DE3243924A1

DE3243924A1 - Mycotrienin-aehnliche verbindungen, verfahren zu deren herstellung und diese enthaltende arzneimittel

Info

Publication number: DE3243924A1
Application number: DE19823243924
Authority: DE
Inventors: Yohei Tokyo Natori; Noboru Yokohama Kanagawa Otake; Tetsuo Kounosu Saitama Sasaki; Haruo Hachioji Tokyo Seto; Noriyoshi Kawagoe Saitama Sueda; Masanori Sakado Saitama Sugita
Original assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Current assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Priority date: 1981-11-27
Filing date: 1982-11-26
Publication date: 1983-11-10
Also published as: US4521339A; GB2112776B; DE3243924C2; GB2112776A

Description

Die Erfindung betrifft dem Mycotrienin verwandte Verbindungen mit neuen chemischen Strukturen.

Im Verlauf der Prüfung von Antitumorsubstanzen wurde gefunden, daß ein bestimmter neuer Mikroorganismus, der Streptomyces rishiriensis angehört, der im folgenden als Stamm "Streptorayces rishiriensis T-23" bezeichnet wird, zwei ineinander umwandelbare Metabolite erzeugen kann, wobei diese Metabolite wirksam bei der Inhibierung des Wachstums von L-5178Y Lymphom-Zellen sind. Diese Metabolite werden hier als Substanz T-23-I und Substand T-23-II bezeichnet. Im Verlauf der Untersuchungen, die zur vorliegenden Erfindung geführt haben, konnten die chemischen Strukturen nachgewiesen werden, und es wurde darüberhinaus gefunden, daß die Substanzen T-23-I und -II in ihre beiden Analogen die Substanzen

25 T-23-III und T-23-IV umgewandelt werden können.

Das folgende Schema veranschaulicht die wechselseitige Beziehung der Substanzen T-23-I, T-23-II, T-23-III und

T-23-IV bei der chemischen Umwandlung 30

ο ο ·

3243

-5-

Streptomyces rishiriensis T-23

Kultivierung

Γ_ Substanz Τ-23-Ι

Oxidation

Reduktion

Substanz Τ-23-ΙΙ

katalytisch^ Hydrierung (Entfernung der 1!-Seitenkette)

Substanz T-23-III

und

Substanz
T-23-IV

Die unterbrochene Linie bedeutet einen biologischen Weg, während die durchgezogenen Linien chemische Wege zeigen. Die Strukturformeln der Substanzen Τ-23-Ι, -II, -III und -IV werden später angegeben.

Die Substanzen Τ-23-Ι und -II können erhalten werden durch Kultivieren eines neuen Stammes Streptomyces rishiriensis T-23, der hinterlegt wurde beim "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, MIT (Japan)" unter der Hinterlegungsnummer FERM P-6141. Die mykologischen und anderen Charakteristika dieses Stammes werden nachstehend angegeben:

. .::.:..·■ .:. .:. ^:.Λ:Ι. 3243324

— 6~ 1 a) Morphologische Eigenschaften

Das vegetative Mycel des Stammes T-23 entwickelt sich gut ohne Fragmentierung auf den meisten verwendeten Lösungen. Das Luftmycel verzweigt sich monopodisch mit kurzen Sporophoren, die Sporenketten mit 10 bis 50 oder manchmal, mehr als 50 Sporen pro Kette bilden. Die Sporenketten sind gewöhnlich lose Spiralen (Spira), und Ketten mit endständigen Haken oder Schlaufen und einfache Spiralen (Rectus Flexibilis) sind ebenfalls üblich (Platte. 1). Die Sporen sind oval bis zylindrisch (1,0 - 1,5 χ 0,5 - 0,7 mn, bzw. mu) mit einer glatten Oberfläche unter dem Elektronenmikroskop (Platte 2). Sporangien, motile Sporen, Sclerotia und eine andere spezielle Morphologie wurden nicht festgestellt.

b) KuItüreigenschaften i

Die Kultureigenschaften des Stammes T-23, gezüchtet auf verschiedenen Medien bei 27 C während 2 bis 3 Wochen sind nachstehend angegeben. Die Untersuchung erfolgte nach den in "Methods Manual 1941" der International Streptomyces Projects beschriebenen

25 Methoden.

. BAD ORaGiMAL

co ο

to ο

Medium

Wachstum

Saccharose-Nitrat-Agar (Waks Nr. 1) mäßig

Glucose-Asparagin-Agar (Waks Nr. 5) mäßig

Glycerin-Äsparagin-Agar

(ISP Nr. 5) schlecht

anorganisches SaIz-Stärke-Agar (ISP Wr.4) mäßig

Tyrosin-Agar
(ISP Nr. 7)

Nähr-Agar
(Waks Nr. 14)

schlecht

Hefeextrakt-Malzex- mäßig trakt-Agar (ISP Nr. 2)

Hafermehl-Agar
(ISP Nr. 3)

mäßig

Sporulation	Farbe der Kolonie	Rückseite der Kolonie	Farbe im Medium	} > 1 » * )
schlecht	weiß	blaßgelb	keine	» > 1 » Ϊ i I I »*·"'·
mäßig	graue Farbreihen (bräunlichgrau bis rötlichgrau)	bräunlichweiß bis hellgelb	keine	» 3 9
schlecht	weiß bis hellgrau	bräunlich bis blaßgelb	keine	B an » # OJ ρ » * O 9 > 9 » ¹ β ϊ . δ & a » * β 9.
mäßig	graue Farbreihen (rotlichgrau bis purpurgrau)	hellgrau	keine
schlecht	weiß bis gräulich weiß	bräunlichweiß bis blaßgelb	hellbräunlich grau	OO NJ ·
keine	weiß	bräunlichweiß oder blaßgelb bis blaßgelb lich-braun	blaßgelblich- braun	OO
mäßig	graue Farbreihen (rötlichgrau bis dunkelpurpurgrau)	blaßgelborange bis blaßgelb- 1ichbrauη	blaßgelblich- orange	NJ
mäßig	graue Farbreihen (rötlichgrau bis purpurgrau)	blaßgelb bis blaßgelblich- braun	keine oder Spuren von bräunlich

