Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowego metabolitu 3-[5B8a/?-idwum.eftylo-6-ace- toksy-2Hmetyleno-l5 -<4 - metylo^3npelriteny!lo)-lfi,2,3,4, 4aa,l5,i61a,7.$;8a - diziesieciowodoro-1 - nalftylo- metylo]- -5i,!6Jdwu!metylo-4-1hyldirokBy-^2HHpiranonu-2 o wzo- 5 rze przedstalwionyto na rysunku, wystepujacego w ntiiniejszym opisie pod nazwa seslkwicylina.Wedlug wynalazku sesikwiicyline otrzymuje sie w sposób polegajacy na tym, ze hoduje sie w pozyw¬ ce szczep grzyba gatunku Sesauiiciillium globulis- io porum ntov. spec.,, nastepnie z cieczy pofermenta¬ cyjnej, ewentualnie poddanej obróbce za pomoca UDtraturrax, wydziela sie w znany siposób seskwi- cyline na drodze ekstrakcji i/lub adsorpcji i na¬ stepnie oczyszcza droga chromatografii, krystali- *5 zacji lub rodzielamia w przeciwprajdzie.Szczep Sesauicilliiuim globulisporum ,nov.pec, sto¬ sowany w sposobie weidlug wynalazku,, jest wydzie¬ lony z próbki gleby z Rowiinj w Jugoslawii i zde¬ ponowany w United States Department of Agricul- 20 ture (Northern Utilization Research and Develop- ment Divisdon) Peoria, 111). USA pod numerem 5433.Nowy szczep gatunku grzyba Sesauicillium glo- bulilsporum nov. spec. rosnie wzglednie woJlnoitwo- 25 rzy w agarze slodowym w ciagu 10 dnli w opty¬ malnej temjperaturze gesta, poduszeozkowata ple- che o srednicy 3—4 cm. Strzepy plechy przenika¬ ja tylko troche do pozywki, a kultura obserwo¬ wana z dolu ma kolor zóltawy. Optimum Wzrostu 30 zachodzi w temperaturze 21—27°C, co jest prze¬ dzialem wzglednie szerokim, minimum wzrostowe znajduje sie w temperaturze 6°C, a maksimum 36°C.Piecha sklada sie z gesto splecionych, czesto roz¬ galezianych strzepek z przegrodami,, boczne od¬ galeziemia czesto wyginaja sie w kierunku radia¬ lnym. Grubosc strzepki pierwotnej w strzepkach brzeznych przewaznie prositych lub promieniowych wynosi 3 w, a w pierwotnych lub wtórnych strze¬ pkach odgalezionych wynosi 0,8—\1J5 fi.Forma koniidilalina uformowana rzadko w tem¬ peraturze ponizej 20°C jest widoczna w gestych poduszeczkach czesto rozgalezionych dichotomiiciznie lub okólkowo ukladów strzepi o grubosci komó¬ rek 1,2—1,5 (x i dlugosci 4^7'u, zawierajacej fialli- dy. Fialidy wyrastaja z boków komórek strzepki lub umieszczone sa na koncach,, w poduszeczkach ulozone sa gesito na róznej wysokosci mniej lub wiecej skierowane do góry. Sa one dwupostacio- we. Fialidy koncowe sa telefialidarni (Gams 11968), czesto u podstawy pecherzowo specizniale o dlugo¬ sci 4—7 (j, i grubosci 1J5—2 //, uksztaltowanie w po¬ staci cienkiego, czesto nieco zakrzywionegodzióbka.Nieregularnie wystepujace obwodowe fialidy sa pleurofialidami (Gams 1968), mniej lub wiecej cy¬ lindrycznymi i tylko u góry bocznie ukszltalto- Wianymii w postaci cienkiego dziobka. Mmiej lub wiecej wyraznie kuliste, hialinowe glaldkoscienne konlidia maja wymiary 1—ll,5 ju. Wewnatrz nosnej 85 20685 206 3 poduszeczki sa one uksztaltowane w postaci fal¬ szywych to jest niezwiazanych lancuchów, a na poszczególnych fialidach tworza one wkrótce roz¬ padajace sie krople.Sesauidilliuim glofoulisporuim nov.speic. tak, jak i inne znane rodzaje gatunku Sesauicilliuim Gams, maja fialMy ulozone parami ponad soba, przy czym pary nie zawsze wystepuja regularnie.Czasami fiiaHildy koncowe umieszczone sa na 2, a czasem nawet na 3 fialidach obwodowych. Trzy rodzaje opisane przez Gaimsa i Veenbaas-Rijksa maja wieksze i elipsoidalne konidia. Pozostale ce¬ chy, przede wszystkim stmiktury nosników, sa i u tych rodzajów zmienne. [K.W. Gaims w Acta bot. neerl. 17, str 45& i 4)97 (10618); Veenbaas-ttdjks w Acta bot, neerl. 