DE1617801A1

DE1617801A1 - Ein bisher unbekanntes Antibioticum,sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE1617801A1
Application number: DE19661617801
Authority: DE
Inventors: Dr Hans-Peter Sigg; Dr Christian Stoll
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 1965-12-06
Filing date: 1966-12-02
Publication date: 1970-08-20
Also published as: BR6685093D0; CH465771A; CS152272B2; SE329372B; FI43723B; BE690740A; FR1503235A; GB1162027A; AT269356B; FR6036M; DK113353B; US3432598A; NL6616955A; ES334165A1

Description

617801

Fafenfanwälfe'
Df. W. Schalle, Dipl.-Ing. P. Wirth

Dipi.-Ing/G. Dannenbarg , .

Sandoz AG. Dr.V.Schmed-Kcwa^lk

Basel Dr. P. Wekihold, Dr. & Gudel Gase 100-2265

'< Frankfurt/A^ Gr.

Ein bisher unbekanntes Antibioticum sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Antibioticum, das nachstehend mit SL 2266 bezeichnet wird, und seine Salze mit geeigneten organischen und anorganischen Basen sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung.

Erfindungsgemäss gelangt man zu dem neuen Antibioticum SL 2266 und seiner Salze, indem man einen neuen Stamm der PiIzspecies Sordäria araneosa in einer Nährlösung züchtet und das Antibioticum aus der Fermentationsbrühe auf an sieh, bekannte Weise, z.B. durch Extraktion oder Adsorption, isoliert und reinigt und gegebenenfalls durch Reaktion mit geeigneten organischen und anorganischen Basen auf an sich bekannte" Weise in seine Salze überführt.

Der erfindungsgemäss verwendete neue Stamm der Pilzspecies Sordäria araneosa Cain wurde aus einer Erdprobe, welche in Dartonfield in Ceylon im Dschungel gesammelt wurde, isoliert und eine Probe davon beim United States

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NtU* Unterfaden t** 7 11 Abs».. t;r.l Sa*3 desÄndWUßglltt ν * ■ *

- -- . 16Ί780Ί

Department of Agriculture (Northern Utilisation. Research and Development Division), Peoria, 111../JSA unter der Nummer KRRL 319β deponiert.

Morphologisch entspricht der neue Stamm den ümschreibuhgen der Pilzspecies, .wie sie von Roy P. Cain, university .of Toronto Studies, Biological series, Ho. 38, 193^, gegeben

wurden. .-··-. -■ - . .

Der Pilzstamm NRRL 3196 der Pilzspecies Sordaria araneosa bildet auf Malζ-Hefeextrakt-Agar ein bräunliches Substratmycel und ein spärliches, helles Luftmycel aus. Auf sterilisierten Kotproben wächst er bei 27° unter Bildung eines dichten, pelzigen, grausceissen Luftmycels. Die flaschenförmigen, eingesenkten oder teilweise oberflächlichen Perithecien messen 550 - 7OO /t. Sie sind hellbraun und dicht bedeckt von langen septierten Haaren. Die keulenförmigen Asci sind ca. 250-sporig und messen 300-350 χ 52 Die Ascοsporen entstehen in vielen Reihen und sind χ 0,5-8/^ gross. Mit zunehmender Reife werden sie dunkelbraun und undurchsichtig. Sie sind ellipsoidisch und tragen an einem Ende ein primäres hyalines Anhängsel (9 κ 3/*·) ^A ein sekundäres Anhängsel (6,5 - 8 χ 2/i), am anderen Ende nur ein sekundäres Anhängsel.

Für"die Herstellung des neuen Antibiotikums SL 2266 lassen sich auch Stämme verwenden,'wie sie z.B. durch Selektion oder Mutation, unter Einwirkung von Ultraviolett- oder Rönfc*

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- ; -5- . 16U801 .¹⁰°-²²⁶5

geristrahlen oder durch. Anwendung anderer Massnahmen, wie ζ.3. durch Behandlung von Laboratoriumskulturen mit geeigneten Chemikalien aus dein neuen Stamm Sordaria araneosä Cain gewonnen werden können.