» m «*v

-δ-c) Physiologische Eigenschaften:

Wachsturns-Temperatur 10 - 37 C Temperatur für optimales Wachstum 20 - 30°C

Verflüssigung von Gelatine + (positiv)

Hydrolyse von Stärke +

Coagulation von nichtfetter Milch - (negativ) Peptonisierung von nichtfetter

Milch +

Bindung von Melanoidpigmenten +

JO Tyrosin-Agar +

Pepton-Hefeextrakt-Agar +

Trypton-Hefeextrakt-Brühe +

d) Verwertung von Kohlenstoffquellen (Pridham- I^ Gottlieb's Agarmedium):

L-Arabinose ++ (gutes Wachstum)

D-Xylose ++

D-Glucose ++

D-Fructose + (schlechtes Wachstum)

Saccharose ++

Inosit _a ++

L-Rhamnose ++

Raffiriose ++

D-Mannit - (kein Wachstum)

Diese Eigenschaften des Stammes konnten wie folgt summarisiert werden: die Farbe der Luftmasse ist graue Farbreihen, bräunlichgrau oder rötlichgrau bis dunkelpurpurgrau; die Rückseite der Kolonie zeigt keine unterscheidbaren Pigmente, bräunlichweiß bis hellgelb auf synthetischen Medien und blaßgelblichbraun auf organischen Medien; Melanoidpigmente werden auf ISP-Testmedien gebildet und andere lösliche Pigmente werden in den meisten Medien nicht gefunden; der Stamm ist mesophil und besitzt diastatische und

BAD ORIGINAL

proteolytische Natur; und sämtliche untersuchte Zucker mit Ausnahme von D-Mannit werden für das Wachstum als Kohlenstoffquellen verwertet»

5 Zieht man diese Merkmale in Betracht, so wird der

Stamm T-23 als zugehörig zum Genus Streptomyces erkannt. Unter den Spezies von Streptomyces, die in " "' 8. Auflage von Bergey's Manual beschrieben worden, gleicht der Stamm T-23 sehr S. rishiriensis. Die E ".gor IQ schäften des Stammes werden mit denen von S. rishiriensis verglichen, und man erzielt eine gute Übereinstimmung mit Ausnahme der löslichen Pigmente und organischen Agarmedien. Daher wird der Stamm T-23 als Stamm von S. rishiriensis identifiziert.

15 ■ .

Zur' Erzeugung der Substanzen T-23-I und -II erfolgt die Fermentation des vorstehend erwähnten Stammes Streptomyces T-23 nach der Methode zur Fermentation jeglichen Actinomyces-Stammes. Als Kohlenstoffquelle sind Saccharide, wie Glucose, Lactose und Fructose, Stärke und Stärkehydrolysate allein oder in Kombination verwendbar. Das Gemisch von Stärke und Glucose ist bevorzugt. Als Stickstoffquelle sind Fleischextrakt, Polypepton, Sojamehl, Maisquellflüssigkeit

25 und verschiedene anorganische Stickstoffquellen

brauchbar. Um die fermentative Produktion zu erleichtern, können einige Zusätze, d.h. trockene Hefe, Maltoseextrakt und andere verschiedene Pflanzensamenextrakte, Vitamine und verschiedene anorganische Salze zugesetzt werden. Falls notwendig, kann ein Antischaummittel, wie Siliconöl, pflanzliches öl usw. zugesetzt werden. Die Kultur des Stammes kann unter Verwendung eines Kolbens, eines Rüttel-Fermentors oder eines Fermentationsbehälters größeren Maßstabs durchgeführt werden. Die KuItürtemperatur liegt bei 20 bis 35 C und

-ιοί vorzugsweise bei 25 bis 3O°C und es wird ein Submers-Kultursystem verwendet. Die Zeit für das Kultivieren beträgt 17 bis 96 h und das Maximum der Produktion der Substanzen T-2 3-I und -II erzielt man bei etwa 24 h nach dem Initiieren der Kultur.

Die Stubstanzen T-23-I und -II sind in Wasser unlöslich und löslich in höheren Alkoholen, Aceton, Chloroform, Benzol und Äthylacetat, und daher wird eine geeignete ■jQ Reinigungsmethode in Abhängigkeit von derartigen Löslichkeitsmerkmalen gewählt.

Ein Beispiel wird nachstehend zur Veranschaulichung der Gewinnung der Substanzen T-23-I und -II angegeben.

Die Substanzen T-23-I und -II werden hauptsächlich in den Mycelien akkumuliert, wobei ein gewisses Ausmaß auch in einer überstehenden Flüssigkeit vorhanden ist. Nach dem Kultivieren wurde die Kulturbrühe bald gekühlt und anschließend durch Zentrifugieren oder Filtrieren in Mycelien und überstehende Flüssigkeit aufgeteilt. Die Mycelien wurden mit 60 - 70 % wässrigem Aceton behandelt. Der Extrakt, der die aktive Fraktion enthielt, wurde filtriert. Das Filtrat wurde durch ein nichtionisches Austauscherharz geleitet, um die Absorption der aktiven Fraktion darauf zu bewirken unddann wurde der aktive Teil mit einem organischen Lösungsmittel, wie einem niedrigen Alkohol oder Aceton oder einer wässrigen Lösung, die solche organische Lösungsmittel enthielt, eluiert. Alternativ ist es auch möglich, den aktiven Teil mit einem organisches Lösungsmittel direkt von dem Filtrat zu extrahieren.

