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Verfahren zur Herstellung der neuen entzündungswidrigen Substanz Zygosporin A
EMI1.1
coiden Verbindungen sind hinsichtlich ihrer entzündungswidrigen Wirkung den erwähnten Adrenocorticoiden jedoch im allgemeinen unterlegen. Es erschien daher als wünschenswert, andere nichtadrenocorticoide Verbindungen zu entwickeln, die eine ebenso starke entzündungswidrige Wirkung wie die Adrenocorticoide aufweisen.
Im Verlauf der Suche nach neuen Gärungsprodukten wurde festgestellt, dass die Arten Zygosporium, MFC-612 und MFC-702 in der Sammlung des Forschungslaboratoriums der Firma Shionogi & Co., Litd., Osaka, Japan, und bei der "American Type Culture Collection" unter den Nummern ATCC 20011 und 20012 eingetragen, eine kristalline Substanz erzeugen, die eine starke entzündungshemmende Wirkung aufweist.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der neuen entzündungshemmenden Substanz Zygosporin A, bei welchem erfindungsgemäss der Stamm Zygosporium masonii A TCC Nr. 20011 oder der Stamm Zygosporium mocophilum ATCC Nr. 20012 oder deren natürliche oder künstliche Mutanten oder Varianten etwa 50 bis 150 h bei etwa 25 bis 320 C in einem wässerigen Milieu unter aeroben Bedingungen gezüchtet und die angesammelte entzündungshemmende Substanz aus der Gärungsbouillon gewonnen wird.
Zygosporium MFC-612 wurde aus einer Probe von toten Blättern von Daphniphyllum macropodum, die 1965 in Kyoto gesammelt wurde, isoliert und zeigt folgende morphologische Merkmale.
Das Wachstum auf Kartoffel-Saccharose-Agar ist mittelmässig und die Kolonie weiss und filz- ähnlich mit einer dunkelgrauen zentralen Strangpartie, auf der die Sporenbildung erfolgt. Die Konidienfäden sind aufrecht und bestehen aus drei Teilen : (1) einem aufrechten Grundast, der aus 1 bis 3 Zellen besteht, eine fahlbraune Färbung hat und 5 bis 20 auf 2 bis 2, 5 11 gross ist. (2) einem mittleren Teil, der vom Grundast getragen wird und eine aufrechte Kette von 2 bis 4 Ende am Ende miteinander verbundenen Bläschen bildet. Jedes Bläschen ist dunkelbraun, 7 bis 12 11 lang, von vorn gesehen gespalten, unten 2 p und oben 4 11 breit. Von der Seite gesehen, sieht es ungefähr wie die Klinge eines Gartenmessers mit einem 2 bis 4 p langen Schnabel aus.
Die Seitenwand ist dick, ausser dort, wo das nächste Bläschen angegliedert ist. Der Schnabel trägt zwei aus Sporen entstandenen Zellen, die divergierend, nach oben gebogen, eiförmig-spitz, hyalin und 4 bis 6 auf 2 bis 2, 5 11 gross sind. (3) einer langen hyalinen apikalen Hyphe am Ende des Konidienfadens, die 20 bis 30 auf 1 bis 211 gross, kontinuierlich und oben geschwollen ist und eine ovale Knolle von etwa 2, 5 bis 3, 5 11 Durchmesser bildet.
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Die Konidien werden einzeln aus der Spitze jeder aus Sporen entstandenen Zelle erzeugt und sind trocken, oval, hyalin, mit zarten Tuberkeln versehen und 6 bis 9 auf 4 bis 6 u gross.
Auf Grund dieser Merkmale wurde das Zygosporium MFC-612 als das Zygosporium masonii Hughes (S. J. Hughes : Mycol. Pap., C. M. L, 44,15 [1951]) bestimmt. Der gegenwärtig isolierte Stamm, näm- lich Zygosporium masonii MFC-612, wurde bei der "American Type Culture Collection" deponiert und mit der Nummer ATCC 20011 versehen. Vorzugsweise wird das Zygosporium masonii MFC-612 (ATCC Nr. 20011) auf Kartoffel-Rüben-Agar, das sich alle 3 Monate verpflanzt, bei 100 C aufbewahrt.
