DE3243924C2

DE3243924C2 -

Info

Publication number: DE3243924C2
Application number: DE3243924A
Authority: DE
Inventors: Noboru Yokohama Kanagawa Jp Otake; Haruo Hachioji Tokio/Tokyo Jp Seto; Tetsuo Kounosu Saitama Jp Sasaki; Masanori Sakado Saitama Jp Sugita; Yohei Tokio/Tokyo Jp Natori; Noriyoshi Kawagoe Saitama Jp Sueda
Original assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Current assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Priority date: 1981-11-27
Filing date: 1982-11-26
Publication date: 1992-07-09
Also published as: GB2112776A; GB2112776B; DE3243924A1; US4521339A

Description

Die Erfindung betrifft dem Mycotrienin verwandte Ver bindungen mit neuen chemischen Strukturen, diese enthaltende Arzneimittel, sowie Verfahren zur Herstellung von dem Mycotrienin verwandten Verbindungen.

Im Verlauf der Prüfung von Antitumorsubstanzen wurde gefunden, daß ein bestimmter neuer Mikroorganismus, der Streptomyces rishiriensis angehört, der im fol genden als Stamm "Streptomyces rishiriensis T-23" be zeichnet wird, zwei ineinander umwandelbare Metabolite erzeugen kann, wobei diese Metabolite wirksam bei der Inhibierung des Wachstums von L-5178Y Lymphom-Zellen sind. Diese Metabolite werden hier als Substanz T-23-I und Substanz T-23-II bezeichnet. Im Verlauf der Unter suchungen, die zur vorliegenden Erfindung geführt haben, konnten die chemischen Strukturen nachgewiesen werden, und es wurde darüber hinaus gefunden, daß die Substanzen T-23-I und -II in ihre beiden Analogen die Substanzen T-23-III und T-23-IV umgewandelt werden können.

Die Substanz T-23-II wurde bereits gemäß Journal of Antibiotics 20, S. 329 (1967) isoliert und später gemäß Journal of Antibiotics 35, S. 1460 und 1467 (1982) identifiziert.

Das folgende Schema veranschaulicht die wechselseitige Beziehung der Substanzen T-23-I, T-23-II, T-23-III und T-23-IV bei der chemischen Umwandlung

Die unterbrochene Linie bedeutet einen biologischen Weg, während die durchgezogenen Linien chemische Wege zeigen. Die Strukturformeln der Substanzen T-23-I, -II, -III und -IV werden später angegeben.

Gegenstand der Erfindung sind somit die Verbindungen der allgemeinen Formel I

worin R Wasserstoff (Substanz T-23-III) oder eine Gruppe

(Substanz T-23-I), sowie der Formel II

worin R Wasserstoff ist (Substanz T-23-IV).

Die Substanzen T-23-I und -II können erhalten werden durch Kultivieren eines neuen Stammes Streptomyces rishiriensis T-23, der hinterlegt wurde beim "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, MIT (Japan)" unter der Hinterlegungsnummer FERM P-6141 (FERM BP-243). Gegenstand der Erfindung sind daher auch das im Anspruch 3 beschriebene Verfahren zur Herstellung der Substanz T-23-I und der Substanz T-23-II, und das im Anspruch 4 beschriebene Verfahren zur Herstellung der Substanz T-23-III und der Substanz T-23-IV.

Die mykologischen und anderen Charakteristika des Stammes Streptomyces rishiriensis T-23 werden nachstehend angegeben:

a) Morphologische Eigenschaften

Das vegetative Mycel des Stammes T-23 entwickelt sich gut ohne Fragmentierung auf den meisten ver wendeten Lösungen. Das Luftmycel verzweigt sich monopodisch mit kurzen Sporophoren, die Sporen ketten mit 10 bis 50 oder manchmal mehr als 50 Sporen pro Kette bilden. Die Sporenketten sind gewöhnlich lose Spiralen (Spira), und Ketten mit endständigen Haken oder Schlaufen und einfache Spiralen (Rectus Flexibilis) sind ebenfalls üblich (Platte 1). Die Sporen sind oval bis zylindrisch (1,0-1,5 · 0,5-0,7 mn, bzw. mµ) mit einer glatten Oberfläche unter dem Elektronenmikroskop (Platte 2). Sporangien, motile Sporen, Sclerotia und eine andere spezielle Morpho logie wurden nicht festgelegt.

b) Kultureigenschaften

Die Kultureigenschaften des Stammes T-23, gezüchtet auf verschiedenen Medien bei 27°C während 2 bis 3 Wochen sind nachstehend angegeben. Die Untersuchung erfolgte nach den in "Methods Manual 1941" der International Streptomyces Projects beschriebenen Methoden.