Der aktive Anteil, der direkt von der überstehenden Flüssigkeit erhalten wurde, wurde mit einem Mycelien-

-πι extrakt kombiniert. Das erhaltene Gemisch wurde auf einen pH-Wert von 5,0 bis 6,0 eingestellt und das organische Lösungsmittel, das vorhanden war, wurde unter verringertem Druck verdampft. Die aktive Substanz yirvon der wässrigen Phase mit einem mit Wasser nichtmischbaren Lösungsmittel, wie Chloroform, Xthylace ■.■■■<. oder Isopropylalkohol in Abwesenheit oder Anwesenhe : eines industriell brauchbaren anorganischen Salzes, wie Natriumchlorid, extrahiert, um die Wirksamkeit der Extraktion zu verbessern. Der erhaltene Extrakt wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat versetzt, zur Entwässerung eine Weile stehengelassen und anschließend unter verringertem Druck konzentriert. Anschließend wurde der erhaltene Rückstand mit Petroläther oder Hexan versetzt, um eine Ausfällung eines physiologisch aktiven Produkts zu bewirken, von dem es sich zeigte, daß es aus den Substanzen T-23-I und -II bestand. Diese Substanzen wurden darüberhinaus durch Chromatographie getrennt, unter Verwendung von Kieselsäure, nicht-

20 ionischem Austauscherharz, Cephadex LH-20 usw. Im

folgenden wird ein Beispiel für das Herstellungsverfahren von hochgereinigten Substanzen T-23-I und/oder T-23-II mittels Flüssigkeitschromatographxe angegeben.

Kieselsäure wurde mit Hilfe von Benzol in eine Säule gefüllt, worauf dann eine Probe, die sowohl die Substanzen T-23-I als auch -II enthielt, aufgetragen wurde. Die zuerst durch Leiten von Benzol durch die Säule eluierte Fraktion wurde verworfen. Anschließend wurde die Substanz T-23-I mit einem gemischten Lösungsmittel aus Benzol/Aceton (4:1) eluiert. Die erhaltenen aktiven Fraktionen wurden unter verringertem Druck konzentriert, und ein nichtpolares Lösungsmittel, wie Petoläther oder Hexan, wurde zugesetzt, um die Substanz T-23-I zu kristallisieren. Die.so erhaltene

-12-

Substanz T-23-I kann gegebenenfalls weiter durch Chromatographie oder Umkristallisieren gereinigt werden, unter Bildung der hochgereinigten Substanz T-23-I. Die Stubstanz T-23-II wurde eluiert durch Leiten eines gemischten Lösungsmittel von Benzol/Aceton (7:3) durch diese Säule. Die hochgereinigte Substanz T-23-II wurde in gleicher Weise, wie die Substanz T-23-I erhalten.

Darüberhinaus sei festgestellt, daß die Substanzen T-23-I und -II chemisch ineinander umwandelbar sind. Durch Reduktion mit Na-S-O. beispielsweise kann die Substanz T-23-I leicht in die Substanz T-23-II umgewandelt werden und die umgekehrte Reaktion kann durch Oxidation mit Luft oder FeCl₃ erzielt werden.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Substanzen T-23-I und -II sind im nachfolgenden aufgeführt.

Substanz T-23-I

1. Aussehen: amorphes gelbes Pulver

2. Strukturformel:

OCH5

is O O *ϊ

λ λ α «α« «α

■13-

^C36^H48^N ₂V

(3) (α)ρ⁵ = +91.8 CCHCl₃, ΟΙ.Ql).

(4) Schmp.il7^oC (Zers.)

{5} Sleraentaranalyse für

C%

berechnet-, 67,92

gefunden: 67_O72 (6) UV Absorption:

7.55 7.68

NS

4.40 4.28

0%

20.3.; 19.74

(8)

• A max	1460	cm	)	molare Flxtinktio	•	= 38500
262 nm	1376	cm	ε		= 49600
272 nm	1300	cm-1	Il		= 38800
282 nm	1202	cm	ti		= 3400
383 nm	CDCl ]
		1100 cm"¹
		99 8 cm"¹
	849 cm"¹
	720 cm"¹






IR Absorption (-vgl.Fig
3330 cm"¹
1730 cm"¹
1650 cm"¹
1535 cm"¹
¹³C-NMR {in

Il

-C-NH-O

-C-O-C

188.2, 182.5

169.4

172.9 145.4, 137.9_f.129.3

^CH= 139.9, 133.7, 133.6, 133.2

133.1, 131.3, 129.5, 122.5,

114.5

^CH-O 79.2, 7.5.2, 68.0

-OCH₃ 56.6 O

in ^i! '

^1U -C-Oi-NH- 48.5

Il

-C-CH- 44.9 0

15 Il :

-C-CH-- 4 4.8

^CH- 39.9

-CH_- · 33.0, 29.4, 29.4, 29.3, 25.6

25.6, 255.5, 25.5

-CH 20.5, 17.4, (9) PMR (in CDCl )

^CH-CH 0.90 3H , d

1.41 3H , d

/^CH3	1.80	3H	, s
-OCH₃	3.28	3H	, dt
-OCH^	4.02	IH	, bs
	4.75	IH	, dd
CH₃	4.96	IH	, dq
I -NH-CH-	4.36	IH	, d
aroinatisches Ii	6.50	IH	, d
	7.51	IH

-15-

CONH 8,18 1Η, S

(10) Farbreaktion:

Nihydrin (-

Biuret (-

Anthron (■ Fehling

(11) Löslichkeit in Lösungsmitteln: löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Chloroform und Äthylacetat, kaum löslich in Benzol und Äther, unlöslich in Wasser, Petroläther und Hexan

(12) Cyclohexy!alanin als esterbildende Komponente in 11-Stellung befindet sich in der D-Form.

Substanz T-23-II
20

(1) Aussehen: amorphes, weißes Pulver

(2) Strukturformel?