Anderseits wurde das Zygosporium MFC-702 aus einer Probe von toten Blättern von Osmanthus ilicifolius, die 1966 in Asakawa, Tokyo, gesammelt wurde, isoliert und zeigt folgende Merkmale.
Das Wachstum auf Kartoffel-Saccharose-Agar ist verhältnismässig langsam und die Kolonie fahlbraun. Die Myzele bestehen aus hyalinen bis subhyalinen, verzweigtkettigen und durch eine Trennwand getrennte Hyphen, die 1 bis 3 u breit sind. Sicheln werden unmittelbar vom Myzel als Seitenast getragen. Der Stengel, der das Bläschen stützt, ist zylinderförmig, 4 bis 16 auf 2 bis 3 p gross, durch 0 bis 1 Trennwand getrennt und braun. Das Bläschen ist dunkelbraun und obpyriform und bildet einen einseitigen Schnabel in der Spitze, 13 bis 1511 lang, 6 bis 8 u in der grössten Breite, von vorne gesehen, und 4 bis 5 bis 6 u in der grössten Breite, von der Seite gesehen.
Drei divergierende aus Sporen entstandene Zellen an der Spitze des Schnabels sind hyalin, eiförmig-spitz, manchmal gebogen und 4 bis 6 auf 3 bis 4p gross. Die sterile Zelle, die sich an der Spitze des Bläschens befindet, ist zylinderförmig mit einem runden, leicht geschwollenen und oft zerrissenen Ende und 5 bis 8 auf 2 bis 3 u gross. Die Konidien werden an der Spitze jeder aus Sporen entstandenen Zelle erzeugt und sind oval und 8 bis 10 auf 6 bis 7 li gross.
Auf Grund dieser Merkmale wurde das Zygosporium MFC-702 als Zygosporium mycophilum (Vuill.) Sacc. (S. J. Hughes : Mycol. Pap., C. M. I., 44,9 [1951]) identifiziert. Der gegenwärtig isolierte Stamm, nämlich Zygosporium mycophilum MFC-702, wurdebei der"AmericanTypeCulture Collection" deponiert und erhielt die Nummer ATCC 20012. Vorzugsweise wird das Zygosporium mycophilum MFC-702 (ATCC Nr. 20012) auf Kartoffel-Saccharose-Agar unter den oben beim Zygosporium masonii MFC-612 (ATCC Nr. 20011) angegebenen Bedingungen aufbewahrt.
Es soll festgehalten werden, dass zur Herstellung von Zygosporin A die Erfindung nicht auf die Verwendung der oben angegebenen beiden Stämme, nämlich Zygosporium masonii MFC-612 (ATCC Nr.
20011) und Zygosporium mycophilum MFC-702 (ATCC Nr. 20012), beschränkt ist. Sie soll auch die Verwendung natürlicher oder künstlicher Mutationen oder Variationen, die von den oben beschriebenen Organismen aus erzeugt werden, einschliessen. Die künstliche Erzeugung von Mutationen oder Variationen kann nach einem herkömmlichen Verfahren, wie z. B. Röntgenstrahlen, ultraviolette Bestrahlung und Stickstoffsenfen, bewirkt werden.
Die entzündungshemmende Substanz Zygosporin A wird bei der Züchtung des Zygosporin-erzeugenden Stammes Zygosporium masonii und Zygosporium mycophilum in einem wässerigen Nährmilieu bei einer Temperatur von etwa 25 bis etwa 32 C, vorzugsweise 27 bis 290 C, unter aeroben Bedingungen erzeugt. Die Zusammensetzung des Nährmilieus kann innerhalb eines sehr weiten Rahmens variieren.
Wesentlich sind eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Elemente. Beispiele geeigneter Kohlenstoffquellen sind Stärke, Glucose, Glycerin, Dextrin, Maltose, Fructose, Saccharose, Lactose, Mannitol und Melassen. Zu den geeigneten Stickstoffquellen für das Gärungsverfahren gehören Fleischextrakte, Pepton, Maiswasser, Sojabohnenmehl, Erdnussmehl, Weizengluten, Baumwollsamenmehl, Casaminosäure (Säurehydrolysat von Casein), NZ-Amin (enzymatisches Hydrolysat von Casein), Hefeextrakte, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumchlorid. Beispiele geeigneter Quellen anorganischer Elemente sind Mineralsalze, wie z. B. Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat und Kaliumphosphat. Das Nährmilieu kann vor der Impfung des Mikroorganismus auf etwa PH 7, 0 eingestellt werden oder nicht.
