht notwendig, Spurenmetalle, beispielsweise Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt,
Eisen und dergleichen, dem Fermentationsmedium zuzugeben, da vor der Sterilisierung des Fermentationsmediums
Leitungswasser und nicht-gereinigte Ingredienzen als Bestandteile des Mediums verwendet werden.
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Die Herstellung des erfindungsgemäßen Komplexes kann
bei jeder Temperatur durchgeführt werden, die dem zufriedenstellenden Wachstum der Mikroorganismen
förderlich ist, beispielsweise bei Temperaturen zwischen ungefähr 12 und 35 C, insbesondere zwischen ungefähr
• 14 und 30 C und vorzugsweise zwischen ungefähr 16 und
24 0C. Den pH des Mediums hält man ebenfalls bei Werten,
die dem Wachstum der Mikroorganismen': förderlich sind,
beispielsweise bei Werten zwischen 4,0 und 8,0, vorzugsweise zwischen "5,0 und 7,0. In Abhängigkeit vom Nährmedium und den Fermentationsbedingungen'erfolgt die
optimale Herstellung des Komplexes normalerweise in ungefähr 2 bis 10 Tagen.
Zur Züchtung der Pilze in großen Fermentern verwendet man zum Animpfen statt der Sporenform vorzugsweise die
vegetative Form der Mikroorganismen, um die Produktion nicht zu verzögern und die Apparatur voll auszulasten.
Demnach ist es wünschenswert, ein vegetatives Inoculum in einer Nährkultur durch Animpfen dieser Nährkultur
mit einem aliquoten Teil einer Schrägkultür herzustellen.
Hat man auf diese Weise junges, aktives, vegetatives Impfmaterial erhalten, überführt man es aseptisch in
große Fermenter. Das Medium, in dem das vegetative Impfmaterial hergestellt wird, kann gleich oder verschieden
von dem Medium sein, das zur Produktion der erfindungsgemäßen Verbindungen benützt wird, solange die Mikroorganismen
darin zufriedenstellend wachsen.
Obwohl das erfindungsgemäße mikrobiologische Verfahren
unter Verwendung des Stammes Oidiodendron truncatum Barron
HL-972 ZP-88, CBS-475.78 im einzelnen beschrieben ist, ist es nicht auf die Verwendung dieses Mikroorganismus
begrenzt.
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M/22 261 11~
Erfindungsgemäß können auch andere Stämme oder Mutanten
obigen die nach bekannten Verfahren hergestellt werden können, beispielsweise indem man die neuartigen
Microorganismen der Einwirkung von Röntgen- oder UV-Strahlen, Stickstofflost, Phagen und dergleichen aussetzt.
Weitere Oidiodendron truncatum Barron-Stämme sind bekannt
und stehen zur Verfügung, ihre Fähigkeit Antibiotika zu bilden war bislang jedoch unbekannt. Es konnte nun gezeigt
werden, daß diese Stämme bei Anwendung der richtigen
Fermentierungsbedingungen den erfindungsgemäßen Komplex
PR-1350 produzieren.
15
15
Diese Stämme sind beim Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande unter den Nummern CBS 629.70,
CBS 222.65, CBS 115.65 und CBS 114.65 erhältlich.
im Anschluß an die Herstellung des Komplexes PR-1350
kann eine große Zahl an Verfahren, beispielsweise Lösungsmittelextraktion, Verteilungschromatographie,
Chromatographie an Kieselgel, flüssig-flüssig Verteilung
in einer Craig Apparatur, Absorption an Harzen, Kristallisation aus Lösungsmitteln und andere, bei
Fermentierungen häufig verwendete Verfahren, zur Isolierung und Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet
werden. Da die Hauptmenge der antibiotischen Aktivität in der Nährbrühe vorhanden ist, besteht ein
bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung der erfindungsgemäßen
Verbindungen darin, daß man das Fermentationsmedium filtriert und den Wirkstoff an einem macroreticularen
Harz, wie Amberlite^ XAD-2 oder Diaion^
HP-20, bei einem pH-Wert zwischen 2 und 10 absorbiert, den Wirkstoff anschließend mit einem organischen Lösungsmittel
eluiertund das Lösungsmittel im Vakuum verdampft. Für dieses Verfahren ist Methanol ein besonders bevor-
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/.ugtes Eluierüngsmittel. Alternativ kann der Komplex
PR-1350 aus der Nährbrühe mit einem geeigneten organischen
Lösungsmittel bei einem pH-Wert zwischen 2 und 10 extrahiert werden. Den Extrakt behandelt man dann mit
einem Trocknungsmittel und engt ihn ein, wobei man das Rohprodukt erhält. Lösungsmittel mittlerer Polarität,
wie Äthyläther, Äthylacetat, Benzol oder Chloroform, sind für die Extraktion bevorzugt.
PR-1350 Der erfindungsgemäße Komplex .kann weiter durch Chromatographie,
beispielsweise an Diaioir=^ HP-20 unter Verwendung
von beispielsweise Methanol-Wasser-Mischungen als Eluierüngsmittel, oder an Sephadex ^ LH-20 unter
Verwendung von beispielsweise Methanol oder Chloroform-Methanol-Hexan-Mischungen
als Eluierüngsmittel, gereinigt werden.
antibiotische
Der/Komplex PR-1350 ist ein farbloser, amorpher Feststoff,
dessen Elementaranalyse das Fehlen von Stickstoff, Phosphor, Schwefel, Chlor und Brom im Molekül
ergibt.
Der stärkste Peak im Feld-Ionisations-Massenspektrum
liegt bei m/e 3 66. Die hoch auflösende Stoßionisationsmassenspektrometrie
ergibt für diesen Peak die Formel C0^H0nO,. Weitere starke Peaks des Massenspektrums sind
ZU J U D
in der nachfolgenden Tabelle A aufgezählt. 30
M/22 261 -13-
Tabelle A
Charakteristische Peaks des Stoßionisations-Massen-Spektrums
des Komplexes PR-1350
m/e Formel
366 C20H30°6
205 15
161 159, 149 147
145 135 133 131
121 119 109 107
105 95 93 91 81
204 C14H20°
189 C14H21 und
187 175
3U7726
M/22 261 14~
m/e
79 77 69 67 55
44 41
PR-1350
Der erfindungsgemäße Komplex/ist in üblichen organischen
Lösungsmitteln, wie Äthylacetat, Äthyläther, Benzol, Äthanol, Methanol, Chloroform und dergleichen
löslich, er ist relativ unlöslich in Wasser und unlöslich in gesättigten Kohlenwasserstoffen.
Eine Lösung des Komplexes PR-1350 in Äthanol weist ein UV- Maximum, λ. max, bei 230 nm (E1 = 304)auf.