25

OCH₃

^ ^H Ö HO^ OH „^

■Ν ^u

BAD ORIGINAL

(3) (4) (5)

^J β +288° Fp. 151°C (3ers.)

in CH	₃0H)	°8^:	-	0%	32
^C36^H	50^N2	N%		20.	13
H%		.28	20.
7.68	4	.40
7.55	4

Elementaranalvse für

C%

berechneti 67.72 gefunden: 67.92

(6) UV Absorption

molare Extinktion & «= 40800 " = 52300 ¹¹ = 40500 " = 5900

(7) IR Absorption (vgl.Fig. 2)

3340 (NH, OH), 1730, 1200 (Ester),

(8)

λ max	nm
260	nm
270	nm
280	nm
310

1650, 1535 (Amid	)	176	.9,	173.	3	137.	8,	132	.7,
¹³C-NMR (in CDCl	3>	179	.7
I _Λ -HN-C=O		149	.2,	141.	1,	133.	9,	129	.6,
I -0-C=O		125	.5			124.	3,	115	•8,
		134	.9,	134.	4,
		129	.5,	129.	1,	.7
^CH=		107	.5
		79.	6,	75.8,	68
		56.	6
>CH-O-
"" 3

BAD ORiGINAL

Il I

-C-CH-NH- 48ο7
0

Il

-C-CH- 45.1

Ii

-C-CH₂-

ΓΗ— "3t Q ft

'-CH₂- 33.7, 31.7, 29.5, 29.4, 26.7

26.6, 25.7, 25.6

-CH₃ 20.3, 17.7, (9) PMR (in d-Pyridin )

^CH-CH₃ 0.85 3Η , d .

1.57 3H-, d

^CH₃ 1.98 3Η , s

-OCH₃ 3.27 3H , s

-O-ChC 4.49 IH , dt

5.28 IH , bs*

_oc CH_ 5o36 IH , dd

Ao I

-NH-CH- 4.80 2H , dq

^H 5.53 IH , m

5.70 IH , dd.

6.06 IH' , ro

6.23 IH , dd

6.37 ■ IH , dd

6.53 IH , dd 35

6.64 IH. , d.d

BAD ORIGINAL

aromatisches H 7,12 2H, s CONH 8,78 1H, bs

9,01 1H, d

(10) Farbreaktion:

Ninhydrin (-)

Biuret (-)

Anthron (-)

Fehling (+)

(11) Löslichkeit in Lösungsmitteln:

löslich in Chloroform, Methanol, Äthanol, Aceton und Äthylacetat, kaum löslich in Benzol und Äther, unlöslich in Wasser, Petroläther und Hexan.

(12) Cyclohexylalanin als esterbildende Komponente in der 11-Stellung liegt in D-Form, vor.

20 Die Substanzen T-23-III und -IV können erhalten werden durch Entfernen der Seitenketten, die einen Cyclohexanring umfaßt, an dem Kohlenstoffatom in 11-Stellung durch Reduktion. Eine derartige Reduktion kann als katalytische Hydrierung unter Verwendung von Lithium-

aluminiumhydrid oder Platin-Kohlenstoff in üblicher Weise durchgeführt werden.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Substanzen T-23-III und -IV, die so erhalten wurden, sind 30 nachstehend aufgeführt:

Substanz T-23-III

(1) Aussehen: gelblichorange-farbiges amorphes Pulver 35

BAD ORIGINAL

„ 0 « »

ο η « β. «

-19-

(2) Strukturformel (MG 455)

OH

OCH₅

(3) ί4) (5)

= +4.3° (c=l% in MeOH)

Fp. 94 - 95°C

36 33 6" HI N%

Elenentaranalyse für

C%_

berechnet 68.27 gefunden 67^76

(6) UV Absorption (in MeOH) r=iolare Extinktion

7,66 .7.67

3 «06 3.06

0% 21.01

21.01

Λ max 261 nm

271 im 282 nm 386 nm e; = 33800

ⁿ = 43300 ⁸¹ = 33500

^i? = 1400

(7) Iß Absorption (in CHCl₃)

- 3340_f 2910, 1703, 1668, 1650 1633, 1612, 1503, 1452, 1380, 1300, 1190, 1164, 1135, 1094

BAD ORaGINAL

:ίθ' J. JLO.::! 32A3924

1040, 1003 and 913 era" (8) ¹³C-NMR (in CDCl₃) ⁵O

-C- · 188.1, 182.4

-NH-C- 169.4

¹⁰ ^_c= 145.2, 139.1, 137.9

^CH = 134.1, 133.6, 133.4, 131.8,

130.9, 130.4, 128.7, 123.3,

114.2 15

^CH-O 78.8, 72.5, 69.2

OCH 56.6

CO-CH- 44.6

20 _CH 40.7

_CH 36.5, 29.5, 26.6

^CH₃ 20.3

CH ' - 10.5

(9) PMR

vgl. die beigefügte Fig.

(10) Löslichkeit in Lösungsmitteln:

30 löslich in Chloroform, Äthylacetat, Methanol, Ethanol,

Aceton, Acetonitril, Benzol und Toluol, kaum löslich in Äthyläther, unlöslich in Petroläther und Wasser.

Substanz T-23-IV

(1) Aussehen: gräulich-weiß farbiges amorphes Pulver

(2) Strukturformel (MG 457)

OH

OCH₃

(3) (α) ρ⁵= ⁺²⁷³° £c=l%

(4) Fp. 130 - 132⁰C

Elemtaranalyse für

C%

berechnet gefunden

68.27

67.76

MeOH)

^C36^H35^NCV

7.66
7.67

3.06

3.07

(6)" UV Absorption (in MeOH)

263 nm

273 nm 282 ran 307 nm

30800

39800

30600

3300

.0% 21.01

21.50

3243974

-22- ! (7) IR Absorption (KBr Scheibe)

3340_r 2920, 1645, 1540, 1462, 1378, 1300, 1224, 1195, 1145, ₅ 1090, 1000 and 854 cm"¹

(8) ¹³C-NMR ( in d-Pyridin ) O

Ii

NH-C- 170.3

10 ^C= 151.3, 141.7, 139.8, 132.9,

127.7 ^CH= 135.8, 134.8, 133.8, 131.1,

130.5, 129.8, 123.8, 116.4

108.1

	CH-O	80.8,	70.5,	68.1
	OCH₃	56.1
	CO-CH₂-	43.1
	CH	38.9
	CH₂	36.2,	32.3,	25.9
	=/^CH3	21.1,	9.8
(9) PMR
vgl.	beigefügte Fig. 4

(10) Löslichkeit in Lösungsmitteln:

löslich in Chloroform, Äthylacetat, Methanol, 30 Äthanol, Aceton und Acetonitril,

kaum löslich in Benzol und Toluol, unlöslich in Petroläther und Wasser.