c) Physiologische Eigenschaften
Wachstums-Temperatur\|10-37°C
Temperatur für optimales Wachstum	20-30°C
Verflüssigung von Gelatine	+ (positiv)
Hydrolyse von Stärke	+
Coagulation von nichtfetter Milch	- (negativ)
Peptonisierung von nichtfetter Milch	+
Bindung von Melanoidpigmenten	+
Tyrosin-Agar	+
Pepton-Hefeextrakt-Agar	+
Trypton-Hefeextrakt-Brühe	+

d) Verwertung von Kohlenstoffquellen (Pridham-Gottlieb′s Agarmedium)
L-Arabinose
++ (gutes Wachstum)
D-Xylose	++
D-Glucose	++
D-Fructose	+ (schlechtes Wachstum)
Saccharose	++
Inosit	++
L-Rhamnose	++
Raffinose	++
D-Mannit	- (kein Wachstum)

Diese Eigenschaften des Stammes konnten wie folgt summarisiert werden: die Farbe der Luftmasse ist graue Farbreihen, bräunlichgrau oder rötlichgrau bis dunkelpurpurgrau; die Rückseite der Kolonie zeigt keine unterscheidbaren Pigmente, bräunlichweiß bis hellgelb auf synthetischen Medien und blaßgelblich- braun auf organischen Medien; Melanoidpigmente werden auf ISP-Testmedien gebildet und andere lösliche Pig mente werden in den meisten Medien nicht gefunden; der Stamm ist mesophil und besitzt diastatische und proteolytische Natur; und sämtliche untersuchte Zucker mit Ausnahme von D-Mannit werden für das Wachstum als Kohlenstoffquellen verwertet.

Zieht man diese Merkmale in Betracht, so wird der Stamm T-23 als zugehörig zum Genus Streptomyces er kannt. Unter den Spezies von Streptomyces, die in der 8. Auflage von Bergey′s Manual beschrieben werden, gleicht der Stamm T-23 sehr S. rishiriensis. Die Eigen schaften des Stammes werden mit denen von S. rishirien sis verglichen, und man erzielt eine gute Überein stimmung mit Ausnahme der löslichen Pigmente und orga nischen Agarmedien. Daher wird der Stamm T-23 als Stamm von S. rishiriensis identifiziert.

Zur Erzeugung der Substanzen T-23-I und -II erfolgt die Fermentation des vorstehend erwähnten Stammes Streptomyces T-23 nach der Methode zur Fermentation jeglichen Actinomyces-Stammes. Als Kohlenstoffquelle sind Saccharide, wie Glucose, Lactose und Fructose, Stärke und Stärkehydrolysate allein oder in Kombina tion verwendbar. Das Gemisch von Stärke und Glucose ist bevorzugt. Als Stickstoffquelle sind Fleisch extrakt, Polypepton, Sojamehl, Maisquellflüssigkeit und verschiedene anorganische Stickstoffquellen brauchbar. Um die fermentative Produktion zu erleich tern, können einige Zusätze, d. h. trockene Hefe, Maltoseextrakt und andere verschiedene Pflanzensamen extrakte, Vitamine und verschiedene anorganische Salze zugesetzt werden. Falls notwendig, kann ein Antischaum mittel, wie Siliconöl, pflanzliches Öl usw. zugesetzt werden. Die Kultur des Stammes kann unter Verwendung eines Kolbens, eines Rüttel-Fermentors oder eines Fermentationsbehälters größeren Maßstabs durchgeführt werden. Die Kulturtemperatur liegt bei 20 bis 35°C und vorzugsweise bei 25 bis 30°C und es wird ein Submers- Kultursystem verwendet. Die Zeit für das Kultivieren beträgt 17 bis 96 h und das Maximum der Produktion der Substanzen T-23-I und -II erzielt man bei etwa 24 h nach dem Initiieren der Kultur.

Die Substanzen T-23-I und -II sind in Wasser unlöslich und löslich in höheren Alkoholen, Aceton, Chloroform, Benzol und Äthylacetat, und daher wird eine geeignete Reinigungsmethode in Abhängigkeit von derartigen Löslichkeitsmerkmalen gewählt.

Ein Beispiel wird nachstehend zur Veranschaulichung der Gewinnung der Substanzen T-23-I und -II angegeben.

Die Substanzen T-23-I und -II werden hauptsächlich in den Mycelien akkumuliert, wobei ein gewisses Ausmaß auch in einer überstehenden Flüssigkeit vorhanden ist. Nach dem Kultivieren wurde die Kulturbrühe bald ge kühlt und anschließend durch Zentrifugieren oder Fil trieren in Mycelien und überstehende Flüssigkeit auf geteilt. Die Mycelien wurden mit 60-70% wäßrigem Aceton behandelt. Der Extrakt, der die aktive Fraktion enthielt, wurde filtriert. Das Filtrat wurde durch ein nichtionisches Austauscherharz geleitet, um die Ab sorption der aktiven Fraktion darauf zu bewirken, und dann wurde der aktive Teil mit einem organischen Lösungs mittel, wie einem niedrigen Alkohol oder Aceton oder einer wäßrigen Lösung, die solche organische Lösungs mittel enthielt, eluiert. Alternativ ist es auch mög lich, den aktiven Teil mit einem organischen Lösungs mittel direkt von dem Filtrat zu extrahieren.