ι cm
Figur 1 zeigt das IR-Spektrum des erfindungsgemäßen
Komplexes (KBR-Preßling), in Tabelle B und C sind
1 die charakteristischen Signale des H und C-NMR-Spektrums
zusammengestellt. Die NMR-Spektren wurden an einem JEOL FX 100 Spektrometer bei 99,6 MHz
aufgenommen, die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden
in einer 10 %-igen Lösung in Deuterochloroform oder Deuteroaceton vermessen. Die chemische Verschiebung
ist in ppm (δ-Skala) unter Verwendung von Tetramethylsilan
als Standard angegeben.
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Charakteristische Signale des H-NMR-Spektrums des
Komplexes PR-1350 (in Deuteroaceton) 10
| Chemische | Multiplizität | relative |
| Verschiebung | Intensität | |
| 9.28 | S | 1 |
| 6.63+) | breit, t | 1 |
| 2.41 | m | 2 |
| 1.77 | m | |
| 1.21 | S | |
| 0.96 | S |
+ ) Dieses Signal erscheint bei 6.54,-wenn das Spektrum
von einer Lösung des Komplexes in Deuterochloroform
25 aufgenommen wird.
M/22 261 ~16
1 Charakteristische Signale des - C-NMR-Spektrums des
Komplexes PR-1350 (in Deuterochloroform)
193.8 d
151.9 s
151.5 d
44.1 37.6 36.3 29.3 28.6 25;9 21.6 17.8
15.8
Die optische Drehung des erfindungsgemäßen KomplexesPR-1350
"25 kann sich nach Herstellung der Lösung noch einige Stunden ändern, wobei der Anfangswert von der Isolierungsmethode
des Komplexes abhängt. Der Endwert wird von solchen Faktoren nicht beeinflußt. Charakteristische Werte für
zwei verschiedene Chargen des erfindungsgemäßen Komplexes
sind in Tabelle D zusammengestellt.
M/22 261
-17-
Spezifische Drehung des Komplexes PR-1350 (c. 1, Äthanol)
Zeit nach Herstellung der Lösung (Stunden)
[α]
Charge A
0 1 2 3
+ 82.1 ■1-85.6 + 86.5
+ 86.6 + 86.6
Charge B
0 1 2 3 4
+ 72.0 +80.0 +85.0 +85.5 + 85.6
PR-13'50 Die Komponenten des erfindungsgemäßen Komplexes /Können
durch Chromatographie an Cephadex LH-20 unter Verwendung von Chloroform-Methanol-Hexan (65:10:25) als
Eluierungsmittel getrennt werden. Durch wiederholte Chromatographie ( Einzelheiten sind in Beispiel 9 beschrieben)
kann gezeigt werden, daß die getrennten Komponenten beim Stehen in Lösung sich rasch wieder in den Komplex
umwandeln.
LQst man den erfindungsgemäßen Komplex in Methanol und
stellt die Lösung wenige Tage in den Kühlschrank, fällt ein kristallines Hemiacetal aus. Diese Verbindung ist
ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung und wird als Komplex PR-1381 bezeichnet. Er weist einen
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Schmelzpunkt von 139 bis 141 G und ein UV-Maximum bei
230 nm (e!% =310; Äthanol) auf.
1 cm
Figur 2 zeigt das IR-Spektrum (KBr-Pressling) dieses
Komplexes.
Feldionisations- und Elektronenstoß-Massenspektren des
Komplexes PR-1381 sind identisch mit denen des Komplexes
PR-1350.
ι Die charakteristischen Signale des H-NMR-Spektrums,
das unmittelbar nach Auflösen von PR-1381 in Deuterochloroform aufgenommen wurde, sind in Tabelle E zusammengestellt.
. -
Läßt man die Deuterochloroformlösung bei Raumtemperatur
stehen, verschwinden die ursprünglich erhaltenen Signale allmählich. Gleichzeitig wird Methanol aus dem
Molekül freigesetzt. Nach 10 Stunden schließlich beobachtet man ein NMR-Spektrum, das bis auf ein zusätzliches
Signal bei 5 = 3.48, das wahrscheinlich auf das während der Umwandlung von PR-1381 in PR-1350 freigesetzte
Methanol zurückzuführen ist, identisch mit dem NMR-Spektrum des Komplexes PR-1350 ist.
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Charakteristische Signale des H-NMR-Spektrums von
PR-1381, unmittelbar nach Herstellung einer Lösung in Deuterochloroform aufgenommen
| Chemische Ver | Multiplizität | relative In |
| schiebung | tensität | |
| 9, 28 | S | 1 |
| 6,54 | t | 1 |
| 5,31 | breit, s | .1 |
| 4,58 | t | 1 |
| . 3,40 | S | 3 |
| 3,25 | d (J=4.5) | 1 |
| 2,82 | d (J=4.5) | 1 |
| 2,35 | m | 2 |
| 1,77 | m | |
| 1,21 | S | 3 |
| 1,00 | d (J=6) | 3 |
| 0,90 | S | 3 |
Der Komplex PR-1381 scheint sich somit in Lösung unter
Freisetzung von Methanol in den Komplex PR-1350 umzuwandeln. Dieser Befund wird zudem durch die Tatsache,
daß die antimikrobielle Wirkung von PR-1381 qualitativ und quantitativ mit der des Komplexes PR-1350 identisch
ist, und durch die" in Tabelle F angegebene spezifische Drehung von PR-1381 in Abhängigkeit von der Zeit,
bekräftigt.
M/22 261 -20-
Zeit nach Herstellung [α],
1D der Lösung (Stunden)
0 +102.8 1/2 +97.2
1 +94.0
2 +91.6 10 +89.6
Aus dieser Tabelle wird offenbar, daß der Anfangswert
verschieden ist von dem in Tabelle D angegebenen Anfangswert des Komplexes PR-1350, wohingegen die Endwerte
der beiden Komplexe recht gut übereinstimmen.
Die dem Komplex PR-13.81 entsprechenden Hemiacetale
kann man durch Umsetzung des Komplexes PR-1350 mit einem anderen Alkohol als Methanol, mit oder ohne Lösungsmittel,
erhalten. Solche Alkohole entsprechen der allgemeinen Formel ROH, worin:
R für eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe ^O mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, wie eine Methyl-,
Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, oder tert.-Buty!gruppe, oder ein bekanntes Isomereseiner
Pentyl-, Hexyl-, Heptyl- oder Octyl-Gruppe,steht, wobei die
Alkylgruppen gegebenenfalls durch Halogenatome oder Hydroxy-, Alkyloxy-, Aralkyloxy-, Aryloxy-,
Alkanoyloxy-, Aralkanoyloxy-, Aroylbxy-, Sulfhydrylalkylthio-,
Aralkylthio-, Arylthio-, Alkanoylthio-, Aroylthio-, Azido-, Nitro-,■ Cyano-, Thiocyano-,
ϊ1 47726
Μ/22 261 -21-
Hydroxycarbonyl-, Alkyloxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl-,
Amino-, Alkylamino-, Dialkylamino-, Arylamine»-,
Alkanoylamino- und Aroylamino-Gruppen substituiert sein können, oder
worin
worin
R eine Alkenyl- oder Alkinyl-Gruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen,
wie eine Allyl-, Crotyl-, oder Propargyl-Gruppe,
eine Cycloalkylgruppe mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen im alicyclischen Ring, wie eine Cyclopropyl-,
Cyclobutyl-, Cyclopentyl-, Cyclohexyl- oder Cycloheptyl-Gruppe oder deren Mono- oder Dihalogen-,
Niedrigalkyl-, Niedrigalkoxy- oder Hydroxy-substituierten Analoge,
oder .
oder .
eine Aralkyl-, Heterocyclylalkyl- oder Aryl-Gruppe, wie eine Benzyl-, Phenyläthyl-, Phenyl-oder
Furfurylgruppe, bedeutet,
wobei diese Gruppen gegebenenfalls durch Halogenatome, oder Nitro-, Niedrigalkyl-, Hydroxy- oder Alkoxygruppen
substituiert sein können.