Die Substanzen T-23-I, -II, -III und -IV sind neu und
35 brauchbar als Antitumormittel, da sie wirksam bei der

BAD ORIGINAL

1 Inhibierung des Wachstums verschiedener Arten von Tumorzellen sind. Darüberhinaus sind die Substanzen Τ-23-ΪΙΙ und -IV brauchbar als Zwischenprodukte zur Herstellung neuer Verbindungen durch Einführung verschiedener

5 Substituenten in die 11-Hydroxylgruppe der Substanzen
T-23-III oder -IV.

Die physiologischen Eigenschaften jeder der Substaüze.. T-23-I, -II, -III und -IV sind nachstehend aufgeführt-?

10 -

Substanz T-23-I

(1) Ahtimikrobielle Wirkung gegen Hefen und Fungi 15 · Tabelle I

Test-Mikroorganismus MIC

Aspefgillus japonicus 12.5

20 (IAM 2016)

Mucor pusillus 12.5,

. (IAM 6122)

Penicillium chrysogenum SoO

25 - ^;

CIAM 7106)

Saccharomyces cerevisiae 4.0

(IFO 0304) .

2Q Saccharomyces rouxii 4,0

(IFO 0505)

Candida utilis 4.0

(IFO 0396}
35

Der Wert der MIC (minimale inhibitorische Konzentration) der Substanz T-23-I wurde bestimmt durch Kultivieren eines Mikroorganismus in einem Medium, das 1,0 % Glucose und 0,2 % Malzextrakt enthielt,

bei 30°C während 72 h nach einer Verdünnungsmethode.

- (2) Antitumorwirksamkeit (in vitro) gegen L-5178Y-Lymphomzeilen

10 Tabelle II

Konzentration (pg/ml) Zustand des Zellwachstums 4,0
2,0

15 1,0

0,5

0,25 ±

0,125 +

Das durch eine Verdünnungsmethode festgestellte Zellwachstum unter Verwendung eines Eagle-NEM-Mediums (Nlssui) ergänzt mit 10 % Pferdeserum und 100 mg/1 Asparagin und kultiviert bei 37 C während 120· h. Die Substanz T-23-I in äthanolischer

25 Lösung wurde einem Assay-System zugesetzt.

(3-)i Antitumorwirkung gegen die Leukämie P-3 88 der Maus

-25-Tabelle III

Dosierung erhöhte Lebensspanne

24 mg/kg/Tag χ 2mal 56,0

12 mg/kg/Tag χ 2mal 123,3

6 mg/kg/Tag χ 2mal 120,2

3 mg/kg/Tag χ 2mal 105,7

1,5 mg/kg/Tag χ 2mal 107,3

0,75 mg/kg/Tag χ 2mal 105,7

0 mg/kg/Tag χ 2mal 100

6 männlichen CDF., -Mäusen (20 ί g) einer Gruppe wurden 10 Ascites-Tumor P-388 Zellen intraperito-

IQ neal transplantxert= Das Testmaterial wurde zuerst 24 h und anschließend 120 h nach der Transplantation verabreicht. Die Dosis des in Gummiarabikum suspendierten Testmaterials betrug jedesmal 0,2 ml. Die Lebensspanne wurde als Prozent der Lebensspanne der

20 Kontrollgruppe ausgedrückt (der eine Gummiarabikumsuspension verabreicht wurde).

(4) Akute Toxizität:

LD₅₀ (Maus, i.p.) 55,9 mg/kg

Substanz T-23-II

(1) Antimikrobielle Wirkung gegen Hefen und Fungi

BAD ORIQfISSAL

-26-

Tabelle Test-Mikroorganismus Aspergillum japonicus

(IAM 2016) Mucor pusillus

(IAM 6122) Penicillium chrysogenum

(IAM 7106) Saccharomyces cerevisiae

(IFO 0304) Saccharomyces rouxii

IV

MIC (pq/ml)

12.5

4.0

(IFO 0505) Candida utilis (IFO 0396)

Der Wert der MIC (minimale inhibitorische Konzen tration) der Substanz T-23-II wurde bestimmt durch Kultivieren eines Mikroorganismus in einem Medium, das 1,0 % Glucose und 0,2 % Malzextrakt enthielt, bei 30 C während 72 h nach einem Verdünnungsverfahren,

(2) Antitumorwirkung (in vitro) gegen L-517 8 Y Lymph OJH ζ eilen

T J3_ b e

Konzentration (ug/ml) 4,0 2,0 1,O 0,5 0,25 0,125

Zustand des Zellwachstums

BAD ORiQSNAL

	1 « Λ O * O β O

«a β ο

-27-

Das Zellwachstum wurde mittels einer Verdünnungsmethode beobachtet, unter Verwendung eines EagIe-NEM-. Mediums (Nissui), ergänzt mit 10 % Pferdeserum und 100 mg/1 Asparagin und kultiviert bei 37°C während 120 h. Die Substanz T-23-II in Äthanollösung wurde einem Assay-System zugesetzt.