Der aktive Anteil, der direkt von der überstehenden Flüssigkeit erhalten wurde, wurde mit einem Mycelien extrakt kombiniert. Das erhaltene Gemisch wurde auf einen pH-Wert von 5,0 bis 6,0 eingestellt und das or ganische Lösungsmittel, das vorhanden war, wurde unter verringertem Druck verdampft. Die aktive Substanz wurde von der wäßrigen Phase mit einem mit Wasser nicht- mischbaren Lösungsmittel, wie Chloroform, Äthylacetat oder Isopropylalkohol in Abwesenheit oder Anwesenheit eines industriell brauchbaren anorganischen Salzes, wie Natriumchlorid, extrahiert, um die Wirksamkeit der Extraktion zu verbessern. Der erhaltene Extrakt wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat versetzt, zur Entwässerung eine Weile stehengelassen und anschließend unter verringertem Druck konzentriert. Anschließend wurde der erhaltene Rückstand mit Petroläther oder Hexan versetzt, um eine Ausfällung eines physiologisch aktiven Produkts zu bewirken, von dem es sich zeigte, daß es aus den Substanzen T-23-I und -II bestand. Diese Substanzen wurden darüber hinaus durch Chromatographie getrennt, unter Verwendung von Kieselsäure, nicht ionischem Austauscherharz, Cephadex LH-20 usw. Im folgenden wird ein Beispiel für das Herstellungsver fahren von hochgereinigten Substanzen T-23-I und/oder T-23-II mittels Flüssigkeitschromatographie angegeben.

Kieselsäure wurde mit Hilfe von Benzol in eine Säule gefüllt, worauf dann eine Probe, die sowohl die Sub stanzen T-23-I als auch -II enthielt, aufgetragen wurde. Die zuerst durch Leiten von Benzol durch die Säule eluierte Fraktion wurde verworfen. Anschließend wurde die Substanz T-23-I mit einem gemischten Lösungs mittel aus Benzol/Aceton (4 : 1) eluiert. Die erhaltenen aktiven Fraktionen wurden unter verringertem Druck konzentriert, und ein nichtpolares Lösungsmittel, wie Petroläther oder Hexan, wurde zugesetzt, um die Substanz T-23-I zu kristallisieren. Die so erhaltene Substanz T-23-I kann gegebenenfalls weiter durch Chromatographie oder Umkristallisieren gereinigt werden, unter Bildung der hochgereinigten Substanz T-23-I. Die Substanz T-23-II wurde eluiert durch Leiten eines gemischten Lösungsmittels von Benzol/Aceton (7 : 3) durch diese Säule. Die hochgereinigte Substanz T-23-II wurde in gleicher Weise, wie die Substanz T-23-I er halten.

Darüber hinaus sei festgestellt, daß die Substanzen T-23-I und -II chemisch ineinander umwandelbar sind. Durch Reduktion mit Na₂S₂O₄ beispielsweise kann die Substanz T-23-I leicht in die Substanz T-23-II umge wandelt werden und die umgekehrte Reaktion kann durch Oxidation mit Luft oder FeCl₃ erzielt werden.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Sub stanzen T-23-I und -II sind im nachfolgenden aufge führt.

Substanz T-23-I

(1) Aussehen: amorphes gelbes Pulver
(2) Strukturformel:

(3) =+91,8 (CHCl₃, C=1,0%)
(4) Schmp. 117°C (Zers.)
(5) Elementaranalyse für C₃₆H₄₈N₂O₈:
berechnet:
C 67,92; H 7,55; N 4,40; O 20,13%;
gefunden:
C 67,72; H 7,68; N 4,28; O 19,74%.
(6) UV Absorption:

λ_max
molare Extinktion
262 nm
ε=38 500
272 nm	ε=49 600
282 nm	ε=38 800
383 nm	ε=3400

(7) IR Absorption (vgl. Fig. 1)
3330 cm^-1
1730 cm^-1
1650 cm^-1
1535 cm^-1
1460 cm^-1
1376 cm^-1
1300 cm^-1
1202 cm^-1
1100 cm^-1
998 cm^-1
849 cm^-1
720 cm^-1
(8) ¹³C-NMR (in CDCl₃)

(9) PMR (in CDCl₃)

(10) Farbreaktion:
Nihydrin (-)
Biuret (-)
Anthron (-)
Fehling (+)
(11) Löslichkeit in Lösungsmitteln:
löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Chloroform und Äthylacetat, kaum löslich in Benzol und Äther, unlöslich in Wasser, Petroläther und Hexan
(12) Cyclohexylalanin als esterbildende Komponente in 11-Stellung befindet sich in der D-Form.