Bei übermässiger Schaumbildung können Antischaummittel, wie z. B. Pflanzenöle, Schmalzöl und Polypropylenglykol dem Gärungsmilieu vor oder im Verlauf der Gärung beigefügt werden. Die maximale Ausbeute an der entzündungshemmenden Substanz Zygosporin A kann unter optimalen Temperatur- und Ventilationsbedingungen in etwa 50 bis etwa 150 und gewöhnlich in etwa 70 bis etwa 100 h Gärung erzielt werden.
Im allgemeinen sammelt sich die erfindungsgemäss hergestellte Substanz Zygosporin A in erster Linie im Gärungsmilieu an. Nach der Fermentation des Mikroorganismus wird das Myzel unter Verwendung einer herkömmlichen Ausrüstung, wie z. B. Filterpressen und Schleudervorrichtungen, aus der Gärungsbouillon entfernt, worauf Zygosporin A nach einem herkömmlichen Trennverfahren, wie z. B.
Extraktion mit einem Lösungsmittel, und einem Adsorptionsverfahren aus dem Filtrat rückgewonnen
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wird. Gegebenenfalls können die gesammelten Myzele ebenfalls den Extraktionsverfahren mit einem Lösungsmittel unterzogen werden, da das aktive Produkt bis zu einem gewissen Grad in den Myzelen enthalten ist. Zu den geeigneten Lösungsmitteln zur Extraktion und zum Eluieren des Wirkstoffes gehören Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Aceton, Dimethylformamid, Dioxan, Tetrahydrofuran, Äther, Äthylacetat, Butylacetat, Amylacetat, Chloroform, Methylenchlorid, Dichloräthan, Trichloräthan, Benzol u. dgl. Beispiele geeigneter Adsorbentien sind Celite (eine Art Diatomeenerde), Hyflo-Super- Cel (eine Art Diatomeenerde), Kieselsäure, Silicagel, Aktivkohle u. dgl.
Gewöhnlich wird eine Kombination einer Extraktion mit einem Lösungsmittel und einer Kristallisation durch Konzentration verwendet. Zum Beispiel wird das Filtrat der Kulturbouillon mit einem geeigneten mit Wasser unvermischbaren organischen Lösungsmittel, wie z. B. Äthylacetat und Chloroform, extrahiert und der Extrakt konzentriert, um den Wirkstoff in Form roher Kristalle zu fällen.
Der auf diese Weise erzielte rohe Wirkstoff wird nach herkömmlichen Verfahren, wie z. B. Umkristallisieren, Chromatographie u. dgl., weiter gereinigt. Beispiele geeigneter Lösungsmittel für die Umkristallisation sind Aceton, Methanol und Äthanol. Die bevorzugten Adsorbentien für die Chromatographie sind Kieselsäure, Silicagel u. dgl.
Die entzündungswidrige Substanz Zygosporin A besteht aus farblosen nadelartigen Kristallen, die unter Zersetzung bei 268 bis 2700 C schmelzen, wenn sie aus Aceton umkristallisiert werden. Sie ist in Methanol, Äthanol, Chloroform, Methylenchlorid, Aceton, Dimethylformamid, Dioxan, Äthylacetat und Pyridin löslich, in Äther und Benzol leicht löslich und in Petroläther und Wasser unlöslich. Sie verhält sich als neutrale Substanz.
Die Elementaranalyse von Zygosporin A ergibt :
EMI3.1
<tb>
<tb> Kohlenstoff <SEP> 71, <SEP> 00o <SEP>
<tb> Wasserstoff <SEP> 7, <SEP> 291o
<tb> Sauerstoff <SEP> 18, <SEP> 93% <SEP>
<tb> Stickstoff <SEP> 2, <SEP> 76%. <SEP>
<tb>
Die Verbindung weist ein Molekulargewicht von etwa 500 auf, durch die Methode der Herabsetzung des Dampfdruckes bestimmt. Nach der Massenspektrometrie beträgt das Molekulargewicht 507. Aus den
EMI3.2
nungen gezeigt). Das in Deuterochloroform (CDCL) bestimmte kernmagnetische Resonanzspektrum von Zygosporin A zeigt folgende Signale (s =8inglett, d = Doublet, m = Multiplet, J = Kupplungskonstante) :
EMI3.3
EMI3.4
Das auf diese Weise erzeugte Zygosporin A weist eulehochgradige entzündungswidrigewirkung auf.