(3) Antitumorwirkung gegen das Sarcom 180 der Maus

1 ο Tabelle VI

erhöhte Lebensspanne Dosierung T/C (%)

20 mg/kg/Tag χ 4mal 138,7

6,6 mg/kg/Tag x' 4mal 115,0

15 2,2 mg/kg/Tag χ 4mal 95,6

0,7 mg/kg/Tag χ 4mal 109,6

0 mg/kg/Tag χ 4mal 100

6 männlichen ICR-Mäusen (25 ± 1 g) einer Gruppe

6
wurden 10 Sarcom 180 AcitesTumorzellen intraperitoneal transplantiert. Das Testmaterial wurde zuerst 3 h nach der Transplantation und dann 4mal alle 24 h verabreicht. Die Dosierung des Testmaterials (Substanz T-23-II), suspendiert in Gummiarabikum, betrug jedesmal 0,2 ml. Die erhöhte Lebensspanne wurde ausgedrückt als % der Lebensspanne der Kontrollgruppe (der eine Gummiarabikumsuspension verabreicht wurde).

30 (4) Antitumor-Aktivität gegen Leukämie P-388 der Maus

BAD ORSQfNAL

Tabelle VII

erhöhte Lebensspanne Dosierung T/C (%)

20 mg/kg/Tag χ 6mal 135,7

10 mg/kg/Tag χ 6mal 120,2

5 mg/kg/Tag χ 6mal 127,1 2,5 mg/kg/Tag χ 6mal 109,9 1,25 mg/kg/Tag χ 6mal 130,0 O mg/kg/Tag χ 6mal 100,0

6 männlichen CDF₁-Mäusen (20 ί 1 g) einer Gruppe

wurden 10 Ascites-Tumor-P-388-Zellen intraperito-

neal transplantiert. Das Testmaterial wurde zuerst 24 h nach der Transplantation und anschließend 6mal 15 alle 24 h verabreicht. Die Dosis des Testmaterials, suspendiert in Gummiarabikum, betrug jeweils 0,2 ml. Die erhöhte Lebensspanne wurde als % der Lebensspanne der Kontrollgruppe (der eine Gummiarabikumsuspension verabreicht wurde) ausgedrückt.

(5) Akute Toxizität

^LD50 (^Maus ί·Ρ·) 85,5 mg/kg

Substanz T-23-III

(1) Antitumorwirkung gegen P-388-Ascites-Tumorzellen

30 Das Zellwachstum der P-388-Ascites-Tumorzellen, aufrechterhalten in dem Abdominalraum von CDF₁-Mäusen wurde nach einer Verdünnungsmethode beobachtet, unter Anwendung der Kultur mit einer Serie von RPMI-164O-Medien, süpplementiert mit 10 % Rinder-

kälberserum und 10 uMol 2-Hydroxyäthyl-disulfid

BAD ORSGINAL

.:f.O" J. .!.Ό..::," 32 A 3924

während 96 h. Die festgestellte Inhibierung des Zellwachstums ist im folgenden aufgeführt;

Tabelle VIII

Inhibierung des Konzentration (pg/ml) Zellwachstums

20 +

10 +

5 +

10 .2,5 +

1,25 ±

0,6 -

0,3 -

0,15

15 . · ·

(2) Akute Toxizität

LD₅ (Maus, i.p.) etwa 250 mg/kg

Substanz T-23-IV

(1) Antitumorwirkung gegen P-388-Ascites-Tumorzellen

Das Zellwachstum der P-388-Ascites-Tumorzellen, aufrechterhalten in dem Abdomina!raum von CDF₁-Mäusen wurde- nach einer Verdünnungsmethode beobachtet, unter Anwendung der Kultur in einer Serie von RPMI-164O-Medien, ergänzt mit 10 % Rinderkälberserum und 10 pMol 2-Hydroxyäthyl-disulfid, während 96 h. Die festgestellte Inhibierung des Zellwachstums ist im folgenden aufgeführt.

BAD 0F15GIMAL

-30-Tabelle IX

,, ... / /ην Inhibierung des Konzentratxon (pg/ml) Zellwachstums

B 20 +

+

5 +

2,5 +

1 ,25 +

0,6 +

0,3
0,15

(2) Akute Toxizität
LD_r_ (Maus, i.p.) etwa 280 mg/kg

Ein weiteres Merkmal der Erfindung liegt in der Verwendung jeglicher der Substanzen T-23-I, -II, -III und

20 -IV ji^aäß der Urfindung in der Form von therapeutischen Mitteln oder Formulierungen, die eine der Substanzen als aktiven Bestandteil zusammen mit üblichen Trägern und Verdünnungsmitteln enthalten. Die therapeutischen Mittel oder Formulierungen werden in üblicher Weise her-

25 gestellt durch Compoundieren einer geeigneten Dosis mit den üblichen flüssigen Trägern und den üblichen pharmazeutischen Hilfsstoffen für die gewünschte parenterale Verabreichung- Geeignete Träger können physiologische Salzlösung und physiologisch verträgliche

Polyäthylenglykole sein, und geeignete Hilfsstoffe können Tween-80 usw. umfassen, so daß eine Lösung oder Suspension gebildet wird. Als Einzeldosierungen der aktiven Substanz können 1-50 mg/kg, vorzugsweise 2-15 mg/kg täglich in Betracht kommen.

BAD ORIGINAL

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung ohne sie zu beschränken.