Substanz T-23-II

(1) Aussehen: amorphes, weißes Pulver
(2) Struturformel:

(3) =+288° (c=1,0% in CH₃OH)
(4) Fp. 151°C (Zers.)
(5) Elementaranalyse für C₃₆H₅₀N₂O₈:
berechnet:
C 67,72; H 7,68; N 4,28; O 20,32%;
gefunden:
C 67,92; H 7,55; N 4,40; O 20,13%.
(6) UV Absorption:

λ_max
molare Extinktion
260 nm
ε=40 800
270 nm	ε=52 300
280 nm	ε=40 500
310 nm	ε=5900

(7) IR Absorption (vgl. Fig. 2)
3340 (NH, OH),
1730, 1200 (Ester),
1650, 1535 (Amid)
(8) ¹³C-NMR (in CDCl₃)

(9) PMR (in d-Pyridin)

(10) Farbreaktion:
Ninhydrin (-)
Biuret (-)
Anthron (-)
Fehling (+)
(11) Löslichkeit in Lösungsmitteln:
löslich in Chloroform, Methanol, Äthanol, Aceton und Äthylacetat, kaum löslich in Benzol und Äther, unlöslich in Wasser, Petroläther und Hexan.
(12) Cyclohexylalanin als esterbildende Komponente in der 11-Stellung liegt in D-Form vor.

Die Substanzen T-23-III und -IV können erhalten werden durch Entfernen der Seitenketten, die einen Cyclohexan ring umfaßt, an dem Kohlenstoffatom in 11-Stellung durch Reduktion. Eine derartige Reduktion kann als katalytische Hydrierung unter Verwendung von Lithium aluminiumhydrid oder Platin-Kohlenstoff in üblicher Weise durchgeführt werden.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Substan zen T-23-III und -IV, die so erhalten wurden, sind nachstehend aufgeführt:

Substanz T-23-III

(1) Aussehen: gelblichorange-farbiges amorphes Pulver
(2) Strukturformel (MG 455)

(3) =+4,3° (c=1% in MeOH)
(4) Fp. 94-95°C
(5) Elementaranalyse für C₃₆H₃₃NO₆:
berechnet:
C 68,27; H 7,66; N 3,06; O 21,01%;
gefunden:
C 67,76; H 7,67; N 3,06; O 21,01%.
(6) UV Absorption (in MeOH):

λ_max
molare Extinktion
261 nm
ε=33 800
271 nm	ε=43 300
282 nm	ε=33 500
386 nm	ε=1400

(7) IR Absorption (in CHCl₃)
3340, 2910, 1703, 1668, 1650,
1633, 1612, 1503, 1452, 1380,
1300, 1190, 1164, 1135, 1094,
1040, 1003 and 913 cm^-1
(8) ¹³C-NMR (in CDCl₃)

(9) PMR
vgl. die beigefügte Fig. 3.
(10) Löslichkeit in Lösungsmitteln:
löslich in Chloroform, Äthylacetat, Methanol, Äthanol, Aceton, Acetonitril, Benzol und Toluol, kaum löslich in Äthyläther, unlöslich in Petroläther und Wasser.

Substanz T-23-IV

(1) Aussehen: gräulich-weiß farbiges amorphes Pulver
(2) Strukturformel (MG 457)

(3) =+273° (c=1% in MeOH)
(4) Fp. 130-132°C
(5) Elementaranalyse für C₃₆H₃₅NO₆:
berechnet:
C 68,27; H 7,66; N 3,06; O 21,01%;
gefunden:
C 67,76; H 7,67; N 3,07; O 21,50%.
(6) UV Absorption (in MeOH):

λ_max
molare Extinktion
263 nm
ε=30 800
273 nm	ε=39 800
282 nm	ε=30 600
307 nm	ε=3300

(7) IR Absorption (KBr Scheibe)
3340, 2920, 1645, 1540, 1462,
1378, 1300, 1224, 1195, 1145,
1090, 1000 and 854 cm^-1
(8) ¹³C-NMR (in d-Pyridin)

(9) PMR
vgl. beigefügte Fig. 4
(10) Löslichkeit in Lösungsmitteln:
löslich in Chloroform, Äthylacetat, Methanol, Äthanol, Aceton und Acetonitril, kaum löslich in Benzol und Toluol, unlöslich in Petroläther und Wasser.

Die Substanzen T-23-I, -II, -III und -IV sind brauchbar als Antitumormittel, da sie wirksam bei der Inhibierung des Wachstums verschiedneer Arten von Tumor zellen sind. Darüberhinaus sind die Substanzen T-23-III und -IV brauchbar als Zwischenprodukte zur Herstellung neuer Verbindungen durch Einführung verschiedener Substituenten in die 11-Hydroxylgruppe der Substanzen T-23-III oder -IV.

Die physiologischen Eigenschaften jeder der Substanzen T-23-I, -II, -III und -IV sind nachstehend aufgeführt:

Substanz T-23-I

(1) Antimikrobielle Wirkung gegen Hefen und Fungi

Test-Mikroorganismus
MIC (µg/ml)
Aspergillus japonicus (IAM 2016)
12,5
Mucor pusillus (IAM 6122)	12,5
Penicillium chrysogenum (IAM 7106)	8,0
Saccharomyces cerevisiae (IFO 0304)	4,0
Saccharomyces rouxii (IFO 0505)	4,0
Candida utilis (IFO 0396)	4,0

Der Wert der MIC (minimale inhibitorische Konzen tration) der Substanz T-23-I wurde bestimmt durch Kultivieren eines Mikroorganismus in einem Medium, das 1,0% Glucose und 0,2% Malzextrakt enthielt, bei 30°C während 72 h nach einer Verdünnungsmethode.
(2) Antitumorwirksamkeit (in vitro) gegen L-5178Y- Lymphomzellen