Zum Beispiel wurde die Wirkung von Zygosporin A gegen Ödem bei Ratten bei oraler Verabreichung untersucht ; die Ergebnisse sind zusammen mit denjenigen eines im Handel erhältlichen entzündungshemmenden Mittels, nämlich Phenylbutazon, in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben.
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Tabelle 1
EMI4.1
<tb>
<tb> Hemmende <SEP> Wirkung <SEP> gegen <SEP> Ödem
<tb> Hemmung <SEP> von <SEP> Ödem <SEP> in <SEP> %
<tb> Zeitdauer <SEP> nach <SEP> der <SEP> Verabreichung
<tb> Dosis <SEP> des <SEP> entzündungshemmenden <SEP> Mittels
<tb> Versuchsverbindung <SEP> (mg/kg) <SEP> (in <SEP> h)
<tb> 2 <SEP> 3
<tb> Zygosporin <SEP> A <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> 80, <SEP> 6 <SEP> 82, <SEP> 7 <SEP>
<tb> ZygosporinA <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 44, <SEP> 3 <SEP> 32, <SEP> 7 <SEP>
<tb> Zygosporin <SEP> A <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 19, <SEP> 7 <SEP> 2,
<SEP> 0 <SEP>
<tb> Phenylbutazon <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP> 13, <SEP> 7 <SEP> 16, <SEP> 8 <SEP>
<tb>
Anmerkung : Die Ratten wurden mit der Versuchsverbindung oral vorbehandelt, worauf ihnen das entzündungshemmende Mittel, 1'iges Carrageenin, subkutan verabreicht wurde. Das hervorgerufene Ödem wurde gemessen und mit dem ohne Vorbehandlung hervorgerufenen verglichen. Die hemmende Wirkung gegen Ödem wird als prozentuale Hemmung ausgedrückt.
Aus der obigen Tabelle 1 geht hervor, dass die hemmende Wirkung von Zygosporin A gegen Ödem bei oraler Verabreichung etwa 50 Mal grösser als diejenige von Phenylbutazon ist.
Die hemmende Wirkung von Zygosporin A gegen Ödem wurde ferner bei Ratten bei subkutaner Verabreichung untersucht ; die Ergebnisse und die mit Phenylbutazon erzielten sind in der nachstehenden Tabelle 2 wiedergegeben.
Tabelle 2
EMI4.2
<tb>
<tb> Hemmende <SEP> Wirkung <SEP> gegen <SEP> Ödem
<tb> Hemmung <SEP> von <SEP> Ödem <SEP> in <SEP> % <SEP>
<tb> Zeitdauer <SEP> nach <SEP> der <SEP> Verabreichung
<tb> Dosis <SEP> des <SEP> entzündungshemmenden <SEP> Mittels
<tb> Versuchsverbindung <SEP> (mg/kg) <SEP> (in <SEP> h)
<tb> 2 <SEP> 3
<tb> Zygosporin <SEP> A <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 80, <SEP> 7 <SEP> 73, <SEP> 4 <SEP>
<tb> Zygosporin <SEP> A <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 64, <SEP> 1 <SEP> 50, <SEP> 4 <SEP>
<tb> Zygosporin <SEP> A <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 36, <SEP> 9 <SEP> 20, <SEP> 8 <SEP>
<tb> Phenylbutazon <SEP> 100 <SEP> 45, <SEP> 9 <SEP> 46, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Phenylbutazon <SEP> 50 <SEP> 28, <SEP> 9 <SEP> 34, <SEP> 1 <SEP>
<tb>
Anmerkung :
Die Ratten wurden mit der Testverbindung subkutan vorbehandelt, worauf ihnen das entzündungshemmende Mittel, nämlich liges Carrageenin, subkutan verabreicht wurde. Das erzeugte Ödem wurde gemessen und mit dem ohne Vorbehandlung hervorgerufenen verglichen. Die hemmende Wirkung gegen Ödem wird als prozentuale Hemmung ausgedrückt.