Beispi el 1_

Der Stamm von Streptomyces T-2 3 wurde als Schrägkultur, die 1,0 % lösliche Stärke, 0,2 % Hefeextrakt und 1,5 %

IQ Agar enthielt, gelagert. Die Sporen des Organismus

einer gut gewachsenen Agar-Schrägkultur wurden aseptisch in ein Inoculum-Kulturmedium (das 1,0 % lösliche Stärke, 1,0 % Melassen, 1,0 % Fleischextrakt und 1,0 % Polypepton enthielt, eingestellt auf den pH-Wert 7',O) in einen 500 ml Erlenmayer-Kolben inokuliert. Der Kolben wurde auf einem Rotationsschüttler 48 h bei 30°C inkubiert. Die resultierende Kultursaat wurde in jeweils 0,5 ml Teile auf eine Anzahl von .Erlenmayer-Kolben aufgeteilt, die jeweils 100 ml des gleichen Kulturmediums wie vorstehend enthielten. Die Kultur

wurde durchgeführt unter Schütteln bei 30°C bei 2 4 h, wobei ein Saat-Inoculum für die Produktionskultur unter Verwendung eines Rüttelfermentors erzielt wurde. Zur Herstellung der Kultur wurden 6 Rüttelfermentoren mit einem Fassungsvermögen von 30 1, verwendet, die jeweils 15,0 1 eines Mediums (pH 7,0) enthielten,- das 1,0 % Glucose, 1,5 % lösliche Stärke, 1,5 % Sojamehl, 0,2 % getrocknete Hefe, 0,2 % Ammoniumsulfat, 0,5 % Natriumchlorid, O,4 % ausgefälltes Calciumcarbonat und 0,33 % Antischaummittel (Toshiba "Silicone" AMA 6 509) enthielt, Das erhaltene Inoculum wurde in jeden der Fermentoren gegeben und die Kultur unter Belüften und Rühren (15,0 l/min, 200 UpM) wurde 24 h bei 30°C durchgeführt.

Nach beendeter Kultur wurde die Kulturbrühe mit 4,On

BAD ORSQfMAL

Schwefelsäure auf den pH-Wert 5,8 eingestellt. Das Mycel wurde durch eine Zentrifugenvorrichtung gewonnen, in 20 ml 60 % wässriges Aceton unter Rühren während kurzer Zeit getaucht und anschließend stehengelassen. Anschließend wurde das gesamte Gemisch filtriert zur Entfernung des ungelösten Rückstands, und die überstehende Flüssigkeit (Extrakt) wurde gewonnen. Die gleiche Verfahrensweise wurde zweimal wiederholt. Die vereinten Extrakte ergaben 40 ml. Hieraus wurde das Aceton unter verringertem Druck verdampft, wobei 18,0 1 einer wässrigen Lösung zurückblieben. Zu dieser Lösung (18,0 1) wurden 6,5 kg Natriumchlorid gefügt, und die resultierende Lösung wurde zweimal mit jeweils 9,0 1 Äthylacetat extrahiert. Die erhaltene Äthylacetatlösung wurde mit 1,0 % Na₃SO₄ versetzt und anschließend ruhengehalten. Nach dem Entwässern wurde die Lösung auf ein geringes Volumen unter verringertem Druck konzentriert. Zu der konzentrierten Flüssigkeit wurde ein adäquates Volumen an Hexan gefügt, wo-

20 durch eine rohe Ausfällung erhalten wurde, die die

Substanzen T-23-I und -II enthielt. Die so erhaltene Ausfällung wurde mit Hexan gewaschen und anschließend im Vakuum getrocknet, unter Bildung von 42 g eines rohen Gernischs der Substanzen T-23-I und -II. Das

25 so erhaltene rohe Pulver wurde in 100 ml Chloroform

gelöst, und die resultierende Lösung wurde einer Säulenchromatographie an Kieselsäure (gefüllt mit 400 g SiIiciumdioxidgel) unterzogen. Es wurde mit Benzol eluiert, gefolgt von einem Gemisch von Benzol/Aceton (4:1) , um die Fraktionierung der Substanz T-2 3-I von Verunreinigungen zu erzielen. Durch weitere Anwendung von Benzol/ Aceton (7:3) wurde die Substanz T-23-I! nach einander eluiert. Die Anteile, die jeweils die Substanzen T-23-I und -II enthielten, wurden einzeln unter verringertem Druck konzentriert. Diese konzentrierten Anteile wurden

BAD ORIGINAL

einzeln mit einem adäquaten Volumen an Hexan versetzt. Der kristalline Feststoff der Substanz T-23-I,-der erhalten wurde, betrug 1,5 g und der der Substanz T-23-II 11.,7 g.

Beispiel 2

Es wurde der Stamm Streptomyces T-23 wie im Beispiel 1 kultiviert. Die resultierende Kulturbrühe wurde zur Erzielung einer überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert 10,0 1 dieser überstehenden Flüssigkeit wurden durch eine Säule geleitet, die mit einem nichtionischen

15 Austauscherharz HP-20 gefüllt war, und die Säule

wurde mit Wasser gewaschen. Die Fraktionen, die die Substanzen T-23-I und -II enthielten, wurden mit 2,0 1 50 % wässrigem Aceton eluiert. Das Aceton wurde im Vakuum verdampft, unter Erzielung einer wässrigen Lösung, die anschließend zweimal mit Äthylacetat extrahiert .wurde. Der so erhaltene Extrakt wurde mit wasserfreiem Na₃SO₄ versetzt und eine Weile ruhiggehalten. Der Extrakt wurde im Vakuum konzentriert, unter Bildung von 2,0 g eines dunkelbraunen Öls. Das so erhaltene öl wurde in 10 ml Chloroform gelöst= Die Lösung wurde einer Säulenchromatographie an Kieselsäure unterzogen. Es wurde mit Benzol und anschließend mit einem Gemisch von Benzol/Aceton (4:1) zur Isolierung und Reinigung der Substanz T-23-I eluiert. Durch weiteres Eluieren mit Benzol/Aceton (7:3) erhielt man die Substanz T-23-II. Die Fraktionen, die jeweils die Substanzen T-23-I bzw. -II enthielten,wurden im Vakuum einzeln konzentriert. Diese Konzentrate wurden einzeln mit Hexan zur Bildung von Ausfällungen versetzt. Die Ausfällungen wurden einzeln gesammelt, mit Hexan ge-

waschen und dann im. Vakuum getrocknet. Die erhaltene rohe Substanz T-23-I betrug 48 mg, und die rohe Substanz T-23-II betrug 0,63 g.