25
25
Wie der Komplex PR-1381 sind die nach diesem Verfahren
erhaltenen Verbindungen antibiotisch aktiv.
Die in vitro antimikrobielle Aktivität des PR-1350
Komplexes gegen eine Reihe von Testorganismen wurde mit Hilfe der Standard-Reihenverdünnungs- und
-Agarverdünnungsmethode bestimmt. Die minimalen Hemmkonzentrationen
(MIC) sind in Tabelle G zusammengestellt.
35
35
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6 . a .
-22-
In Vitro Antibakterielle Aktivität des Komplexes
PR-1350
Stapliylococcus aureus Stapliylococcus aureus Stapliylococcus aureus
(Pen.Strep.-resist. )
Staphylococcus aureus (Pen.Strep.Tetrac.Eryt,
Methic.-Resist.)
Diplococcus pneumonia CJ
CJ85
CJ85
CJ9
GJIlO
EA
0.1 0.1
0.1
0.1 0.3
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-23-
| Organismus | Stamm | MIC με/mi |
| Streptococcus pyogenes NCTC8198 | EC | 0.1 |
| Streptococcus faecalis ATCC8O43 | EI3 | 0.3 |
| Corynebacterxum xerosis NCTC9755 | FF | 0.03 |
| Listeria monocytogenes NCTC7973 | FT | 0.1 |
| Erysipelothrxx insidiosa NCTC8163 | FU | 0.1 |
| Bacillus subtilis | KA2 | 0.1 |
| Pseudomonas aeruginosa | BA2 | 10 |
| Pseudomonas aeruginosa (Psl8s) | BAl4 | 30 |
| Pseudomonas aeruginosa (mcPhillip) | BAl 5 | 10 |
| Pseudomonas stutzeri | BC | 3 |
| Vibrio comma NCTC8367 | BQ | 0.03 |
| Alcaligenes faecalis | GA | 1 |
| Escherichia coli | HA | 3 |
| Escherichia coli | HA2 | 10 |
| Escherichia coli | HAIl | 10 |
| Escherichia coli B AS19 | H A4 7 | 0.3 |
| Escherichia coli V 3HO R~ | HA58 | 3 |
| Klebsiella pneumoniae | HE | 3 |
| Klebsiella pneumoniae ATCCIOO31 | HE4 | 0.3 |
| Klebsiella pneumoniae ATCC10273 | HE7 | 10 |
3U-7726
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| Organismus | Stamm *' | MIC |
| K'lebsd ella aerogenes 1082E | KC 7 | 10 |
| Enterobacter cloacae P99 | HC8 | 10 |
| Serratia marcescens ATCC14756" | HG4 | 10 |
| Proteus vulgaris ATCCI3315 | ' HJ | 3 |
| Proteus mirabilis | HJ3 | 10 |
| Salmonella paratyphi A NCTC8002 | HK | 30 |
| Salmonella schotrnuelleri NCTC57O4 | HL | 30 |
| Salmonella typhimurium NCTC571O | HL2 | 10 |
| Salmonella abortus-equi NCTC5727 | HL3 | 3 |
| Salmonella hirschfeldii NCTC5733 | HM | 1 |
| Salmonella cholerae-suis NCTC5735 | HM2 | 10 |
| Salmonella typhosa NCTC5760 | HN | 3 |
| Salmonella enteritidis NCTC3O45 | HN2 | 10 |
| Shigella dysenteriae NCTC8217I | HR | 10 |
| Shigella flexneri NCTC 8192 | HT | 3 |
| Yersenia enterocolitica | HY | 3 |
| Bacteroides fragilis | JA2 | 1 |
| Chromobacterium violaceum NCTC9371 | LQ | 0.3 |
| Neisseria gonorrhoeae (SuIfathiaz.Resi st.) |
DA2 | 1 |
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-25-
| Organismus | *) Stamm |
MIC μεΑηΐ |
| Neisseria gonorrhoeae | DA 3 | 0.3 |
| Neisseria gonorrhoeae (Pen.resist.) |
DA9 | 0.3 |
| Neisseria gonorrhoeae (Pen.resist.) |
da4o | 0.3 |
| Neisseria meningitidis NCTC8365 | . DB | 0.1 |
| Haemophilus influenzae NCTC 6489 | 1X3 | 3 |
| Haemophilus influenzae | 1X5 | 0.1 |
| Haemophilus influenzae ATCC9OO7 | 1X12 | 3 |
| Haemophilus influenzae (Ampicillin Resist.) |
1X23 | 1 |
| Haemophilus influenzae (Ampicillin Resist.) |
1X29 | 3 |
| Haemophilus ρarahaemoIyticus | 1X7 | 1 |
| Bordetella pertussis | IY3 | 3 |
| Propionibacterium acnes NCTC737 | FN | 3 |
| Mycobacterium paratuberculosis NCTC 6926 |
MD | 3-2 |
| Mycobacterium phlei | MO | 1.0 |
| Candida albicans ATCCIO231 | ZA | >100 |
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| Organismus | Stamm ' | MIC Hfr/ml |
| 5 Caxidida albicans |
ZA2 | >100 |
| Candida parakrusei | ZA3 | >100 |
| Candida guilliermondii CBS566 | ZA6 | >100 |
| 10 Candida pseudotropicalis CBS607 | ZAIl | >100 |
| Candida tropicalis CBS 9h- | ZAl 3 | >100 |
| Saccharomyces ellipsoideus | ZZ | >100 |
| Aspergillus fumigatizs CBS | ZM | >100 . |
| 15 Trichophyton raentagrophytes CBS |
ZO | >ioo |
| Trichophyton mentagrophytes var. interdigitale CBS |
Z02 | >100 |
| Trichophyton rubrura ATCC1O272 | ■ ZO7 | >100 |
| 20 Γχ-ichophyton schönleini | ZOlO | >100 |
| Tetraliymena pyriformis CU-l63O/l-¥ | 10 |
*) Die Angaben beziehen sich auf die Leo-Pharmaceutical
Products Culture Collection.
Der Komplex PR-1350 weist keine Kreuzresisteni:
gegenüber irgendwelchen in der Medizin verwendeten Antibiotika, wie Pencilline, Cephalosporine, Aminoglycoside,
Tetracycline, Fusidinsäure, Chloramphenicol, Erythromycin, Novobiocin oder Lincomycine, auf.