10(3), str. 3123 (119(70)].Nowy szczep NRRL 543i3 mozna hodowac w po¬ zywce, zawierajacej zwykle stosowane substancje odzywcze dla grzybów. Szczep ten zuzywa substan¬ cje odzywcze, zwykle zuzywane przez cuidzozywne mikrooriganizimy, na przyklad glikoze i sacharoze jako zródlo wegla, oraz organiczne zwiazki, zawie¬ rajace azot, tafcie, jak pepton, wyciag drozdzowy, aminokwasy, szczawian amonowy jako zródlo azo¬ tu oraz zwykle sole mineralne i pierwiastki sla¬ dowe.Seskiwicyliine wytwarza sie w siposób polegaja¬ cy na tym, ze ciekla pozywke zaszczepia sie zawie¬ sina grzybni i zarodników nowego szczepu Ses- auicfillium globulisporum nov. spec. i kulture in- kufouje sie w ciagu 3^10 dnd, korzystnie 4 dni, w temperaturze 18—38°C, korzystoie 27°C przy wartosci ^H=4,S—&J2. Hodowle prowadzi sie albo w warunkach aerobowych w kulturze powierz¬ chniowej albo w kulturze glebinowej wstrzasanej lub w fenmentatorze przez który, mieszajac, prze¬ puszcza sie powietrze lub tlen.Po uzyskaniu w brzeczce maksymadnej ilosci ses- kwicyliny ewentualnie poddaje sie ja obróbce za pomoca Ultratuirra i wydziela sie seskwicyline w znany sposób metoda ekstrakcji lub adsorpcji. Ses¬ kwicyline mozna oczyscic chromatogilaSficznie, przez krystalizacje lub rozdzielanie przecliwtpradowe.Korzystnie prowadzi sie eksitrakcje oddzielonej cieczy pofermentacyjnej za pomoca chlorku etyle¬ nu, chociaz mozna stosowac równiez inne rozpu¬ szczalniki organiczne takie, jak benzen, chloroform, octan butylu, chlorek metylenu, butanol lufo octan etylu.Nastepnie z wyciagów usuwa sie rozpuszczalnik, na przyklad przez destylacje, pozostalosc odtlusz¬ cza sie, po czyim seskwicyline oczyszcza sie chro¬ matograficznie na Sephadex LH 20, technicznym tlenku glinu, zelu krzemionkowym, krzemianie ma¬ gnezu, tlenku glonu itp. lub przez rozdzielanie przedwprajdowe i/lub krystalizacje.Seskwicylina odznacza sie ciekawymi wlasciwo¬ sciami farmakologicznymi, dlatego mozna ja sto¬ sowac jako srodek leczniczy.Jak wykazaly próby ze szczurami Grollmana z nadcisnieniem, seskwicylina dziala przeciw nad¬ cisnieniu. Stosowana dawka zalezy oczywiscie od sposobu leczenia i stanu pacjenta. Na ogól u zwie¬ rzat doswiadczalnych uzyskuje sie zadawalajace wyniki, stosujac dawke 20—'30 mig/kg wagi ciala. « 40 45 50 60 05 Dawke te mozna podawac w miare potrzeby w 2—3 porcjach lub tez w postaci o przedluzonym dzialaniu. Dla wiekszych zwierzat ssacych dawka dzienna wynosi okolo 9(KX-J800 mg. Postac do po¬ dawania doustnego zawiera 5-G0-—8J0iO mg substan¬ cji czynnej,, zmieszanej z cieklymi lub stalymi no¬ snikami. Seskwicylina ma ponadto dzialanie ha¬ mujace obrzeki oraz dzialanie przeciwzapalne, co stwierdzono w tescie obrzeku karageniinowego i w tescie ziarniniakowym na sizczurach.Stosowane dawki zaleza oczywiscie od sposobu leczenia i stanu pacjenta. Na ogól u badanych zwierzat uzyskuje sie zadawalajace wyniki przy dawkach 1—315 mgykg wagi ciala. Dawke te w miiare potrzeby mozna podawac w 2—3 porcjach lub równiez w positaci o przedluzonym dzialaniu.Dla wiekszych zwierzat ssacych dawka wynosi oko¬ lo 7^0—(StOiO mig. Odfpowiedniia postac leku do po¬ dawania doustnego zawiera 70<—®0i0 mg substancji czynnej, zmieszanej z cieklymi lub stalymi nosni¬ kami. Seskwicylina ma ponadto dzialanie broncho- spazmolityczne, co stwierdzono u swinki morskiej ze skurczem oskrzeli, wywolanym draznieniem ner¬ wu blednego lub w przypadku skurczu oskrzeli u swinki morskiej lub kota, wywolanym histami¬ na lub u swinki morskiej wywolanym opryskiwa¬ niem hisitamina. Stosowana dawka zalezy oczywi¬ scie od sposobu podawania i stanu pacjenta.Na ogól u zwierzat doswiadczalnych uzyskano zadawalajace wyniki, stosujac dawke