-Der neue Stamm von'Sordaria araneosä Cain lasst sich auf vielerlei Nährböden,, die die üblichen Nährstoffe enthalten, züchten. So verwendet ein solcher Stairjn die für kohlenstoffheterotrophen Organismen üblicherweise benutzten Nährstoffe, beispielsweise Glucose, Stärke, Dextrin, Lactose, Rohrzucker usw. als Kohlenstoffquelle, organische und anorganische, stickstoffhaltige Verbindungen, wie Pepton, Hefe- oder. Fleischextrakte,, Aismoniumsulf at, Ammoniumnitrat, Aminosäuren ■ usw. als Stickstoffquelle, sowie die üblichen Mineralsalze und Spurenelemente^ ■ 1

Vorzugsweise wird ein flüssiges Kährmedium mit Konidien oder Mycel des neuen Stammes von Sordaria araneosä Cain beimpft. Die Züchtung erfolgt beispielsweise unter aeroben Bedingungen in einer Oberfl&ehenkultur oder submers unter■'Schütteln oder in Fermentern mit Begasung durch Luft oder Sauerstoff unter Rühren. Die 3ebrütungsteffiperatur kann zwischen 20 und jJ3°C betragen. Vorzugsweise liegt die temperatur aber zwischen 20 und 50⁰C bei einem pH von 5 bis 7, wobei die Kultur währ end h- bis 10 Tsgen inkubiert wird*

Zur Isolierung der neuen Verbindung hat sich insbesondere die Extraktion des Kulturfiltrates mit Aethylenchlorid-und

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IO I /OU I

des Kycels nit Methanol bewährt, jedoch können auch andere ■ organische Lösungsmittel, wie.z.B. Benzol, Sssigester,' Butylacetat oder Chloroform, reap. Aceton verwendet wer der;· Anschliessend werden die Extrakte konzentriert und die Aktivsubstanz- wird mit Wasser vom pH 8-10 extrahiert. Die alkalischen Phasen werden.'angesäuert (pH 2-5) und mit einem organischen Lösungsmittel, wie z.B. Essigester, extrahiert. Befreiung dieser Extrakte vom Lösungsmittel gibt das rohe Antibioticum, das auf chromatcgraphischem Wege an adsorbierenden Mitteln, wie aktivierte Tonerde, Kieseigel, «Ionenaustauscher und dgl., mittels Gegenstromverteilung oder durch Fällung weiter gereinigt.werden kann. Das neue Antibioticum SL 22ββ kann wie folgt charakterisiert ν; er den: . _:

SL 2266 ist eine amorphe, farblose Saure der Summenformel

21 i

^C27^H40°8 "¹^ ^{üer s}P^eziiiscllen Drehung [α]^ = -45° (c «

0,57 in Methanol). .

UV·-Spektrum; Schulter bei JOO m^JL(logS= 1,84) (in Methanol)

. (Pig. 1)
IR.-Spektrum: u.a. Banden bei 3550, 2950, 1710, 1460,

1310,- 1170, 1090, 1060, 1030, 980, 870 cm"¹ (in GH₂Cl₂) (Pigs 2}
■pas Kalium-Salz von SL 22ββ bildet farblose Kristalle vom

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!Schmelzpunkt 253 - 255° und der spez. Drehung [α L· » -50°

(c = 0,48 in Wasser).

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- 5 - 1 ßi 7301 100-2265

UV.-Spektrum; Maximum bei 295 nyU,-"(log S = 1,78) (in Methanol) (Fig. 2) ' ' ■

IR.- Spektrum:u.a. Banden bei 3450, 2950, I705, 1530,.1470, 1450, 1400, II80, 1090/ 1060, 1025, 1010, 990,^ 795 cm" ^X (1-mg/300 ag KBr) (Pig. 4). ,

Das neue Antibioticum SL 2266 oesitzt eine'sehr hohe fungistatische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen. Erregern' von Pilzinfektionen._ .' ' - ^ Besonders ausgeprägt ist die Aktivität gegen Phycomyceten (Absidia und &hi£ajras), die als Erreger von Kucormykosen beim Menschen und Tier bekannt sind. Koch stärker >irkt die Substanz SL 2266 gegen verschiedene Hefen, die beim Menschen und beim Tier als Erreger der Candidiasis bekannt. sind. Schliesslich wird eine gute Aktivität gegen den Erreger der Histoplasmose beobachtet. . · Verwendet man als Testmethode den Agardiffusions-Lochtest, ergeben sich Hemmzonen-durchmesser von mindestens 20 mm (Lochdurchmesser 7 mm) bei folgenden Substanzmengenj

Organismus: Stamm-Hr * % Beno'ti^ta Substanz-

menF;e, gelöst in 0,1 ml 5 ti Methanol: '.

