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Verfahren zur Herstellung eines neuen Metaboliten Die vorliegende
Erfindung betrifft den neuen Metaboliten 3-r5ß,8a-Dimethyl-6-acetoxy-2-methylen-5-(4-methyl-3-pentenyl-)-lß,2,3,4,4aa,5,6a,7,8,8a-decahydro-1-naphthylmethyl-J
-5 ,6-dimethyl-4-hydroxy-2H-pyran-2-on (Formel I, siehe Formelblatt) der nachstehend
mit Sesquicillin bezeichnet wird, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses Metaboliten.
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Erfindungsgemäss gelangt man zu Sesquicillin, indem man einen Stamm
der Pilzspecies Sesquicillium globulisporum nov. spec. in einem Nährmedium züchtet,
Sesquicillin aus der Fermentationsbrühe, die gegebenenfalls mit dem Ultraturrax
aufgeschlossen wird, auf an sich bekannte Weise durch extraktive und / oder adsorptive
Arbeitsmethoden isoliert und hierauf chromatographisch, durch Kristallisation oder
mittels Gegenstromverteilung reinigt.
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Der neue erfindungsgemäss verwendete Stamm von Sesquicillium globulisporum
nov. spec. wurde aus einer in Rovinj in Jugoslavien gefundenen Erdprobe isoliert
und eine Probe davon beim United States Department of Agriculture (Northern Utilization
Research and Development Division) Peoria, 111./USA unter der Nummer NRRL 5433 deponiert.
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Der neue Stamm der Pilzspecies Sesquicillium globulisporum nov. spec.
wächst relativ langsam und bildet auf Malzagar innert 10 Tagen bei optimaler Temperatur
einen dichten, polsterartigen Thallus von 3 -4 cm Durchmesser. Seine Hyphen dringen
nur wenig in den Nährboden ein, von unten gesehen scheint die Kultur schwach gelblich.
Das Wachstumsoptimum liegt bei 21 -27 °, ist also relativ breit,-das Minimum ist
bei 6 °, das Maximum bei 36 °. Der Thallus besteht aus.dicht verwobenen, vielfach
verzweigten, septierten Hyphen, die seitlichen Zweige biegen sich oft zur radialen
Richtung um. Die Hyphendicke beträgt 3 p bei den primären, meist geraden und radialen
Laufhyphen, 0,8 - 1,5 p bei den primären und sekundären Zweighyphen. Die sehr spärlich
bei Temperaturen unter 20 ° gebildete Konidienform erscheint makroskopisch in dichten
Polstern von vielfach dichotom oder wirtelig verzweigten Systemen von Phialiden
tragenden Hyphen mit 1,2 - 1,5 p dicken und 4 - 7 P langen Zellen. Die Phialiden
brechen seitlich aus den Hyphenzellen oder stehen an den Enden, in den Polstern
liegen sie dicht gepackt auf verschiedener Höhe mehr oder weniger gegen oben gerichtet.
Sie sind dimorph. Endphialiden sind Telephialiden (Gams 1968), oft am Grunde blasig
angeschwollen und 4 - 7 p lang und 1,5 - 2 P dick, und in einem feinen, manchmal
etwas gekrümmten Schnabel ausgezogen. Die nicht regelmässig auftretenden interkalaren
Phialiden sind Pleurophialiden (Gams 1968), mehr oder weniger zylindrisch und nur
oben seitlich in einem feinen Schnabel ausgezogen. Die mehr oder weniger deutlich
kugeligen, hyalinen, glattwandigen Konidien messen 1 - 1,5 p.
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Innerhalb der Trägerpolster sind sie in falschen (d. h.
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nicht zusammenhängenden) Ketten angeordnet, an einzelnen Phialiden
bilden sie bald zerfallende Tröpfchen.
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Sesquicillium globulisporum nov. spec. zeigt wie die anderen drei
bisher bekannt gewordenen Arten der Gattung Sesquicillium Gams oft paarweise übereinanderstehende
Phialiden, doch treten die Paare nicht immer regelmässig auf. Zuweilen stehen die
Endphialiden auch auf 2, ja selten sogar auf 3 interkalaren Phialiden.
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Die von Gams und Veenbaas-Rijks beschriebenen drei Arten haben alle
grössere und ellipsoidische Konidien.
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Die übrigen Merkmale, vor allem auch die Strukturen der Träger sind
auch bei diesen Arten variabel.
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(Literatur: K. W. Gams in Acta bot. neerl., 17, p. 455 und 457 (1968);
Veenbaas-Rijks in Acta bot. neerl., 19 (3), p. 323 (1970).
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Der neue Stamm NRRL 5433 lässt sich auf Nährböden, die die üblichen
Nährstoffe für Pilze enthalten, züchten.