PR-1350 besitzt starke bakterizide Wirkung gegen alle
in Tabelle G erwähnten Bakterien.
3H7726
M/22 261 -27-
Darüber hinaus besitzt PR-1350 auch Antitumorwirkung.
Wenn man Mäusen, die am Tage Null intraperitoneal mit 10 P-388 Leukämie-Zellen infiziert wurden, den Komplex
PR-1350 intraperitoneal an 9 aufeinanderfolgenden Tagen (1 bis 9) in vier verschiedenen Dosierungen verabreicht,
beobachtet man bei allen Gaben eine deutliche Hemmung des Tumors. Die Ergebnisse sind in Tabelle H zusammengestellt.
Aktivität des Komplexes PR-1350 gegen P-388 lymphozytische Leukämia bei Mäusen
Dosis (mg/kg) T/C x)
250 200
125 164
62.5 160
31.25 163
x)
T/C ist das Verhältnis der durchschnittlichen Überlebenszeit
der behandelten Mäuse (6 Mäuse pro Dosierung) zu der der unbehandelten Kontrolltiere
ist
in %. Aktivität/definiert als Wert für T/C ^ 125.
in %. Aktivität/definiert als Wert für T/C ^ 125.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen bei Mäusen und Ratten nur geringe Toxizität auf.
— 9R —
M/22 261
Es ist bekannt, daß ein Produkt, das aus einer Kultur des Stammes Oidiodendron truncatum Barron isoliert
wurde, antibakterielle und fungizide Wirkung besitzt. (Marchisio, Abstracts of Mycology, [Vol. 12(5)] 4,
50697, aus Allionia 21,67,1976). In dieser Veröffent-lichung ist beschrieben, daß die Wirkung dieses Produkts
gegen Staphylococcus aureus und gegen Escherichia coli gleich groß ist und daß die Wirkung gegen den Hefepilz
Candida albicans besonders groß ist. Der Autor zieht daraus die Schlußfolgerung, daß der Wirkstoff dem Antibiotikum
Fuscin entspricht, das, wie von S.E. Michael (Biochem. J. 43,528,1948) beschrieben, von Oidiodendron
fuscum Robak produziert wird.
Aus den mit dem Komplex PR-1350 durchgeführten anLibiotisehen
Untersuchungen geht jedoch hervor, daß dieser Komplex eine hohe Wirkung, gegen Staphylococcus aureus,
eine 10 bis 100 mal geringere Wirkung gegen Escherichia coli und keine Wirkung gegen Candida albicans aufweist.
Es ist somit offenbar, daß sich der Komplex PR-1350 von dem von Marchisio beschriebenen antibiotischen Wirkstoff
unterscheidet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Schaffung von pharmazeutischen Mitteln zur Behandlung
von Infektionskrankheiten. Diese Mittel können auch als Antitumormittel in der Human— und Tiermedizin verwendet
werden.
Die erfindungsgemäßen Mittel enthalten als Wirkstoff
den Komplex PR-1350 oder ein Hemiacetal davon, z.B. PR-1381, in Kombination mit festen oder flüssigen \
pharmazeutischen Trägern und/oder Verdünnungsmitteln.
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M/22 261 ~29~
In den erfindungsgemäßen Mitteln kann das Verhältnis
von Wirkstoff zu Trägersubstanz zwischen 1 und 95 Gew.-% variieren. Die erfindungsgemäßen Mittel können
in Form verschiedener, pharmazeutischer Darreichungsformen
vorliegen, wie Granulaten, Tabletten, Pillen, Dragees, Suppositorien, Kapseln, Tabletten mit verzögerter
Wirkstoffabgabe, Suspensionen oder Injektionspräparaten. Die erfindungsgemäßen Mittel können auch
in Flaschen, Röhrchen oder ähnliche Behälter abgefüllt werden, wenn Mischungen verarbeitet werden sollen.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mittel können orgaorganische oder anorganische, feste oder flüssige und/oder für topisehe
Zwecke geeignete Träger verwendet werden. Als Träger können Wasser, Gelatine, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Talkum,
pflarrzXiehe und tierische öle und Fette, Benzylalkohol,
Gummistoffe, Polyalkylenglycol, Vaseline, Kakaobutter, Lanolin oder andere zur Herstellung von Arzneimitteln
bekannte Träger verwendet werden. Als Hilfsstoffe können
Stabilisierungsmittel, Netz- und Emulgiermittel, Salze zur Beeinflussung des osmotischen Druckes oder
Puffer zur Aufrechterhaltung eines geeigneten pH-Werts zum Einsatz kommen. Die erfindungsgemäßen Mittel können
darüber hinaus auch andere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten, die in geeigneter Weise zusammen mit dem
Komplex PR-1350 oder einem Hemiacetal davon zur Behandlung
von Infektionskrankheiten oder als Antitumormittel verabreicht werden können. Solche Wirkstoffe können andere
geeignete Antibiotika oder Antitumormittel sein, insbesondere solche Mittel, die die Wirkung steigern und
/oder die Ausbildung von Resistenz verhindern. Andere
Verbindungen, die vorteilhafterweise, insbesondere bei topischen Präparaten, mit den erfindungsgemäßen
Verbindungen kombiniert werden können, sind z.B.
Corticosteroide, wie Hydrocortison, Triamcinolon oder Fluocinolon.
M/22 261 -30-
In Form von Granulaten, Tabletten, Kapseln oder Dragees
creeioneterweise enthalten die erfindungsgemäßen Mittel/25 bis 95 % der
erfindungsgemäßen Verbindungen, wohingegen oral zu verabreichende
Suspensionen geeigneterweise 2 bis 25 % der erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten.
Zur parenteralen Anwendung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt in Form von Injektionspräparaten
verabreicht, die 1 bis 20 % Wirkstoff enthalten.
Wie bereits angedeutet, können die erfindungsgemäßen
Verbindungen zu pharmazeutischen Darreichungsformen verarbeitet werden, die Suspensionen, Pulver, Salben
und Cremes umfassen. Ein pharmazeutisches Präparat zur oralen Applikation kann auch in Form einer Suspension,
die die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer Menge
von 20 bis 100 mg pro ml Trägerflüssigkeit enthält,
vorliegen. Zur topischen Applikation können die erfindungsgemäßen
Verbindungen als Pulver, Salben, Cremes oder Lotionen formuliert werden, wobei die erfindungsgemäßen
Verbindungen in Mengen von 0,5 bis 10g pro 100 g
des Präparates enthalten sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist
darin zu sehen, die Dosierung der erfindungsgemäßen Verbindungen so auszuwählen, daß man die gewünschte
Wirkung ohne gleichzeitige Nebenwirkungen erhält. In der Human therapie werden die erfindungsgemäßen Verbindungen
bequemerweise in Dosiseinheiten verabreicht, die (bei Erwachsenen) nicht weniger als 50 mg und bis
zu 1000 mg, vorzugsweise 250 bis 750 mg, enthalten.