Konzentration (µg/ml)
Zustand des Zellwachstums
4,0
-
2,0	-
1,0	-
0,5	-
0,25	±
0,125	+

Das durch eine Verdünnungsmethode festgestellte Zellwachstum unter Verwendung eines Eagle-NEM- Mediums (Nissui) ergänzt mit 10% Pferdeserum und 100 mg/l Asparagin und kultiviert bei 37°C während 120 h. Die Substanz T-23-I in äthanolischer Lösung wurde einem Assay-System zugesetzt.
(3) Antitumorwirkung gegen die Leukämie P-388 der Maus

Dosierung
erhöhte Lebensspanne T/C (%)
24 mg/kg/Tag×2 mal
56,0
12 mg/kg/Tag×2 mal	123,3
6 mg/kg/Tag×2 mal	120,2
3 mg/kg/Tag×2 mal	105,7
1,5 mg/kg/Tag×2 mal	107,3
0,75 mg/kg/Tag×2 mal	105,7
0 mg/kg/Tag×2 mal	100

6 männlichen CDF₁-Mäusen (20±g) einer Gruppe wurden 10⁶ Ascites-Tumor P-388 Zellen intraperito neal transplantiert. Das Testmaterial wurde zuerst 24 h und anschließend 120 h nach der Transplantation verabreicht. Die Dosis des in Gummiarabikum suspen dierten Testmaterials betrug jedesmal 0,2 ml. Die Lebensspanne wurde als Prozent der Lebensspanne der Kontrollgruppe ausgedrückt (der eine Gummiarabikum suspension verabreicht wurde).
(4) Akute Toxizität:
LD₅₀ (Maus, i. p.) 55,9 mg/kg

Substanz T-23-II

(1) Antimikrobielle Wirkung gegen Hefen und Fungi

Test-Mikroorganismus
MIC (µg/ml)
Aspergillum japonicus (IAM 2016)
12,5
Mucor pusillus (IAM 6122)	12,5
Penicillium chrysogenum (IAM 7106)	12,5
Saccharomyces cerevisiae (IFO 0304)	4,0
Saccharomyces rouxii (IFO 0505)	4,0
Candida utilis (IFO 0396)	4,0

Der Wert der MIC (minimale inhibitorische Konzen tration) der Substanz T-23-II wurde bestimmt durch Kultivieren eines Mikroorganismus in einem Medium, das 1,0% Glucose und 0,2% Malzextrakt enthielt, bei 30°C während 72 h nach einem Verdünnungsverfahren.
(2) Antitumorwirkung (in vitro) gegen L-5178 Y Lyphomzellen

Konzentration (µg/ml)
Zustand des Zellwachstums
4,0
-
2,0	-
1,0	-
0,5	-
0,25	-
0,125	+

Das Zellwachstum wurde mittels einer Verdünnungs methode beobachtet, unter Verwendung eines Eagle-NEM- Mediums (Nissui), ergänzt mit 10% Pferdeserum und 100 mg/l Asparagin und kultiviert bei 37°C während 120 h. Die Substanz T-23-II in Äthanollösung wurde einem Assay-System zugesetzt.
(3) Antitumorwirkung gegen das Sarcom 180 der Maus

Dosierung
erhöhte Lebensspanne T/C (%)
20 mg/kg/Tag×4 mal
138,7
6,6 mg/kg/Tag×4 mal	115,0
2,2 mg/kg/Tag×4 mal	95,6
0,7 mg/kg/Tag×4 mal	109,6
0 mg/kg/Tag×4 mal	100

6 männlichen ICR-Mäusen (25±1 g) einer Gruppe wurden 10⁶ Sarcom 180 Acites Tumorzellen intraperi toneal transplantiert. Das Testmaterial wurde zuerst 3 h nach der Transplantation und dann 4 mal alle 24 h verabreicht. Die Dosierung des Testmaterials (Substanz T-23-II), suspendiert in Gummiarabikum, betrug jedesmal 0,2 ml. Die erhöhte Lebensspanne wurde ausgedrückt als % der Lebensspanne der Kontrollgruppe (der eine Gummiarabikumsuspension verabreicht wurde).
(4) Antitumor-Aktivität gegen Leukämie P-388 der Maus

Dosierung
erhöhte Lebensspanne T/C (%)
20 mg/kg/Tag×6 mal
135,7
10 mg/kg/Tag×6 mal	120,2
5 mg/kg/Tag×6 mal	127,1
2,5 mg/kg/Tag×6 mal	109,9
1,25 mg/kg/Tag×6 mal	130,0
0 mg/kg/Tag×6 mal	100,0

6 männlichen CDF₁-Mäusen (20±1 g) einer Gruppe wurden 10⁶ Ascites-Tumor-P-388-Zellen intraperito neal transplantiert. Das Testmaterial wurde zuerst 24 h nach der Transplantation und anschließend 6 mal alle 24 h verabreicht. Die Dosis des Testmaterials, suspendiert in Gummiarabikum, betrug jeweils 0,2 ml. Die erhöhte Lebensspanne wurde als % der Lebens spanne der Kontrollgruppe (der eine Gummiarabikum suspension verabreicht wurde) ausgedrückt.
(5) Akute Toxizität
LD₅₀ (Maus i. p.) 85,5 mg/kg