Aus der obigen Tabelle 1 geht hervor, dass die hemmende Wirkung von Zygosporin A gegen Ödem bei subkutaner Verabreichung etwa 50 Mal grösser als diejenige von Phenylbutazon ist.
Dann wurde die hemmende Wirkung von Zygosporin A gegen Abzesse bei Ratten untersucht ; die Ergebnisse werden in den nachfolgenden Tabellen 3 und 4 gezeigt und mit den mit Phenylbutazon erzielten verglichen.
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Tabelle 3
EMI5.1
<tb>
<tb> Hemmende <SEP> Wirkung <SEP> gegen <SEP> Abszesse
<tb> Abszess
<tb> Gesamtdosis <SEP> Mittleres <SEP> Gewicht <SEP> Hemmung
<tb> Versuchsverbindung <SEP> (mg/kg) <SEP> (mg) <SEP> (0/0)
<tb> Kontrollversuch-2096 <SEP> 129 <SEP>
<tb> Zygosporin <SEP> A <SEP> 5 <SEP> 1310 <SEP> 86 <SEP> 37, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Zygosporin <SEP> A <SEP> 10 <SEP> 976 <SEP> 70 <SEP> 53, <SEP> 4 <SEP>
<tb> Phenylbutazon <SEP> 25 <SEP> 1815 <SEP> 98 <SEP> 13, <SEP> 4 <SEP>
<tb>
Anmerkung : Der Abszess wurde durch die subkutane Injektion von 2%igem Carrageenin in die Kreuzbeingegend von Ratten hervorgerufen.
Dann wurden die Versuchsverbindungen oral verabreicht.
Die Hälfte der Gesamtdosis wurde unmittelbar nach der Einspritzung und die zweite Hälfte 3 h später verabreicht. Die Ratten wurden 24 h nach der Injektion getötet und der Abszess seziert und gewogen.
Tabelle 4
EMI5.2
<tb>
<tb> Hemmende <SEP> Wirkung <SEP> gegen <SEP> Abszesse
<tb> Abszess
<tb> Gesamtdosis <SEP> Mittleres <SEP> Gewicht <SEP> Hemmung
<tb> Versuchsverbindung <SEP> (mg/kg) <SEP> (mg) <SEP> (0/0) <SEP>
<tb> Kontrollversuch-1991 <SEP> 87 <SEP>
<tb> Zygosporin <SEP> A <SEP> 1 <SEP> 1728 <SEP> 106 <SEP> 13, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Zygosporin <SEP> A <SEP> 2,5 <SEP> 1532 <SEP> ¯ <SEP> 76 <SEP> 23,1
<tb> Phenylbutazon <SEP> 50 <SEP> 1516 <SEP> : <SEP> I <SEP> : <SEP> 112 <SEP> 23, <SEP> 9 <SEP>
<tb>
Anmerkung : Der Abszess wurde durch die subkutane Injektion von 2%igem Carrageenin in die Kreuzbeingegend von Ratten hervorgerufen. Dann wurden die Versuchsverbindungen oral verabreicht. Die Hälfte der Gesamtdosis wurde unmittelbar nach der Einspritzung und die zweite Hälfte 3 h später verabreicht.
Die Ratten wurden 24 h nach der Einspritzung getötet und der Abszess seziert und gewogen.
Aus den obigen Tabellen 3 und 4 geht hervor, dass Zygosporin A bei oraler Verabreichung in seiner hemmenden Wirkung gegen Abszesse etwa 20 Mal wirksamer als Phenylbutazon ist.
Die hemmende Wirkung von Zygosporin A gegen Granulation wurde durch orale Verabreichung an sechs aufeinanderfolgenden Tagen untersucht ; die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen 5 und 6 angeführt und mit den mit Phenylbutazon erzielten verglichen.