Der Ausdruck "Dosiseinheit" bezieht sich auf eine einheitliche, d.h. einzelne Dosis, die entweder die
erfindungsgemäßen Verbindungen als solche oder in Mischung mit festen oder flüssigen pharmazeutischen
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M/22 261 -31-
Verdünnungsmitteln oder Trägern enthält, und die einem
Patienten verabreicht werden kann, sich leicht handhaben und verpacken läßt und dabei als Dosiseinheit unversehrt
bleibt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Form
einer Dosiseinheit einmal oder mehrere Male pro Tag in geeigneten Zeitabständen verabreicht werden. Die
Verabreichung soll jedoch immer in Abhängigkeit vom Zustand des Patienten und in Übereinstimmung mit der
Verordnung des Arztes erfolgen.
Die tägliche Dosis zur systemischen Behandlung liegt bei einer Menge von 0,25 bis 4g, vorzugsweise
0,5 bis 3 g der erfindungsgemäßen Verbindungen pro Tag.
Der Ausdruck "Dosiseinheit" in Verbindung mit topischer Applikation bedeutet eine einheitliche, d.h. einzelne
Dosis, die einem Patienten topisch verabreicht werden
kann, wobei pro cm infizierter Fläche 0,1 bis 10 mg,
vorzugsweise 0,2 bis 1 mg>der erfindungsgemäßen
Verbindungen appliziert werden.
Zur Injektion können Ampullen, Vials, oder ähnliche
Behälter bereitgestellt werden, die als Dosiseinheit eine parenteral verträgliche, wäßrige oder
ölige injizierbare Lösung oder Dispersion des Wirkstoffes enthalten.
Parenterale Formulierungen sind besonders nützlich bei der Behandlung von Zuständen, die eine rasche Reaktion
auf die Behandlung erfordern. Zur kontinuierlichen Therapie bei an Infektionskranheiten leidenden Patienten
"° sind Tabletten oder Kapseln die geeignete Formulierung,
da ein oral, insbesondere in Form von Tabletten mit verzögerter Wirkstoffabgabe, verabreichtes Arzneimittel
eine lang anhaltende Wirkung entfaltet.
M/22 261
5 Zur Behandlung von Infektionskrankheiten oder zur Tumorbehandlung können solche Tabletten, wie schon erwähnt,
vorteilhafterweise weitere Wirkstoffe enthalten.
M/22 261 -33-
Beispiel 1
5
5
Um vegetatives Wachstum zu erzielen, werden Sporen von
Oidiodendron truncatuin Barron, Stamm HL-972 ZP-88 aus einem 10 Tage alten Schrägagar in einen 500 ml Erlenmeyerkolben
überführt, der eine sterile Nährbrühe (100 ml) folgender Zusammensetzung enthält:
Maisquellwasser 20 g/Liter
KH3PO4-2H2O 10 g/Liter
MgSO4-7H2O 0,5 g/Liter
Saccharose 50 g/Liter
Leitungswasser (pH 6,7) ad 1 000 ml
Diese Kultur wird aerob 3 Tage bei 28 0C auf einer
Schüttelvorrichtung bebrütet. Das so erhaltene Impfmaterial wird in 2-Liter-Schüttelkolben überführt,
die 250 ml eines Nährmediums folgender Zusammensetzung;
Malzextrakt 20 g/Liter
Saccharose 20 g/Liter
Sojabohnenmehl 7,5 g/Liter
Fleisch- und Knochenmehl 7,5 g/Liter
K2HPO4 1 g/Liter
Leitungswasser (pH 6.2) ad 1 000 ml
enthielten, wobei die Konzentration an Impfmaterial 8 % betrug.
Die Fermentierung erfolgt auf einer Schüttelvorrichtung
(112 Schwingungen/min) bei 281^C und bei einem pH des Nährmediums
von ungefähr 6,0. Man bestimmt die antibiotische Aktivität während der Fermentierung nach einer Disk-Platten-Kulturen-Methode
mit einer Reihe von Testorganismen. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammen-
M/22 261
-34-
gefaßt.
| Test-Organismus | mm Inhib: 2 Tage |
Lerungszone- 6 Tage |
| Streptococcus pyogenes | 28 | 33 |
| Staphylococcus aureus | 32 | 36 |
| Corynebacterium xerosis | 33 | 37 |
| Eschericliia coli | •trace | (16) |
| Klebsiella pneumoniae | 17 | 20 |
| Pseudomonas aeruginosa | 17 | 1 20 |
| Neisseria gonorrhoeae | 35 | 39 |
| Candida albicans | 0 | 0 |
| Tricophyton raentagrophytes | o | 0 |
| Aspergillus clavatus | 0 | 0 |
30 " Beispiel·-?
Um vegetatives Wachstum zu erzielen, überführt man
Sporen von Oidiodendron tuncatum Barron, Stamm HL-972
ZP-88 von einem 10 Tage alten Schrägagar in 2-Liter-35 Schüttelkolben (1. Generation), die ein steriles Nährmedium
(250 ml) folgender Zusammensetzung enthalten:
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M/22 261 -35-
Maisguellwasser 20 g/Liter
Saccharose 50 g/Liter
KH2PO4-2H2O 10 g/Liter
MgSO4-7H2O 0,5 g/Liter
Leitungswasser (pH 6,7) ad 1 000 ml
Diese Kultur wird aerob bei 20 0C 3 Tage auf einer Hin- u. Her-Schüttelvorrichtung
bebrütet. Das auf diese Weise
erhaltene Impfmaterial wird in eine Reihe von Gefäßen (2. Generation) überführt, die die gleiche, für die
Generation angegebene Nährbrühe enthält. Die Fermentierung dieser vegetativen Stufe erfolgt aerob unter 2-tägigem
Rühren bei einer Temperatur von 20 C.
In einem 1,5 m Edelstahlkessel wird ein Kulturmedium
(1,0 m ) folgender Zusammensetzung bereitet:
Malzextrakt 20 g/Liter
Saccharose 20 g/Liter
Sojabohnenmehl 7,5 g/Liter
Fleisch- und Knochenmehl 7,5 g/Liter
K2HPO4 1 g/Liter
Leitungswasser ad 1 000 ml
Der pH-Wert dieses Mediums w±rd~. vor der Sterilisierung
auf 6,0 eingestellt. Die Sterilisierung erfolgt
45 Minuten bei einer Temperatur von 120 0C. Nach dem
Abkühlen auf 20 0C wird mit der zweiten Generation
in einer Konzentration von 3 % angeimpft. Während
der Fermentierung wurde unter Rühren (110 UpM)
sterile Luft in einer Menge von 0,8 m /Minute durch das Medium geleitet. Man fermentiert weitere 70 Stunden, wobei man zur Kontrolle der Schaumbildung Silikone
der Fermentierung wurde unter Rühren (110 UpM)
sterile Luft in einer Menge von 0,8 m /Minute durch das Medium geleitet. Man fermentiert weitere 70 Stunden, wobei man zur Kontrolle der Schaumbildung Silikone
als Antischaummittel zugibt. Der pH-Wert wird während
M/22 261 -36-
der Fermentation durch Zugabe von Phosphorsäure bei 6,0 gehalten. Die antibiotische Aktivität der
Kulturenproben wird durch Messung der Hemmzone, die
man mit Staphylococcus aureus als Testorganismus nach der Agar-Cup Methode erhält, bestimmt.