Substanz T-23-III

(1) Antitumorwirkung gegen P-388-Ascites-Tumorzellen

Das Zellwachstum der P-388-Ascites-Tumorzellen, aufrechterhalten in dem Abdominalraum von CDF₁- Mäusen wurde nach einer Verdünnungsmethode beobach tet, unter Anwendung der Kultur mit einer Serie von RPMI-1640-Medien, supplementiert mit 10% Rinder kälberserum und 10 µMol 2-Hydroxyäthyl-disulfid während 96 h. Die Festgestellte Inhibierung des Zellwachstums ist im folgenden aufgeführt:

Konzentration (µg/ml)
Inhibierung des Zellwachstums
20
+
10	+
5	+
2,5	+
1,25	±
0,6	-
0,3	-
0,15	-

(2) Akute Toxizität
LD₅₀ (Maus, i. p.) etwa 250 mg/kg

Substanz T-23-IV

(1) Antitumorwirkung gegen P-388-Ascites-Tumorzellen

Das Zellwachstum der P-388-Ascites-Tumorzellen, aufrechterhalten in dem Abdominalraum von CDF₁- Mäusen wurde nach einer Verdünungsmethode beobach tet, unter Anwendung der Kultur in einer Serie von RPMI-1640-Medien, ergänzt mit 10% Rinderkälber serum und 10 µMol 2-Hydroxyäthyl-disulfid, während 96 h. Die festgestellte Inhibierung des Zell wachstums ist im folgenden aufgeführt.

Konzentration (µg/ml)
Inhibierung des Zellwachstums
20
+
10	+
5	+
2,5	+
1,25	+
0,6	±
0,3	-
0,15	-

(2) Akute Toxizität
LD₅₀ (Maus, i. p.) etwa 280 mg/kg

Einen weiteren Gegenstand der Erfindung bilden Arzneimittel, die eine der Substanzen T-23-I, -III und IV als aktiven Bestandteil zusammen mit üblichen Trägern und Verdünnungsmitteln enthalten. Die therapeutischen Mittel oder Formulierungen werden in üblicher Weise her gestellt durch Compoundieren einer geeigneten Dosis mit den üblichen flüssigen Trägern und den üblichen pharmazeutischen Hilfsstoffen für die gewünschte par enterale Verabreichung. Geeignete Träger können physio logische Salzlösung und physiologisch verträgliche Polyäthylenglykole sein, und geeignete Hilfsstoffe können Tween-80 usw. umfassen, so daß eine Lösung oder Suspension gebildet wird. Als Einzeldosierungen der aktiven Substanz können 1-50 mg/kg, vorzugsweise 2-15 mg/kg täglich in Betracht kommen.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Der Stamm von Streptomyces T-23 wurde als Schrägkultur, die 1,0% lösliche Stärke, 0,2% Hefeextrakt und 1,5% Agar enthielt, gelagert. Die Sporen des Organismus einer gut gewachsenen Agar-Schrägkultur wurden asep tisch in ein Inoculum-Kulturmedium (das 1,0% lösliche Stärke, 1,0% Melassen, 1,0% Fleischextrakt und 1,0% Polypepton enthielt, eingestellt auf den pH-Wert 7,0) in einen 500 ml Erlenmayer-Kolben inokuliert. Der Kol ben wurde auf einem Rotationsschüttler 48 h bei 30°C inkubiert. Die resultierende Kultursaat wurde in je weils 0,5 ml Teile auf eine Anzahl von Erlenmayer- Kolben aufgeteilt, die jeweils 100 ml des gleichen Kulturmediums wie vorstehend enthielten. Die Kultur wurde durchgeführt unter Schütteln bei 30°C bei 24 h, wobei ein Saat-Inoculum für die Produktionskultur unter Verwendung eines Rüttelfermentors erzielt wurde. Zur Herstellung der Kultur wurden 6 Rüttelfermentoren mit einem Fassungsvermögen von 30 l, verwendet, die jeweils 15,0 l eines Mediums (pH 7,0) enthielten, das 1,0% Glucose, 1,5% lösliche Stärke, 1,5% Sojamehl, 0,2% getrocknete Hefe, 0,2% Ammoniumsulfat, 0,5% Natrium chlorid, 0,4% ausgefälltes Calciumcarbonat und 0,33% Antischaummittel (Toshiba "Silicone" AMA 6509) enthielt. Das erhaltene Inoculum wurde in jeden der Fermentoren gegeben und die Kultur unter Belüften und Rühren (15,0 l/min, 200 UpM) wurde 24 h bei 30°C durchgeführt.