Absidia cylindrospora

Absidia orchidia S 2381 - 100^g

Rhizcpus oryzae Candida albicans

St	amm-Nr.;
S	740
S	2381
S	3058
3	1254

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; · ' BADORiQiNAL

Organismus: Staraa-IIr.: Benötigte Su'ostcnz-

" mange, gelöst in 0,1

' · · ^ml 5- % Methanol:

Candida tropicalis S 12ρβ 1.Ag

Cryptococcus neoformans S 1258 10O₇Ug

Saccharomyces cerevisiae S 8

Histoplasma capsulatum · S 3095

Testmethodet

In sterile Petrischale» werden 20 ml sterilisiertes, noch 4-5° warmes Nährmedium, enthaltend 2 % Malzextrakt (Schweiz. Ferment AG, Basel), 0,75 % Ioriagar Ko. 2 (Oxoid Div. of Oxo Ltd. London SS 1) und entmineralisiertes Wasser gegossen. Kach Erstarren der Grundschicht werden 5 ml sterilisierte Keimschicht, bestehend aus dem gleichen Medium wie die Grundschicht, der aber nach Abkühlung auf 40° eine Sporensuspension von 10° Sporen des Testpilzes zugegeben worden war, aufgetragen. In-die erstarrten Agarplatten werden unter sterilen Bedingungen Löcher von 7 rom Durchmesser gestanzt und nach Entfernung des ausgestanzten AgarStücks werden die Proben in Mengen von 0,10 ml einpipettiert. Die Testplatten werden anschiiessend bei ' 27-57° iifc Brutschrank während 1-4 Tagen bis zu gutem Wachstum· der Pilze bebrütet. AUs mehreren parallelen Versuchen werden die mittleren Durchmesser der Hemmzonen (=* Wachstumsfreie Zonen) •auslerne ssen. ■■·-..

Das neue Antibiotics SL 2256 zeigt keine schädigende Wirkung auf die Vermeüruns von Bakterien, was seine spezifische Wirkung

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gegen Pilze besonders hervorhebt.

SL 2266 besitzt auch eine starke Hemmwirkung auf die Vermehrung von xumorzellen. Diese Wirkung wird durch die Hemmung der Vermehrung von Tumorzellen (Mäuse-Mastocytom P 815) in vitro bestimmt. Die DE-5O von SL 2266 gegenüber. diesen Zellen ist 0,1/tg/nil. Das Antibioticum SL 2266 zeichnet sieh durch eine geringe Toxizität aus* Die akute Toxizität von SL 2266 bei der weissen Maus hat eine DL-50, die grosser als 250 mg/kg i.V.. oder per os ist. Das erfindungsgersäss hergestellte Antibioticum SL 2266 und seine Salze kann als Arzneimittel allein, und zwar soviohl in reiner liristalliner oder amorpher Form als auch als Rohkonzentrat oder in entsprechenden Arzneiformen für orale, enterale oder parenterale Verabreichung verwendet xirerden. Die Dosierung der verfahrensgemäss hergestellten Verbindung beträgt 50 bis I5ÖO mg pro Tag. -

Zwecks Herstellung geeigneter Ärzneif ormen wird dieses Antibioticum mit anorganischen oder organischen,, pharmakologisch indifferenten Hilfsstoffen verarbeitet. Als Kilfsstoffe werden verviendet z.B.
für Tabletten und Dragees: Milchzucker, Stärke, Talk,

Stearinsäure usw. für Sirupes Rohrzucker-, Invertzucker-,

Glucoselösüngen u.a. für Injekfcionspräparate: V/asser, Alkohole, Glycerin,

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pflanzliche OeIe und dergl.

für Suppositorien; natürliche oder gehärtete OeIe, • . Wachse u.a. mehr.

Zudem können die Zubereitungen geeignete Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmittel, Lösungsvermittler, Süss- und Farbstoffe, Aromantien usw. enthalten.

In den nachfolgenden Beispielen, weiche die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden. Die Schmelzpunkte sind auf dem Kofier-Block bestimmt.

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Beispiel 1: "51-2266 : ^;

In einem Fersienter (Hew Brimsiiiclc Co., USA,,' Typ PS 3 v/erden 10 Liter einer Nährlösung, die pro Liter 20 g Glucosei 2 g Malzextrakt (Schweiz. Ferment AG), 2 g ^: · Peaton, 2 g Bacto-Yeast-Extrakt (Difco), 2SKH₀PO,, 2g

^w ^ enthält, MsSOjJ₁-* 7H₂O und entmineralisiertes Hasser ad 1000 ml/mit einer Sporensuspension von Sordaria araneosa>. Stamm NRRL 3196, angeimpft und unter Belüftung (10 Liter/Min.) und unter Rühren (^00 Umdrehungen/Min.) lH Stunden bei 27°

inkubiert.