Die nach Beispiel 2 hergestellte Fermentationsbrühe wird unter Verwendung von Kieselgur als Filterhilfsmittel
filtriert. Das Filtrat (900 Liter) wird mit einer Geschwindigkeit von 2 Litern/Minute, über eine
Säule von 4,4 Liter Diaion ^ HP-20 gegeben (Höhe 56 cm,
Durchmesser 10 cm; das Harz wird vor der Verwendung
mit Wasser, 2 N wäßrigem Natriumhydroxyd, Wasser, Methanol, 2 N wäßriger Salzsäure, Wasser, Methanol
und Wasser behandelt). Die Säule wird mit Wasser (20 Liter), 25 %-igem wäßrigem Methanol (12 Liter),
50 %-igem wäßrigem Methanol (12 Liter) und 75 %-igem wäßrigem Methanol (12 Liter) gewaschen und anschließend
mit Methanol eluiert. Es wurden Fraktionen von 2 Litern abgenommen. Die Fraktionen 2 bis 7, die die Hauptmenge
an antibakterieller Aktivität enthalten, werden vereinigt
und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen. Der Rückstand wird mit 400 ml Methanol extrahiert, das
Methanol wird nach Filtration verdampft. Der Rückstand wird in 50 ml Methanol aufgenommen. Zu dieser Lösung
gibt man unter Rühren Äther (800 ml). Der ausgefallene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum
eingeengt, wobei man ein öl erhält, das in Methanol (20 ml) gelöst und der Säulenchromatographie an 600 ml
Diaion ® HP-20 unterworfen wird (Höhe 90 cm, Durchmesser
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M/22 261 ~37~
2,9 cm) . Die mit Methanol-Wasser (95:5) eluierten,
aktiven Fraktionen wurden vereint und im Vakuum eingeengt, wobei man 10,1 g eines Öls erhielt.
5
Man löst 5,7 g dieses Rohprodukts in Methanol (10 ml), gibt diese Lösung auf eine Sephadex^-^LH-20-Säule
(Höhe 9 0 cm, Durchmesser 29 cm) und eluiert die Säule mit Methanol. Die aktiven Fraktionen (150 ml) werden
gesammelt und im Vakuum zur Trockene eingeengt. Man erhält 4,2 g eines Öls, das in einer Mischung von
Äther (100 ml) und Cyclohexan (200 ml) gelöst wird. Diese Lösung wird mit 3 g Norit ^ behandelt, filtriert
und im Vakuum auf ein Volumen von 50 ml eingeengt.
Unter Rühren gibt man 200 ml Cyclohexan zu und filtriert den ausgefallenen Niederschlag ab. Nach Waschen des
Niederschlags mit Cyclohexan und Trocknen erhält man den antiobiotischen Komplex 1350 in Form eines farblosen,
amorphen Pulvers.
Einengen der Mutterlauge auf 50 ml und Abfiltrieren des ausgeschiedenen Niederschlages ergibt eine weitere
Fraktion des Komplexes.
Herstellung von Tabletten, die 250 mg des Komplexes
PR-I 350 enthalten
Inhaltsstoffe:
PR-1350 250 g
Lactose 165 g
Polyvinylpyrrolidon 7 g
Maisstärke 50 g
Talkum 25 g
Magnesiumstearat 3 g
M/22 261 -38-
Der Komplex PR-1350 und Lactose werden durch ein Sieb von 850 μΐη (20 mesh) gegeben und 15 Minuten lang
c vermischt. Diese Pulvermischung wird anschließend mit
einer Lösung des Polyvinylpyrrolidons in Wasser befeuchtet.
Die feuchte Masse gibt man durch ein 2,0 mm (10 mesh) Sieb und trocknet sie bei 3·3 0C.
Nach dem Trocknen werden die Granalien durch ein
jQ 1,18 mm Sieb aufgebrochen und mit Maisstärke, Talkum
und Magnesiumstearat gemischt. Das Granulat wird unter Verwendung von 1,27 cm (16/32") Formen und entsprechenden
Stempeln zu Tabletten von 0,50 g geformt. Man erhält auf diese Weise 1000 Tabletten, von denen
jede 250mg PR-1350 enthält.
Herstellung von Kapseln, die 250 mg des Komplexes PR-1381 enthalten
Inhaltsstoffe: .
PR-1381 250 g
Stärke 27 g
Magnesiumstearat 3 g
Die Inhaltsstoffe werden durch ein 250 μπι Sieb (60 mesh)
gegeben und 15 Minuten lang vermischt. Diese Mischung wird unter Verwendung einer halbautomatischen Kapselfüllmaschine,
die durch einen Vibrator angetrieben wird, in Gelatinekapseln abgefüllt* Jede Kapsel enthält
280 mg der Mischung, ansprechend 250 mg des Komplexes PR-1381.
'3H7726
M/22 261 -39-
Herstellung einer Salbe, die 1O mg des Komplexes
P?J~J 350 pro g enthält
Inhaltsstoffe:
PR-1350 10 g
Cholesterin 30 g
Stearylalkohol 30 g
Butylhydroxyanisol 0,1 g
Weißwachs 80 g
White petrolatum 850 g
Stearylalkohol, Weißwachs und white petrolatum werden auf einem Dampfbad verschmolzen. Das Cholesterin
und das Butylhydroxyanisol werden anschließend zugegeben
und in der geschmolzenen Mischung gelöst, die anschließend kaltgerührt wird. Der Komplex PR-1350
wird durch ein 180 \im Sieb (80 mesh) gegeben, und allmählich
mit der Salbenbase verrieben.
Isolierung des Komplexes PR-1350 30
Die Fermentationsbrühe, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wird unter Verwendung von Kieselgur
als Filterhilfsmittel filtriert. Das Filtrat (4 Liter) wird mit 2 Portionen Äthyläther (2x1 Liter) extrahiert.
Die vereinigten organischen Phasen werden mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das nach dem Abziehen des
Lösungsmittels im Vakuum erhaltene Rohprodukt wird
—4 Ο —
Μ/22 261
Μ/22 261
weiter gereinigt, indem man es wie in Beispiel 3 beschrieben,
an Diaion ^ HP-20 unter Verwendung von Methanol-Wasser als Eluierungsmittel und anschließend
an Sephadex ^ LH-20 unter Verwendung von Methanol als
Eluierungsmittel chromatogräphäiert' und anschließend
aus Äther-Cyclohexan fällt.