Nach beendeter Kultur wurde die Kulturbrühe mit 4,0 n Schwefelsäure auf den pH-Wert 5,8 eingestellt. Das Mycel wurde durch eine Zentrifugenvorrichtung ge wonnen, in 20 ml 60% wäßriges Aceton unter Rühren während kurzer Zeit getaucht und anschließend stehen gelassen. Anschließend wurde das gesamte Gemisch fil triert zur Entfernung des ungelösten Rückstands, und die überstehende Flüssigkeit (Extrakt) wurde gewonnen. Die gleiche Verfahrensweise wurde zweimal wiederholt. Die vereinten Extrakte ergaben 40 ml. Hieraus wurde das Aceton unter verringertem Druck verdampft, wobei 18,0 l einer wäßrigen Lösung zurückblieben. Zu die ser Lösung (18,0 l) wurden 6,5 kg Natriumchlorid ge fügt, und die resultierende Lösung wurde zweimal mit je weils 9,0 l Äthylacetat extrahiert. Die erhaltene Äthylacetatlösung wurde mit 1,0% Na₂SO₄ versetzt und anschließend ruhengehalten. Nach dem Entwässern wurde die Lösung auf ein geringes Volumen unter verringer tem Druck konzentriert. Zu der konzentrierten Flüssig keit wurde ein adäquates Volumen an Hexan gefügt, wo durch eine rohe Ausfällung erhalten wurde, die die Substanzen T-23-I und -II enthielt. Die so erhaltene Ausfällung wurde mit Hexan gewaschen und anschließend im Vakuum getrocknet, unter Bildung von 42 g eines rohen Gemischs der Substanzen T-23-I und -II. Das so erhaltene rohe Pulver wurde in 100 ml Chloroform gelöst, und die resultierende Lösung wurde einer Säulen chromatographie an Kieselsäure (gefüllt mit 400 g Sili ciumdioxidgel) unterzogen. Es wurde mit Benzol eluiert, gefolgt von einem Gemisch von Benzol/Aceton (4 : 1), um die Fraktionierung der Substanz T-23-I von Verunrei nigungen zu erzielen. Durch weitere Anwendung von Benzol/ Aceton (7 : 3) wurde die Substanz T-23-II nach einander eluiert. Die Anteile, die jeweils die Substanzen T-23-I und -II enthielten, wurden einzeln unter verringertem Druck konzentriert. Diese konzentrierten Anteile wurden einzeln mit einem adäquaten Volumen an Hexan ver setzt. Der kristalline Feststoff der Substanz T-23-I, der erhalten wurde, betrug 1,5 g und der der Substanz T-23-II 11,7 g.

Beispiel 2

Es wurde der Stamm Streptomyces T-23 wie im Beispiel 1 kultiviert. Die resultierende Kulturbrühe wurde zur Erzielung einer überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. 10,0 l dieser überstehenden Flüssigkeit wurden durch eine Säule geleitet, die mit einem nichtionischen Austauscherharz HP-20 gefüllt war, und die Säule wurde mit Wasser gewaschen. Die Fraktionen, die die Substanzen T-23-I und -II enthielten, wurden mit 2,0 l 50% wäßrigem Aceton eluiert. Das Aceton wurde im Vakuum verdampft, unter Erzielung einer wäßrigen Lösung, die anschließend zweimal mit Äthylacetat extrahiert wurde. Der so erhaltene Extrakt wurde mit wasserfreiem Na₂SO₄ versetzt und eine Weile ruhig gehalten. Der Extrakt wurde im Vakuum konzentriert, unter Bildung von 2,0 g eines dunkelbraunen Öls. Das so erhaltene Öl wurde in 10 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wurde einer Säulenchromatographie an Kiesel säure unterzogen. Es wurde mit Benzol und anschließend mit einem Gemisch von Benzol/Aceton (4 : 1) zur Isolie rung und Reinigung der Substanz T-23-I eluiert. Durch weiteres Eluieren mit Benzol/Aceton (7 : 3) erhielt man die Substanz T-23-II. Die Fraktionen, die jeweils die Substanzen T-23-I bzw. -II enthielten, wurden im Vakuum einzeln konzentriert. Diese Konzentrate wurden einzeln mit Hexan zur Bildung von Ausfällungen versetzt. Die Ausfällungen wurden einzeln gesammelt, mit Hexan ge waschen und dann im Vakuum getrocknet. Die erhaltene rohe Substanz T-23-I betrug 48 mg, und die rohe Substanz T-23-II betrug 0,63 g.

Beispiel 3

Zu 100 ml Methanol mit 0,1 g Eisen-III-chlorid darin gelöst, wurden 1,25 g Substanz T-23-II gelöst unter Rühren unter Eiskühlen gefügt, und anschließend wurde die resultierende Lösung 15 min stehengelassen, worauf im Vakuum konzentriert wurde. Das so erhaltene Reak tionsgemisch wurde mit 100 ml Äthylacetat versetzt, unter Bildung einer Lösung, die durch ein Glasfilter filtriert wurde. Aus dem Filtrat wurde Äthylacetat erneut durch Verdampfen im Vakuum entfernt, wobei man 1,05 g der Substanz T-23-I als gelbes Pulver erhielt.