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So verwendet dieser Stamm die für heterotrophe Mikroorganismen üblicherweise
benutzten Nährstoffe, beispielsweise Glucose und Saccharose als Kohlenstoffquelle,
organische stickstoffhaltige Verbindungen, wie Pepton, Hefeextrakt, Aminosäuren
und Ammoniumoxalat als Stickstoffquellen, sowie die üblichen Mineralsalze und Spurenelemente.
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Sesquicillin kann man in der Weise herstellen, dass ein flüssiges
Nährmedium mit einer Mycel-Sporen-Suspension des neuen Stammes Sesquicillium globulisporum
nov.
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spec. beimpft und die Kultur 3 - 10 Tage, vorzugsweise
4
Tage, bei 18 - 33 °, vorzugsweise bei 27 0 bei einem pH-Wert von 4,8 - 5,2 inkubiert
wird. Die Züchtung kann unter aeroben Bedingungen in einer Oberflächenkultur oder
submers unter Schütteln oder in Fermentern mit Begasung durch Luft oder Sauerstoff
unter Rühren erfolgen.
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Sobald eine maximale Menge an Sesquicillin produziert worden ist,
wird de Kulturbrühe gegebenenfalls mit dem Ultraturrax aufgeschlossen und Sesquicillin
durch extraktive und / oder adsorptive Arbeitsmethoden auf an sich bekannte Weise
isoliert. Sesquicillin kann hierauf chromatographisch, durch Kristallisation oder
mittels Gegenstromverteilung gereinigt werden.
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Eine Methode, die sich als vorzugsweise geeignet erwiesen hat, ist
die Extraktion der aufgeschlossenen Kulturbrühe mit Aethylenchlorid, jedoch können
auch andere organische Lösungsmittel, wie z. B. Benzol, Chloroform, Butylacetat,
Methylenchlorid, Butanol oder Essigester verwendet werden.
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Anschliessend werden die Extrakte vom Lösungsmittel befreit, z. B.
durch Destillation, der Rückstand entfettet und Sesquicillin auf chromatographischem
Wege an Sephadex LH 20, Tonerde, Kieselgel, Magnesiumsilikat, Aluminiumoxid und
dergleichen, Gegenstromverteilung und / oder Kristallisation gereinigt.
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Sesquicillin zeichnet sich durch interessante pharmakologische Eigenschaften
aus und kann daher als Heilmittel verwendet werden.
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Wie sich bei Versuchen an der hypertonen Grollmann-Ratte gezeigt hat,
besitzt Sesquicillin antihypertensive Eigenschaften. Die zu verwendende Dosis variiert
naturgemäss je nach Art der Administration und des zu behandelnden Zustandes. Im
allgemeinen werden jedoch bei Testtieren befriedigende Resultate mit einer Dosis
von 20 bis 30 mg/kg Körpergewicht erhalten; diese Dosis kann nötigenfalls in 2 bis
3 Anteilen oder auch als Retardform verabreicht werden. Für grössere Säugetiere
liegt die Tagesdosis bei etwa 500 bis 800 mg; für orale Applikationen enthält eine
geeignete Verabreichungsform 500 bis 800 mg der Wirksubstanz, vermischt mit flüssigen
oder festen Trägersubstanzen. Sesquicillin besitzt überdies eine ödemhemmende und
entzündungshemmende Wirksamkeit, wie sie im Carrageen-Oedemtest und im Granülombeuteltest
an der Ratte gezeigt werden kann.
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Die zu verwendende Dosis variiert naturgemäss je nach Art der Administration
und des zu behandelnden Zustandes. Im allgemeinen werden jedoch bei Testtieren befrirdigende
Resultate mit einer Dosis von 1 bis 35 mg/kg Körpergewicht erhalten; diese Dosis
kann nötigenfalls in 2 bis 3 Anteilen oder auch als Retardform verabreicht werden.
Für grössere Säugetiere liegt die Tagesdosis bei etwa 70 bis 800 mg; für orale Applikationen
enthält eine geeignete Verabreichungsform 70 bis 800 mg der Wirksubstanz, vermischt
mit flüssigen oder festen Trägersubstanzen. Sesquicillin besitzt überdies eine bronchospasmolytische
Wirkung, wie sie am vagal-induzierten Bronchospasmus am Meerschweinchen, am Histamin
bedingten Bronchospasmus am Meerschweinchen oder an-der Katze oder mit Histamin-Spray
am Meerschweinchen gezeigt werden kann. Die zu verwendende
Dosis
variiert naturgemäss je nach Art der Administra tion und des zu behandelnden Zustandes.