'torste11ung des Komplexes PR-I38T
Eine Lösung des Komplexes PR-1350 (100 mg), hergestellt
wie in Beispiel 3 beschrieben, in Methanol (0,3 ml) läßt man bei 5 C stehen. Im Verlauf von 72 Stunden
scheiden sich langsam Kristalle aus der Lösung ab. Man gibt Diisopropyläther (5 ml) zu und filtriert
die Kristalle ab. Waschen mit Diisopropyläther und Trocknen der Kristalle ergibt den Komplex PR-1381
vom Schmelzpunkt 139-141 0C.
A. 300 mg des Komplexes PR-1350, hergestellt wie im
Beispiel 3 beschrieben, werden an einer Sephadex ^ LH-20 Säule (Höhe 90 cm, Durchmesser 2,9 cm) unter
Verwendung von Chloroform-Methanol-Hexan (65:10:25)als
Eluierungsmittel chr>omatographiert. Die ersten 280 ml des Eluats werden auf einmal aufgefangen.
Danach nimmt man Fraktionen von 15 ml ab. 10 μΐ
jeder Fraktion werden mit 1 ml Methanol verdünnt und auf die Wirkung gegen Staphylococcus aureus nach
der Agar-Cup Methode Untersucht. Die Resultate sind
M- -3U7728
Μ/22
-41-
in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt.
| Fraktion Nr. | Inhibierungszone |
| 1 | 2k |
| 2 | 23 |
| 3 | 29 |
| 35 | |
| 5 - | 33 |
| 6 | 33 |
| 7 | 28 |
| 8 | 32 |
| 9 . | 31 |
| 10 | 30 |
| 11 | 32.5 |
| 12 | 32 |
| 13 | 32 |
| Ik | 31.5 |
| 15 | 31 |
| 16 | 26 |
| 17 | 21 |
| 18 | 0 |
| 19 | 0 |
M/22
-4 2-
B. Die Fraktionen 4 bis 6, erhalten wie in Teil A dieses Beispiels beschrieben, werden vereinigt
und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen. Man erhält 100 mg eines öligen Rückstandes, der
auf eine Säule analog der in Teil A verwendeten Sephadex ® LH-20 Säule aufgetragen wird . Die Säule
wird mit Chloroform-Methanol-Hexan. (65:10:25) eluiert. Nach Abnahme der ersten 300 ml des Eluats
auf einmal werden 12 ml Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen werden auf antistaphylokokkische
Wirkung nach der in Teil A dieses Beispiels beschriebenen Methode untersucht. Die Ergebnisse sind in
der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt:
| Fraktion Nr. | Inhibierungszone |
| 1 | 22 |
| 2 | • 28 |
| 3 | 31.5 |
| h | 30 |
| 5 | 29 |
| 6 | 27-5 |
| 7 | 21 |
| 8 | 2k |
M/22
,.-3U7726
-43-
| Fraktion Kr. | Inhibierungszone |
| 9 | 26 |
| 10 | 22 |
| 11 | 21 |
| 12 | 21 |
| 13 | 19 |
| 14 | 18 |
| 15 | 20 |
| i6 | Zk |
| 17 | 29 |
| 18 | 21 |
| 19 | 16 |
| 20 | 0 |
C. Fraktionen Nr. 11 bis 15, erhalten wie in Teil A
dieses Beispiels beschrieben, werden vereinigt und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen. Man erhält
175 mg eines öligen Rückstandes, der auf die gleiche, in den Beispielen A und B dieses Beispiels verwendete
Sephadex ® LH-20 Säule aufgetragen wird. Die Säule wird mit Chloroform-Methanol-Hexan (65:10:25) eluiert.
Nach Abnahme der ersten 285 ml des Eluats auf einmal werden 13 ml Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen
werden auf antistaphylokokkische Wirkung, wie in Teil A dieses Beispiels beschrieben, untersucht. Die Ergebnisse
sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt:
--3U7726
M/22
-44-
| Fraktion Nr. | I | Inhibierungszone |
| 1 | 15 | |
| 2 | 20 | |
| 3 | 29 | |
| k | 30 | |
| 5 | 26 | |
| 6 | 24 | |
| 7 | 20 | |
| 8 | 20 | |
| 9 | 20 | |
| 10 | 22 | |
| 11 | 22.5 | |
| 12 | 31.5" | |
| 13 | 29.5 | |
| Ik | 30 | |
| 15 | 30.5 | |
| > 16 | 30 | |
| 17 | 25 | |
| 18 | 18 ' | |
| 19 | 17 | |
| 20 | 0 | |
ην m, *
Μ/22 261 -45-
Die Ergebnisse dieses Beispiels zeigen, daß die Komponenten des Komplexes PR-1350 wenigstens teilweise
getrennt werden können, die abgetrennten Komponenten sich jedoch rasch wieder in den ursprünglichen Komplex
PR-1350 umwandeln.
Claims (1)
1. Komplex PR-1350 aus nahe verwandten Verbindungen,
gekennzeichnet durch folgende physikalisch-chemische Daten:
a) IR-Spektrum: 3400 (br), 2900 (s), 2670 (w), 1770(w),
1670 (s), 1620 (m), 1440 (m), 1410 (m), 1380 (m),
1225 (m), 1180 (m), 1120 (m) 1030 (br), 690 (w) cm"1;
gemäß Figur 1;
b) optische Drehung [a]^ = +85-90° (c=1, Äthanol),
vier Stunden nach Herstellung der Lösung gemessen;
c) Stoßionisations-Massenspektrum (iti/e) : 366, 205, 204,
189, 187, 175, 161, 159, 149, 147, 145, 135, 133,
131, 121, 119, 109, 107, 105, 95, 93, 91, 81, 79, *
77, 69, 67, 55, 44, 41; |
d) H-NMR-Spektrum (10 %-ige Lösung in Deuteroaceton):
9,28 (s), 6,63 (bt), 2,41 (m), 1,77 (m), 1,21 (s), 0,96 (s);
1 3
e) C-NMR-Spektrum (10 %-ige Lösung in Deuterochloroform):
193.8 (d), 151.9 (s), 151.5 (d), 44.1, 37.6, 36.3, 29.3, 28.6, 25.9, 21.6, 17.8, 15.8;
f) UV-Maximum bei 230 nm (e]% = 304) in Äthanol;
1 cm
g) Löslichkeit: Löslich in üblichen organischen Lösungsmitteln, wie Äthylacetat, Äthyläther, Benzol,
Äthanolf Methanol und Chloroform; relativ unlöslich in Wasser und unlöslich in gesättigten Kohlenwasserstoffen;
Μ/22 261 -TS-
\ 1 und seine Hemiacetale! mit Alkoholen der allgemeinen
Formel:
R-OH
worin:
worin:
R eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, wie eine Methyl-,
Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-,
ein oder tert.-Butylgruppe, oder/bekanntes Isomeres einer
Pentyl-, Hexyl-, Heptyl oder Octylgruppe, bedeutet,
wobei die Alkylgruppen gegebenenfalls durch Halogenatome oder Hydroxy-, Alkyloxy-, Aralkyloxy-, Aryloxy-,
Alkanoyloxy-, Aralkanoyloxy-, Aroyloxy-, SuIfhydrylalkylthio-, Aralkylthio-, Arylthio-,
Alkanoylthio-, Aroylthio-, Azido-, Nitro-, Cyano-, Thiocyano-, Hydroxycarbonyl-, Alkyloxycarbonyl-,
Aryloxycarbonyl-, Amino-, Alkylamino-, Dialkylamino-,