Tabelle 5
EMI5.3
<tb>
<tb> Hemmende <SEP> Wirkung <SEP> gegen <SEP> Granulation
<tb> Tägliche <SEP> Granulom <SEP> Hemmung <SEP> der
<tb> Dosis <SEP> Mittleres <SEP> Gewicht <SEP> Granulation
<tb> Versuchsverbindung <SEP> (mg/kg) <SEP> (mg) <SEP> (%)
<tb> Kontrollversuch-277, <SEP> 6 <SEP> 15, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Zygosporin <SEP> A <SEP> 1 <SEP> 264, <SEP> 6 <SEP> : <SEP> ! <SEP> : <SEP> 19, <SEP> 3 <SEP> 4, <SEP> 7 <SEP>
<tb> Zygosporin <SEP> A <SEP> 2,5 <SEP> 265,1 <SEP> ¯ <SEP> 20,5 <SEP> 4,5
<tb> Phenylbutazon <SEP> 25 <SEP> 235, <SEP> 6 <SEP> 15, <SEP> 8 <SEP> 15, <SEP> 1 <SEP>
<tb>
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Anmerkung : Die Granulome wurden hervorgerufen, indem mit Carrageenin durchtränkte Kügelchen aus Filterpapier in die lacterovetrale Gegend von Ratten gesteckt wurden.
Dann wurden die Versuchsverbindungen 6 Tage einmal im Tag oral verabreicht. 20 h nach der letzten Verabreichung wurden die Ratten getötet, und das Granulom wurde seziert und gewogen.
Tabelle 6
EMI6.1
<tb>
<tb> Hemmende <SEP> Wirkung <SEP> gegen <SEP> Granulation
<tb> Tägliche <SEP> Granulom <SEP> Hemmung <SEP> der
<tb> Dosis <SEP> Mittleres <SEP> Gewicht <SEP> Granulation
<tb> Versuchsverbindung <SEP> (mg/kg) <SEP> (mg)
<tb> Kontrollversuch <SEP> - <SEP> 294 <SEP> ¯ <SEP> 8,4
<tb> Zygosporin <SEP> A <SEP> 5 <SEP> 263, <SEP> 9 <SEP> 16, <SEP> 9 <SEP> 10
<tb> Phenylbutazon <SEP> 50 <SEP> 199,5 <SEP> ¯ <SEP> 11,5 <SEP> 34
<tb>
Anmerkung : Die Granulome wurden hervorgerufen, indem mit Carrageenin durchtränkte Kügelchen aus Filterpapier in die lacterovetrale Gegend von Ratten eingelegt wurden. Dann wurden die Versuchsverbindungen 6 Tage einmal im Tag oral verabreicht. 20 h nach der letzten Verabreichung wurden die Ratten getötet, und das Granulom wurde seziert und gewogen.
. Aus den Tabellen 5 und 6 geht hervor, dass die hemmende Wirkung von Zygosporin A mindestens das Mehrfache von der von Phenylbutazon ist.
Ferner wurde die hemmende Wirkung von Zygosporin A gegen lokale Exudation bei Ratten bestimmt ; die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 7 wiedergegeben und mit den mit Phenylbutazon erzielten verglichen.
Tabelle 7
EMI6.2
<tb>
<tb> Hemmende <SEP> Wirkung <SEP> gegen <SEP> Exudation
<tb> Versuchsverbindung <SEP> Dosis <SEP> (mg) <SEP> Volumen <SEP> des <SEP> Exudats <SEP> (mil)
<tb> Kontrollversuch-53, <SEP> 9 <SEP> 3, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Zygosporin <SEP> A <SEP> 50 <SEP> 6, <SEP> 81 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Zygosporin <SEP> A <SEP> 5 <SEP> 15, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP>
<tb> Zygosporin <SEP> A <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 26, <SEP> 2 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Phenylbutazon <SEP> 50 <SEP> 27, <SEP> 6 <SEP> l. <SEP> 7 <SEP>
<tb> Phenylbutazon <SEP> 5 <SEP> 43, <SEP> 9 <SEP> 4, <SEP> 9 <SEP>
<tb>
Anmerkung : Am ersten Tag wurden 20 ml Stickstoffgas in die Ratten subkutan injiziert, um einen Beutel zu bilden, in welchem 0, 5 ml 10% iges Krotonol injiziert wurden. Am sechsten Tag wurde die Versuchsverbindung lokal in den Beutel injiziert.
Am elften Tag wurden die Ratten getötet, und das Volumen des Exudats wurde gemessen.
Aus der obigen Tabelle geht hervor, dass die hemmende Wirkung von Zygosporin A gegen Exudation ungefähr 100 Mal grösser als die von Phenylbutazon ist.