Die Kulturbrühe wird filtriert und das Filtrat vom pH 4-6 · mit pmal β Liter.Aethylenchlorid extrahiert* Das Mycel wird mit viermal 5 Liter 90 % Methanol extrahiert, der Extrakt vom Methanol befreit und die wässrige Phase mit fünfmal 0,5 Liter Aethylenchlorid extrahiert« Alle Aethylenchloridextrakte werden vereinigt und im Yakuum auf 1/10 Vol. konzentriert» Das Konzentrat wird mit dreimal 03 Liter kalter 2n"-Natronlauge extrahiert, die vereinigten basischen Auszüge werden bei 0° mit Salzsäure (IjI) auf pH 2-J gebracht und dreimal mit je 1Liter Aethylenchlorid extrahiert. Diese Extrakte werden über.MgSO₁, getroeknst und jjn Vakuum zur Trockne ijebrachti 1,5 g rohss SL δ26β als leicht bräunlicher Schaum! 1,5 g rohes SL ££$6 werdöii m 6ö $ Kißsslg©! chromatographissrt. Bluatiors (pr&ktlonsgrSsse ^O ml) alt Chloroform-5 ♦ 1,5)-gibt:-«us d€«f-?rafcttonen-13-75 $

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nes, farbloses SL 2266.

Beispiel· 2: Kaliunsalz des SL 2266 ■

1,66's SL 2266 werden, in 40 ml Methanol-Wasser (1:1) gelöst und mit" .0,5n KOH bis zum pH 7,0 titriert. Die Lösung wird über eine dünne Schicht Aktivkohle filtriert und im Vakuum zur Trockne gebracht. Kristallisation des Rückstandes aus Sssigester-Methanol gibt farblose .Kristalle des Kaliurasaizes mit Snp. 253-255°·"

Beispiel 3: Natriumsalz des SL 2266

0,50 g SL 2266 v/erden in 50 ml Methanol-Wasser (1:1) gelost und mit' 0,In.NaOH bis zum pH 7*0 titriert. Die Lösung wird über eine dünne .Schicht Aktivkohle filtriert und im Vakuum-, zur Trockne gebracht. Nach Verreiben mit Aether erhält man das Natriumsalz in Form eines farblosen Pulvers.

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Claims

I D I /OU !

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung des neuen Antibioticums SL 2266 mit folgenden Charakteristica: ' Sumrnenforaiel G₂₇

.spez. Drehung: La]^ - -45° (c = 0,57 in Methanol) UV.-Spektrum: Schulter bei 300 cy£(log:£V 1*84) (in Methanol) IR. -Spektrum: u.a. Banden bei 3550, 295O, 1710, ΐ4βθ, 1390,

1310,1170/1090,1060,1030,980,870Cm"¹

und seiner Salze mit geeigneten organischen und anorganischen Basen, dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm NRRL 3196 der Pilzspecies Sordaria araneosa Gain oder seine Kutanten in einer Nährlösung züchtet und hierauf das Antibioticum SL 2266 nach an sich bekannten Methoden aus der Nährlösung isoliert und gegebenenfalls durch Reaktion mit geeigneteij organischen und anorganischen Basen in seine Salze überführt. . .; ■

2» Verfahren zur Darstellung des Kaliumsalzes des neuen Antibioticums SL 2266 mit folgender Charakteristica:

spez. Drehung: Ca]^⁰ = -50° (c = 0,48 in VJasser)

UV.-Spektrum: Maximum bei 295. m/^(log£= 1*78) (in Methanol) IR.-Spektrum: u.a. Banden bei 3^50, 2950, 1705, .I58O, 1470,

1450, 1400, !ISO, 1090, 1060, 1025, 1010, 990,

795 cm"¹ (1 mg/300 mg KBr)

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nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Antibioticum SL2266 mit Kaliumhydroxid umsetzt.

3. Verfahren zur Darstellung des Natriumsalzes des neuen Antibioticums SL 2266 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Antibioticum SL 2266 mit Natriumhydroxid umsetzt.

4. Das neue Antibioticum SL 2266, gekennzeichnet durch die im Anspruch 1 angegebenen Daten, und seine Salze mit organischen und anorganischen Basen.

5. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, dass es das neue Antibioticum SL 2266, gekennzeichnet durch die im Anspruch 1 angegebenen Daten, enthält.

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