Arylamino-, Alkanoylamino- und Aroylamino-Gruppen substituiert sein können, oder
worin
* 20 R eine Alkenyl- oder Alkinyl-Gruppe mit 2 bis 6 Kohlen-
stoffatomen, wie eine Allyl-, Crotyl- oder Propargyl-
~ gruppe,
eine Cycloalkylgruppe mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen
im al!cyclischen Ring, wie eine Cyclopropyl-, Cyclobutyl-,
Cyclopentyl-, Cyclohexyl- oder Cycloheptyl-Gruppe oder deren Mono- oder Dihälogen-, Niedrigalkyl-,
Niedrigalkoxy- oder Hydroxy-substituierte:·. Analoge,
eine Aralkyl-, Heterocyclylalkyl- oder Aryl-Gruppe, wie eine Benzyl-, Phenyläthyl-, Phenyl- oder
Furfurylgruppe bedeutet,
wobei diese Gruppen gegebenenfalls durch Halogenatome oder Nitro-, Niedrigalkyl-, Hydroxy- oder
Alkoxygruppen substituiert sein können. 35
M/22 261 -4V-
2. Hemi-acetal-Koinplex PR-1381 nach Anspruch 1 mit
Methanol, gekennzeichnet durch folgende physikalischen
chemische Daten:
a) Elementar-Analyse: C 66,30; H 8,50;
b) Schmelzpunkt: 139 - 141 °C;
c) IR-Spektrum: 3520 (Sch), 337.5 (br), 2950 (s) ,
2930 (s), 2780 (s), 2700 (w), 1670 (s), 1620 (w),
1460 (w), 1410 (w), 1390 (w), 1350 (w), 1310 (w) ,
1170 (w), 1080 (S), 1040 (s), 1030 (s) , 1020 (s),
950 (w) , 940 (w) , 900 (w), 830 (w), 750 (w), 680 (w), 630 (w) cm ; gemäß Figur 2;
d) Spezifische Drehung (c=0,2; Äthanol) [a]^° =+102,8°, *
sofort nach Herstellung gemessen; /
e) Spezifische Drehung (c= 0,2; Äthanol) [α]β = +89,6°,
10 Stunden nach Herstellung gemessen;
f) Stoßionisations-Massenspektrum (m/e): identisch
mit dem Spektrum von PR-1350 nach Anspruch 1;
g) H-NMR-Spektrum, unmittelbar nach Herstellung einer
10 %-igen Lösung in Deuterochloroform aufgenommen:
9,28 (s), 6.54 (t>, 5.31 (bs), 4,58 (t), 3,40 (s),
3,25 (d, J=4,5), 2,82 (d, J=4,5), 2,35 (m), 1.77 (m), 1.21 (s), 1.00 (d, J=6), 0,90 (s);
1 %
h) UV-Maximum bei 230 nm (E1 = 310) in äthanolischer
h) UV-Maximum bei 230 nm (E1 = 310) in äthanolischer
Lösung.
M/22 261 -€ -
3. Komplex nach Anspruch 1 oder 2 in im wesentlichen
reiner Form.
4. Verfahren zur Herstellung eines Komplexes nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß man einen
Stamm vonuOidiodendron truncatum Barron in einem Nährmedium züchtet, wobei sich der Komplex in der
Nährbrühe anreichert, und man den Komplex dann aus der Nährbrühe isoliert.
15
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Oidiodendron truncatum Barron, HL-972,
ZP-88 (CBS 475.78) verwendet.
20
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß
man einen weiteren Stamm von Oidiodendron truncatum Barron verwendet, ausgewählt unter Stämmen, die beim
Centraalbureau voor Schimmelculttax.es, Baarn, Niederlande, unter den Nummern CBS 629.70, CBS 222.65,
CBS 115.65 und CBS 114.65 hinterlegt sind.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, 3^ daß man einen Mutanten der in Anspruch 5 und 6 angegebenen
Stämme verwendet, wobei der Mutant in an sich bekannter Weise hergestellt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 4 zur Reinigung der in der ° Nährbrühe angereicherten Substanz, dadurch gekennzeichnet,
daß man den Komplex PR-1350 aus dem
M/22 261 ~ -V-1
Fermentationsmedium extrahiert, den Extrakt konzentriert und das Rohprodukt weiter reinigt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
daß man zur Gewinnung des Komplexes PR-I350
10
a) das Fermentationsmedium mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und den Extrakt einengt,
oder
den im Fermentationsmedium vorhandenen Komplex PR-1350 an einem macroreticularen Harz, wie
Amberlite®XAD-2 oder Diaion ® HP-20, bei einem pH-Wert zwischen 2 und 10 absorbiert,
anschließend mit einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol, eluiert und das Lösungsmittel im
Vakuum verdampft,
und
und
b) das so erhaltene Rohprodukt durch Chromatographie
(R) an einem macroreticularen Harz, wie Diaion ^ HP-20 unter Verwendung von Methanol-Wasser-Mischungen
als Eluierungsmittel, oder Sephadex-^ LH-20 unter Verwendung von Methanol oder
Chloroform-Methanol-Hexan-Mischungen als
Eluierungsmittel, weiter reinigt. 30
10. Verfahren zur Herstellung eines Hemiacetalkomplexes
nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den
Komplex PR-1350 mit einem Alkohol der Formel ROH, 3^ worin R die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen
besitzt, mischt.
M/22 261 ~*
1.1. Verfahren zur Herstellung des Hemiacetals PR-1381
nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Komplex PR-1350 in Methanol löst und das
kristalline Produkt durch Filtration isoliert.
12. Verfahren zur Herstellung des Komplexes PR-1350
nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Hemiacetal des Komplexes PR-1350 in einem organischen
Lösungsmittel, das von den in Anspruch 1 angegebenen Alkoholen ROH verschieden ist, löst, die
Lösung entsprechend lange stehen läßt und den auf diese Weise gebildeten Komplex PR-1350 ausfällt.
13. ^Pharmazeutisches Mittel zur Anwendung bei Menschen
oder Tieren, gekennzeichnet durch einen Gehalt an
mindestens einer der Substanzen nach Anspruch 1 oder 2 als Wirkstoff, gegebenenfalls in Kombination
mit pharmazeutisch verträglichen, nicht-toxischen Trägern und/oder Hilfsstoffen.
25
14. Komplex nach Anspruch 1 oder 2 zur Verwendung als antibiotisches oder Antitumor-Mittel.
15. Oidiodendron truncatum Barron HL^972, ZP-88 (CBS
475.78).
16. Mikroorganismen nach Anspruch 15 in oder auf einem
sterilen Medium.
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