Im allgemeinen werden jedoch bei Testtieren tefriedigende Resultate mit einer Dosis
von 0,01 bis 10 mg/kg Körpergewicht erhalten; diese Dosis kann nötigenfalls in 2
bis 3 Anteilen oder auch als Retardform verabreicht werden.
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Für grössere Säugetiere liegt die Tagesdosis bei etwa 0,5 bis 10 mg,
für orale Applikationen enthält eine geeignete Verabreichungsform 0,5 bis 10 mg
der Wirksubstanz, vermischt mit flüssigen oder festen Trägersubstanzen.
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Sesquicillin besitzt überdies eine laxative Wirkung wie sie an der
Maus; an der Ratte, am Meerschweinchen oder am Rhesusaffen gezeigt werden kann.
Die zu verwendende Dosis variiert naturgemäss je nach Art der Administration und
des zu behandelnden Zustandes. Im allgemeinen werden jedoch bei Testtieren befriedigende
Resultate mit einer Dosis von 0,1 bis 20 mg/kg Körpergewicht erhalten, diese Dosis
kann nötigenfalls in 2 bis 3 Anteilen oder auch als Retardform verabreicht werden.
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Für grössere Säugetiere liegt die Tagesdosis bei etwa 5 bis 50 mg;
für orale Applikation enthält eine geeignete Verabreichungsform 5 bis 50 mg der
Wirksubstanz, vermischt mit flüssigen oder festen Trägersubstanzen.
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Sesquicillin kann als Arzneimittel allein und zwar sowohl in reiner,
kristalliner Form als auch als Rohkonzentrat oder in entsprechenden Arzneiformen
für orale, enterale oder parenterale Verabreichung verwendet werden.
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In dem folgenden Beispiel, welches die Ausführung des Verfahrens erläutert,
den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken soll, erfolgen alle Temperaturangaben
in Celsiusgraden.
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Beispiel: In einem Fermenter werden 10 Liter einer Nährlösung, die
pro Liter 100 g Saccharose 4 g Glycin 1 g 4 1 g Mg 7 H20 1 g Hefeextrakt und entlaineralisiertes
Wasser enthält, mit einem Liter einer Zwischenkultur des Stammes NRRL 5433 beimpft
und unter Belüftung (0,5 -1,0 Liter Luft / Minute / Liter Nährlösung) und unter
Rühren (150 - 400 Umdrehungen / Minute) 4 Tage bei 27 bei einem pH-Wert von 5,0
inkubiert.
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Die Kulturbrühe wird mit dem Ultraturrax aufgeschlossen und dreimal
mit 10 Liter Aethylenchlorid extrahiert.
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Die Extrakte werden über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum vom
Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wird mit Hexan entfettet, in Aethanol an Sephadex
LH 20 chromatographiert und die Fraktionsrückstände in Chloroform durch eine Aluminiumoxidschicht
(Aktivität II) filtriert.
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Aus dem Filtrat-Rückstand wird Sesquicillin aus Diäthyläther kristallisiert.
Sesquicillin hat die folgenden Charakteristika: Farblose, kristalline Substanz mit
dem Smp. 168 °.
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Spez. Drehung: [a]D = - 11 ° (c = 0,9 in Chloroform).
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Elementaranalyse: Gef. C 74,2 H 9,1 0 17,4 % C29H4205 (470,7) Ber.
C 74,1 H 8,9 0 17,0 z Die als Ausgangsmaterial verwendete Zwischenkultur wird wie
folgt erhalten: Ein Nährboden, der pro Liter 20 g Glucose 2 g Pepton 2 g Malzextrakt
2 g Hefeextrakt 2 g KH2PO4 2 g MgSO4 . 7 H2O 15 g Agar und entmineralisiertes Wasser
enthält, wird mit dem Stamm NRRL 5433 beimpft und mindestens 10 Tage bei 21 ° inkubiert.
Der auf diesem Nährboden gewachsene Mycelrasen wird in physiologischer Kochsalzlösung
suspendiert. Mit dieser Mycel-Sporen-Suspension werden 1 Liter Nährlösung einer
Vorkultur, die pro Liter 100 g Saccharose 3 g Ammoniumoxalat 10 g Proflo 1 g Ca(NO3)2
. 4 H2O
250 mg MgS04 7 H20 250 mg KH2PO4 125 mg KCl 16,6 mg FeS04
7 H20 6,9 mg ZnSO4 7 H2O 10 mcl SO (95 - 97 t) und entmineralisiertes Wasser enthält,
beimpft und 2 Tage bei 24 ° unter Schütteln inkubiert.
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Mit 100 ml dieser Suspension werden 1 Liter Nährlösung einer Zwischenkultur,
die die gleiche Zusammensetzung wie die Vorkultur hat, beimpft und 2 Tage bei 27
unter Schütteln inkubiert.