OjOll—-1-0 mg/kg wagi ciala. Dawke te mozna dzielic na 2—3 porcje, jak równiez podawac w postaci o prze¬ dluzonym dzialaniu. Dla wiekszych zwierzat ssa¬ cych dawka dzienna wynosi okolo O^S^-liO mg. Od¬ powiednia postac do podawania doustnego zawiera 0,5—alO mg subsitancji czynnej, zmieszanej z cie¬ klymi lub sitalymi nosnikami.Seskwicylina wykazuje równiez dzialanie rozluz¬ niajace, co wykazaly próby na myszach, szczurach, swinkach morskich lub malpach gatunku rezusów.Stosowana dawka zalezy oczywiscie od sposobu podawania i stanu pacjenta.Na ogól u zwierzat doswidczalnych uzyskuje sie zadawalajace wyniki, stosujac dawke 0i4—120mg/kg wagi ciala. Dawke te w miare potrzeby mozna podawac w 2-^3 porcjach lub równiez w postaci 0 przedluzonym dzialaniu. Dla wiekszych zwierzat ssacych stosuje sie dawke dzienna okolo 5—45*0 mg.Odpowiedni preparat do stosowania doustnego za¬ wiera 5^50 mg substancji czynnej, zmieszanej ze stalymi lub cieklymi nosnikami.Seskwicyline jako lek poddaje sie sama i to zarówno w czysitej postaci krystalicznej, jak i w postaci surowego koncentratu lub w postaci odpo¬ wiedniego preparatu do podawania doustnego, do- jelitowego lub pozajelitowego.W nizej podanym przykladzie, który objasnia siposób wedlug wynalazku nie ograniczajaic jego zakresu; dane temrjerattiurowe podane sa w sto¬ pniach Celsjusza.Przyklad. W fermentatorze umieszcza sie 10 litrów pozywki, zawierajacej w przeliczeniu na 1 litr HOIO g sacharozy, 4 g glicyny, Ig KH2PO4, 1 g MgSC4 • 7H2O, Ig wyciagu drozdzowego oraz odminerallzowana wode,, nastepnie zaszczepia sie5 85 206 6 1 litrem kultury posiewcwej szczepu NiRRL 5433 i inkulbuje sie, napowietrzajac (0,15—1,0 litr powie- tpza/imdnute) litr pozywki) i mieszajac (190—430 obrotcw/minute) w ciagiu 4 dnii w temperaturze 27°C, przy wartosci pH = 5,0.Brzeczke pofermentacyjna poddaje sie obróbce za pomoca Ultraturra i ekstrahuje trzykrotnie 10 litrami chlorku etylenu. Wyciagi osusza sie siar¬ czanem sodu i uwalnia od rozpuszczalnika pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc odtluszcza sie heksanem, chromatogirafuje sie w ebaniolu na Sephadex LH 20, a pozostalosc frakcji w chloro¬ formie saczy przez warstwe tlenku glinu (akty¬ wnosc II).Z pozostalosci krystalizuje seskwicylina z eteru etylowego. Ma ona nastepujaca charakterystyke: bezbarwna krystaliczna substancja o temperaturze topnienia 108°. Skrecalnosc wlasciwa [a]D20 = —11° (c = 0g9 w Chloroformie). Analiza elementarna.Dla wzoru C29H42O5 (470,7) obliczono: 74,i2P/oC, 9,l°/aH, 17,4%0; otrzymano 74,l<,/oC„ 8,i9°/oH, 17,0^/oO.Sitosowana jako substancje wyjsciowa kulture posiewowa otrzymuje sie w sposób nizej podany.Pozywke zawierajaca w przeliczeniu na 1 litr 2)0 g glikozy, 2 g peptonu, 2 g wyciagu slodowego, 2 g wyciagu drozdzowego, 2gKH2P04l5 2gMgS04. • 7H20,„ 115 g agaru i wode odmineralizowana,, za- sizczejpia sie szczepem NRRL 543(3 i inkubuje sie w ciagu co najmniej 10 dini w temperaturize 21°C.Wyrosnieta na tej pozywce grzybnie dysperguje sie w fizjologicznym roztworze soli kuchennej. Tak otrzymana zawiesine girizylbni i zarodników zaszcze¬ pia sie 1 litr pozywki kultury wstejpnej, zawieraja¬ cej w litrze 1'OiO g sacharozy, 3 g szczawianu amo¬ nu, liO g Proflo, 1 g Ca(N03)2 • 4H^OB 215:0 mg MgSC4 • 7H20, 2(5(0 mg KH^O^ 125 mg KO, 16,6 mg FeS04.7H2O, fy9 mg 2nS04 : 7H20, 10 mgl H2S04 (8$—&P/o) i wóde odmineralliizowana i inku¬ buje sie w temiperaturze 24°C, wsltrzacaljac, w cia¬ gu 2 dni.Do 1 litra pozywki kultury posiewowej o takim skladzie, jak kultura wstepna, wiprowadza sie 100 ml wyzej otrzymanej zawiesiny i inkulbuje sie w temperatuzre 27°C, wstrzasajac, w ciagu 2 dni. PL