Die akute Toxizität von Zygosporin A wurde bei Mäusen untersucht ; die mittlere letale Dosis, d. h. der Wert LD , beträgt subkutan 1, 85 mg/kg und oral 36, 0 mg/kg.
Somit ist Zygosporin A im Vergleich zu einem im Handel erhältlichen nichtadrenocorticalen entzündungshemmenden Mittel bemerkenswert wirksam. Daher kann es als wirksames nichtadrenocorticales entzündungshemmendes Mittel verwendet werden. Zur Herstellung der Präparate der Erfindung können an sich herkömmliche Verfahren verwendet werden.
Der Wirkstoff Zygosporin A wird in einer Einheitsdosierungsform mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger dem lebenden Organismus zur Bekämpfung verschiedener Entzündungen und Ödemen, z. B. Rheumatismen, verabreicht. Normalerweise wird das Präparat oral verabreicht, obwohl es ebenso
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wirksam ist, wenn es auf eine andere Weise verabreicht wird. Es kann in verschiedenen Dosierungen, wie z. B. 0, 5, 1, 2, 5, 5,10, 20,25 oder 30 mg, oral verabreicht werden, obwohl der Bereich der Einheitsdosierung noch weiter ist und etwa 0, 2 bis etwa 50 mg und vorzugsweise 1 bis etwa 25 mg beträgt. Es kann verschiedenen pharmazeutischen Trägern beigefügt oder sonstwie mit ihnen verwendet werden. Zu den verschiedenen festen Trägern, die verwendet werden können, gehören z. B.
Lactose, Mannitol, Maisstärke, Talk und Magnesiumstearat, sowie andere Tablettenhilfsstoffe und Füller. Gegebenenfalls können gewisse andere Ingredienzien, wie z. B. Hydrocortison, Prednisolon, Aminopyrin, Chloroquine, Phenylbutazon u. dgl., mit dem erwähnten Wirkstoff vermischt werden. Das medizinische Gemisch kann dann zu Tabletten oder Kapseln aus harter Gelatine verarbeitet werden, je nach der gewünschen Handelsform. Gewöhnlich werden Tabletten bevorzugt. Je nach der gewünschten Tablettengrösse und nachdem, ob die Dosierung zu Kapseln verarbeitet wird, kann die Menge Träger oder Verdünner von 0 bis zur maximalen Menge, die mit den durch die Grösse einer Dosierungseinheit gesetzten praktischen Grenzen vereinbar ist, variieren. Normalerweise liegt die Trägermenge, mit der das Medikament vermischt wird, nicht über etwa 300 bis 500 mg.
Folgende Beispiele sollen die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung veranschaulichen. Sie dienen jedoch lediglich der Veranschaulichung und sind nicht etwa als Einschränkung aufzufassen.
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EMI7.2
geschnittenen Kartoffeln in 500 ml Wasser erzieltem) Kartoffelsaft, 10 g Saccharose und genügendem Wasser, damit man im Ganzen 11 erhält, besteht. Zygosporium masonii MFC-612 (ATCC 20011) wird in die Kultur geimpft und 7 bis 10 Tage bei 27 bis 280 C gezüchtet, bis die Sporenbildung zu Ende ist.
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aus der obigen Kultur geimpft. Die Zucht erfolgt 3 Tage bei 27 bis 280 C unter Schütteln. (3) 50 ml der Kulturbouillon werden in 500 ml eines neuen Kartoffel-Saccharose-Milieus gegeben, das aus den oben beschriebenen Materialien besteht, in einem 2 1-Kolben gegossen und vorgängig sterilisiert.
Die Zucht erfolgt 4 Tage bei 27 bis 280 C, und die auf diese Weise erzielte Kulturbouillon wird als Impfmaterial verwendet.
20 1 Kartoffel-Saccharose-Milieu der oben beschriebenen Zusammensetzung werden in ein 30 l-Gärungsgefäss gegeben, sterilisiert und mit 500 ml des oben hergestellten Impfmaterials geimpft.
Die Zucht erfolgt 4 Tage bei 27 bis 280 C unter Rühren (250 Umdr/min), bei Lüftung (20 l/min) und bei einem Druck von 0, 5 bis 0, 7 kg/cm2.