Beispiel 3

Zu 100 ml Methanol mit 0,1 g Eisen-III-_chlorid darin gelöst, wurden 1,25 g Substanz T-23-II gelöst unter Rühren unter Eiskühlen gefügt, und anschließend wurde die resultierende Lösung 15 min stehengelassen, worauf im Vakuum konzentriert wurde. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde mit 100 ml Äthylacetat versetzt, unter Bildung einer Lösung, die durch ein Glasfilter filtriert wurde. Aus dem Filtrat wurde Äthylacetat erneut durch Verdampfen im Vakuum entfernt, wobei man 1,05 g der Substanz T-23-I als gelbes Pulver erhielt.

Beispiel 4

700 mg der Substanz T-23-II wurden in 70 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst unter Erzielung einer Lösung,

die auf -15°C gekühlt wurde. Zu der Lösung wurden unter Rühren 150 mg Lithiumaluminiumhydrid (LiAlH*) in drei Portionen zur Erzielung einer Reaktion gefügt. 200 ml Äthylacetat wurden tropfenweise zugesetzt, und weiter wurden 100 ml 0,1 m Phosphatpufferlösung (pH 6,8) zugefügt. Die Lösungsmittelschicht wurde von der wässrigen Schicht abgetrennt und anschließend mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die getrocknete resultierende Lösung wurde konzentriert, · und das resultierende Konzentrat wurde anschließend durch Dünn-

schichtchromatographie unter Verwendung einer Kieselsäureplatte (Merck Art. 5717) und von Benzol/Äthylacetat (2:3) Lösungsmittel behandelt. Nach dem Entwickeln wurden die gelben Bandteile gesammelt und es wurde mit Äthylacetat/Methanol eluiert. Das Eluat wurde im Vakuum getrocknet, unter Bildung von 260 mg Substanz T-23-III. Ausbeute 52 %.

Beispiel

700 mg der Substanz T-23-II wurden in 70 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst, unter Bildung einer Lösung, die auf -15°C gekühlt wurde. Zu der Lösung wurden unter Rühren 150 mg Lithiumaluminiumhydrid (LiAlHJ in drei Portionen zur Bewirkung der Reaktion gefügt. 200 ml Äthylacetat wurden tropfenweise zugesetzt, und darüberhinaus wurden 100 ml O,1 m Phosphatpufferlösung (pH 6,8) zugefügt. Die Lösungsmittelschicht wurde von der wässrigen Schicht abgetrennt und anschließend mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die resultierende trockene Lösung wurde konzentriert. Das erhaltene Konzentrat wurde anschließend durch Dünnschichtchromatographie behandelt, unter Verwendung einer Kieselsäureplatte (Merck Art. 5717) und von Benzol/Äthylacetat (2:3) als Lösungsmittel. Nach dem Entwickeln wurden die Banden, die eine blaue Fluoreszent unter einer UV-Lampe ergaben, gesammelt, und es wurde mit Äthylacetat/Methanol eluiert. Das Eluat wurde von Lösungsmittel befreit. 65 mg der Substanz T-23-IV wurden erzielt. Ausbeute 13 %.

-36-1 Beispiel 6

700 mg Substanz T-23-II wurden in 70 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst, unter Erzielung einer Lösung, die auf -15 C gekühlt wurde. Zu der Lösung wurden unter Rühren 150 mg Lithiumaluminiumhydrid (LiAlH.) in drei Portionen zur Bewirkung einer Reaktion gefügt. 200 ml Äthylacetat wurden tropfenweise zugesetzt, und 100 ml 0,1 m Phosphatpufferlösung (pH 6,8) wurden

10 ebenfalls zugefügt. Die Lösungsmittelschicht wurde

abgetrennt, und anschließend mit wasserfreiem Natriumfulfat getrocknet. Die resultierende trockene Lösung wurde konzentriert. Das erhaltene Konzentrat wurde anschließend durch Dünnschichtchroraatographie unter Anwendung einer Kieselsäureplatte (Merck Art. 5717) und eines Benzol/Äthylacetat(2:3)-Lösungsmittels behandelt. Nach dem Entwickeln wurden die gelbfarbigen Banden auf der Platte und die Banden, die unter einer UV-Lampe blaue Fluoreszenz emittierten, wurden einzeln gesammelt. Sie wurden einzeln mit Äthylacetat/Methanol eluiert. Das Lösungsmittel wurde aus den einzelnen Eluaten entfernt, wodurch man 260 mg (52 %) der Substanz T-23-III aus der Fraktion der gelben Bande und 65 mg (13 %) der Substanz T-23-IV aus der blau fluoreszierenden Bandenfraktion erhielt.

BAD ORIGINAL

Leerseite

Claims

324392/.

5 T 53

Nisshin Flour Milling Co., Ltd, 19-12, Nihonbashi -Roami -cho, 10 Chuo-ku, Tokyo, Japan

Mycotrienin-ähnliche Verbindungen, Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel

Patentansprüche

20 1. Verbindung mit der Formel

9 7

OCH₅

N

I» 41 »I

10 15

oder

-2-

OCH₅

HO

324392A

OH

worin R Wasserstoff oder eine Gruppe ist.
2. Verbindung nach Anspruch 1, worin R Wasserstoff ist.
3. Verbindung nach Anspruch 1, worin R die Bedeutung von 0 hat.
4. Verbindung nach Anspruch 3, worin R sich in der D-Form befindet.
5. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung mit der Formel

OCJl₅

OH

Anmelder f Nieshin .Flour SItU.tag CP««Αta·

10

O *· t 5*«

und/oder

DEICHT I

15

20

dadurch gekennzeichnet«, daß man einen Stamm von Streptomyces rishiriensis kultiviert, bis die gewünschte Verbindung in der Kulturbrühe akkumuliert

ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadureh ' . daß man als Stamm Streptomyces rishiriensis ■PERM P-S141 <FERM'BP-243) verwendet«

7« Arzneimittel, enthaltend eine Verbindung nach An-Spruch 1, 2 oder 3 zusammen, mit üblichen Hilfs- und Trägerstoffen.

80

36