Beispiel 4

700 mg der Substanz T-23-II wurden in 70 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst unter Erzielung einer Lösung, die auf -15°C gekühlt wurde. Zu der Lösung wurden unter Rühren 150 mg Lithiumaluminiumhydrid (LiAlH₄) in drei Portionen zur Erzielung einer Reaktion gefügt. 200 ml Äthylacetat wurden tropfenweise zugesetzt, und weiter wurden 100 ml 0,1 m Phosphatpufferlösung (pH 6,8) zugefügt. Die Lösungsmittelschicht wurde von der wäß rigen Schicht abgetrennt und anschließend mit wasser freiem Natriumsulfat getrocknet. Die getrocknete resultierende Lösung wurde konzentriert, und das resul tierende Konzentrat wurde anschließend durch Dünn schichtchromatographie unter Verwendung einer Kiesel säureplatte (Merck Art. 5717) und von Benzol/Äthyl acetat (2 : 3) Lösungsmittel behandelt. Nach dem Ent wickeln wurden die gelben Bandteile gesammelt, und es wurde mit Äthylacetat/Methanol eluiert. Das Eluat wurde im Vakuum getrocknet, unter Bildung von 260 mg Substanz T-23-III. Ausbeute 52%.

Beispiel 5

700 mg der Substanz T-23-II wurden in 70 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst, unter Bildung einer Lösung, die auf -15°C gekühlt wurde. Zu der Lösung wurden unter Rühren 150 mg Lithiumaluminiumhydrid (LiAlH₄) in drei Portionen zur Bewirkung der Reaktion gefügt. 200 ml Äthylacetat wurden tropfenweise zugesetzt, und darüber hinaus wurden 100 ml 0,1 m Phosphatpufferlösung (pH 6,8) zugefügt. Die Lösungsmittelschicht wurde von der wäßri gen Schicht abgetrennt und anschließend mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die resultierende trockene Lösung wurde konzentriert. Das erhaltene Konzentrat wurde anschließend durch Dünnschichtchromatographie behandelt, unter Verwendung einer Kieselsäureplatte (Merck Art. 5717) und von Benzol/Äthylacetat (2 : 3) als Lösungsmittel. Nach dem Entwickeln wurden die Banden, die eine blaue Fluores zenz unter einer UV-Lampe ergaben, gesammelt, und es wurde mit Äthylacetat/Methanol eluiert. Das Eluat wurde von Lösungsmittel befreit. 65 mg der Substanz T-23-IV wurden erzielt. Ausbeute 13%.

Beispiel 6

700 mg Substanz T-23-II wurden in 70 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst, unter Erzielung einer Lösung, die auf -15°C gekühlt wurde. Zu der Lösung wurden un ter Rühren 150 mg Lithiumaluminiumhydrid (LiAlH₄) in drei Portionen zur Bewirkung einer Reaktion gefügt. 200 ml Äthylacetat wurden tropfenweise zugesetzt, und 100 ml 0,1 m Phosphatpufferlösung (pH 6,8) wurden ebenfalls zugefügt. Die Lösungsmittelschicht wurde abgetrennt, und anschließend mit wasserfreiem Natrium sulfat getrocknet. Die resultierende trockene Lösung wurde konzentriert. Das erhaltene Konzentrat wurde anschließend durch Dünnschichtchromatographie unter Anwendung einer Kieselsäureplatte (Merck Art. 5717) und eines Benzol/Äthylacetat (2 : 3)-Lösungsmittels be handelt. Nach dem Entwickeln wurden die gelbfarbigen Banden auf der Platte und die Banden, die unter einer UV-Lampe blaue Fluoreszenz emittierten, wurden einzeln gesammelt. Sie wurden einzeln mit Äthylacetat/Methanol eluiert. Das Lösungsmittel wurde aus den einzelnen Eluaten entfernt, wodurch man 260 mg (52%) der Sub stanz T-23-III aus der Fraktion der gelben Bande und 65 mg (13%) der Substanz T-23-IV aus der blau fluoreszierenden Bandenfraktion erhielt.

Claims

1. Verbindung mit der allgemeinen Formel worin R Wasserstoff oder eine Gruppe ist, oder worin R Wasserstoff ist.

2. Verbindung nach Anspruch 1 mit der allgemeinen Formel I, worin R die Bedeutung von hat, und worin R sich in der D-Form befindet.

3. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung mit der Formel und/oder dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces rishiriensis, Stamm FERM P-6141 (FERM BP-243) kultiviert, bis die gewünschte Verbindung in der Kulturbrühe akkumuliert ist.

4. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel und/oder worin R Wasserstoff ist, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces rishiriensis, Stamm FERM P-6141 (FERM BP-243) kultiviert, bis die Hydrochinonverbindung der Formel II, worin R die Bedeutung hat, in der Kulturbrühe akkumuliert ist, und anschließend diese Hydrochinonverbindung unter Bildung der Verbindungen der Formel I und/oder II, worin R Wasserstoff ist, in an sich bekannter Weise reduziert.

5. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel und/oder dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel in an sich bekannter Weise reduziert.

6. Arzneimittel, enthaltend eine Verbindung nach Anspruch I oder II zusammen mit üblichen Hilfs- und Trägerstoffen.