500 g Celite (Diatomeenerde) werden in die Kulturbouillon gegeben und ausgeschleudert, um (1, 1 kg einschliesslich des Celits) Myzel und 17 l oben schwimmende Flüssigkeit zu erzielen.
Dem Myzel werden 1, 51 Methanol beigefügt, und das Gemisch wird 2 h bei Raumtemperatur ge- rührt. Nach dem Filtrieren wird dasFiltrat untervermindertem Druck konzentriert und der Rückstand mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser, 2n-Natriumcarbonatlösung und wieder mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bei 50 bis 600 C verdampft, wobei ein öliger Rückstand zurückbleibt, der durch Behandlung mit Aceton kristallisiert. wird ; man erhält 18, 1 mg Zygosporin A.
Anderseits werden die 17 l oben schwimmende Flüssigkeit dreimal mit je 7 1 Äthylacetat extrahiert. Der zirka 20 l ausmachende Extrakt wird mit Wasser, mit 2n-Natriumcarbonatlösung und wieder mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bei 50 bis 600 C verdampft. Der Rückstand wird mit Äther oder Aceton behandelt, wobei man 277 mg kristallines Zygosporin A erhält.
Durch Umkristallisieren aus Aceton wird reines Zygosporin A, F. = 268 bis 2700 C, in Form von farblosen Nadeln erzielt.
Beispiel 2 : Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird mit Zygosporium mycophilum MFC-702 (ATCC Nr. 20012) an Stelle von Zygosporium masonii MFC-612 (ATCC Nr. 20011) durchgeführt ; Zygosporin A wird bei ungefähr gleicher Ausbeute wie in Beispiel 1 aus der Kulturbouillon gewonnen.
Beispiel 3 : Zunächst wird eine Sammelkultur nach folgenden Dreistufenverfahren hergestellt : (1) eine schräg im Reagensglas angelegte Kartoffel-Saccharose-Agar-Kultur wird aus 200 g Kartoffeln, 10 g Saccharose, 5 g Agar und 11 Wasser erzeugt. Die Kultur wird mit Zygosporium masonii MFC-612 (ATCC Nr. 20011) geimpft und 7 Tage bei 280 C gezüchtet. (2) 100 ml eines 3, 0% Glukose, 2, 0% Pepton
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und 0, 5% Natriumchlorid (pH 6, 0) enthaltenden wässerigen Nährmilieus werden in einen 500 ml-Kolben gegeben, sterilisiert und mit einer geeigneten Menge Sporen aus der obigen Kultur geimpft.
Die Zucht wird 4 Tage bei 280 C unter Schütteln (140 Bewegungen/min bei einer Amplitude von 7 cm) durchgeführt. (3) 30 ml Kulturbouillon werden in 700 ml eines neuen Nährmilieus gegeben, das aus den glei- chen Materialien wie in obigem Verfahren (2) besteht, in einen 2 1-Kolben gegossen und vorgängig sterilisiert. Die Zucht erfolgt 3 Tage bei 280 C unter Schütteln (300 Umdr/min), und die auf diese Weise erzielte Kulturbouillon wird als Impfmaterial verwendet.
70 1 eines 3, 0% Glukose, 2, 0o Pepton und 0, 50/0 Natriumchlorid (PH 6, 8) enthaltenden wässerigen Nährmilieus werden in einem 100 1-Behälter gegeben. 84 g P-2000 (Polypropylenglykol, ein von der Firma The Dow Chemical Company hergestelltes Antischaummittel), werden beigefügt, und das Gemisch wird sterilisiert. Das Milieu wird mit 2, 11 des oben beschriebenen Impfmaterials geimpft und die Zucht 3 Tage bei 280 C unter Rühren (370 bis 380 Umdr/min), unter Lüftung (70 l/min) und bei einem Druck von 0, 7 kg/cm durchgeführt.
Die Kulturbouillon wird ausgeschleudert, um die Myzele zu entfernen, und die 76 l oben schwim- mende Flüssigkeit werden zweimal mit je 20 1 Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck verdampft, wobei man 5, 7 g rohes Zygosporin A erhält. Durch Umkristallisieren aus Aceton werden 5, 4 g reines Zygosporin A, F. = 268 bis 2700 C (Zers. ) in Form von farblosen Nadeln erzielt.