DE2336550C3 - Verfahren zur Reinigung von p-Glutamylhistidylprolinamid - Google Patents
Verfahren zur Reinigung von p-GlutamylhistidylprolinamidInfo
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0821—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp
- C07K5/0825—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp and Glp-amino acid; Derivatives thereof
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Description
30
p-Glutamylhistidylprolinamid, das gewöhnlich als
»thyrotropin release hormone« (die Bildung und Ausschüttung von Thyreotropin anregendes Hormon) oder
THR bezeichnet wird, spielt eine wichtige Rolle für die Diagnose von Funktionsstörungen der Schilddrüse und
wird in neuerer Zeit auch therapeutisch als Hormonstimulans verwendet Leider wird bei den bisher iur synthetischen
Herstellung von TRH bekannten Verfahren nur ein Tripeptid von mäßiger Aktivität gebildet, es sei
denn, daß auf die Synthese eine sorgfältige Reinigung folgt. Von den bisher bekannten Reinigungen erweist
sich die Chromatographie allein als erfolgreich in bezug auf Entfernung der verschiedenen Salze und nicht
umgesetzten Amine und Aminosäuren, die mit TRH während des synthetischen Aufbaues des Moleküls angehäuft
werden. Diese chromatographischen Verfahren sind jedoch umständlich und führen gewöhnlich nicht
zu einem reinen Material, wenn nicht die Produktlösung mehrmals über die gleiche Säule oder über mehrere
Säulen, die verschiedene Packungsmaterialien enthalten, geführt sind.
Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein einfaches Verfahren zur Reinigung von TRH, bei dem keine
Chromatographiesäulen verwendet werden und das es ermöglicht, hochreines TRH wirtschaftlich und schnell
aus einem rohen Reaktionsgemisch, das diese Verbindung enthält, zu erhalten.
Das Verfahren gemäß der Erfindung zur Isolierung von reinem TRH aus einem rohen Reaktionsgemisch,
das das TRH enthält, ist dadurch gekennzeichnet, daß man durch Behandlung einer klären wäßrigen Lösung
des Reaktionsgemisches mit einem in einer Menge von wenigstens 0,4 g/g TRH verwendeten stark sauren Kat- I
ionenaustauscherharz, das nukleare Sulfonsäureaus- ' tauschgruppen enthält, die an eine teilweise vernetzte '
Styrolpolymermatrix gebunden sind, ein Harzadsorbat bildet, die Flüssigphase aus dem Harzadsorbat entfernt,
das Harzadsorbat in einer wäßrigen Lösung einer, flüchtigen wasserlöslichen Base mit einem pH-Wert
zwischen 9 und 12 abspaltet, das Harz aus der wäßrigen Lösung entfernt und das TRH aus der Lösung entfernt
und das TRH aus der Lösung isoliert Für die Zwecke dieser Beschreibung basieren alle Harzmengen auf dem
Trockengewicht des Harzes, falls nicht anders angegeben, und der Ausdruck »flüchtig« bedeutet daß der
Dampfdruck der betreffenden Verbindung über dem des Wassers liegt.
Das vorstehend genannte Styrolpolymerisat kann mit den verschiedensten sonst inerten copolymerisierenden
Materialien vernetzt sein, jedoch wird meistens Divinylbenzol für diesen Zweck verwendet Eine Anzahl
von im Handel erhältlichen Harzen fällt unter die vorstehende Definition, z. B. das »Bio-Rad· «lonenaustauscherharz
der Reihe AG-50, hergestellt von den Bio-Rad Laboraties, Richmond, California; die Reihe
»Dowex· 50-X«, hergestellt von der Dow-Chemical CoM Midland, Michigan; die »Duolite· «-Harzreihe
C-20, C-25D und 25X, hergestellt von Üiamond-Sham rock, Cleveland, Ohio; die »Amberlitc· «-Reihe IR-112
bis 1R-124, hergestellt von RohmAHaas Co. Philadelphia,
Pennsylvania; die Reihe »Zeocarb· « 225, hergestellt von der Permutil Company of England; die Reihe
Q-100 bis Q-130 der lonac Chemical Co., Birmingham,
New Jersey, und die Harze^alcite^HCR, HGR und
HDR, hergestellt von der Nalco Chemical Company, Chicago, Illinois. Weitere Materialien, die unter die vorstehende
Definition fallen, werden in »lon Exchangers in Organic and Biochemistry« von C h a 1 m ο η ν*1
K r e s s m a η (herausgegeben von Interscience Publishers, Inc., 1957) auf S. 116 ff. genannt Da alle diese Harze
ungefähr das gleiche Kationenbindevermögen haben, sind sie austauschbar verwendbar. Sie können auch
in allen verschiedenen Feinheitsgraden, d. h. grob, fein oder superfein, verwendet werden. Um das erforderliche
Bindevermögen für 1 g des im Reaktionsgemisch vorhandenen TRH zu erreichen, müssen wenigstens
etwa 0,4 g des trockenen Austauscherharzes verwendet werden. Die obere Grenze der Menge wird hauptsächlich
durch wirtschaftliche Erwägungen bestimmt Mengen, die über einem Gewichtsverhältnis von Harz zu
TRH von 10:1 liegen, wären in wirtschaftlicher Hinsicht unzweckmäßig. Ein bevorzugter, brauchbarer und
zweckmäßiger Bereich des Verhältnisses von Harz zu TRH liegt zwischen 0,4 und 5,0 g trockenem Harz pro
Gramm TRH.
Als wasserlösliche Basen werden für die Abspaltung des TRH vom Harz vorzugsweise Ammoniak und Trimethyliimin
oder Triäthylamin verwendet, jedoch können auch andere Basen, die einen höheren Dampfdruck
als Wasser haben, statt dessen verwendet werden. Die Isolierung von TRH aus der wäßrigen Lösung kann in
verschiedener Weise erfolgen. Eine einfache Methode ist die Gefriertrocknung der wäßrigen Lösung, die das
gereinigte TRH enthält. Gebenenfalls kann jedoch die das reine TRH enthaltende wäßrige Lösung auch nach
anderem Methoden aufgearbeitet werden, z. B. durch Entfernung der wäßrigen Phase durch Vakuumdestillation
oder nach ähnlichen Verfahren, die zur Abtrennung des gelösten Stoffes aus dem Lösungsmittel bekannt
sind, beispielsweise durch Dialyse oder durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, in
dem TRH unlöslich ist.
In einer allgemeinen Ausführungsform wird die Erfindung
wie folgt durchgeführt: Das Reaktionsgemisch, das TRH enthält wird in Wasser gelöst und filtriert
Das wäßrige Filtrat wird mit der geeigneten Menge
eines Kationenaustauscherharzes des vorstehend beschriebenen Typs behandelt. Die Flüssigphase wird
dann verworfen und das Harz, an dem das TRH adsorbiert
ist, gewaschen und anschließend in Wasser gegeben und einige Minuten mit einer flüchtigen wäßrigen
Base bei einem pH-Wert zwischen 9 und 12 gerührt. Das Harz wird dann abfiltriert. Das zurückbleibende
Fütrat und die Waschflüssigkeiten werden vereinigt und durch Entfernung der wäßrigen Phase durch Destillation
oder durch Gefriertrocknung aufgearbeitet.
Das Verfahren gemäß der Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.
15
In 4 ml Wasser wurden 0,5 g eines rohen Reaktionsgemisches gelöst, das TRH und verunreinigende Salze
und Dipeptide enthielt. Die Lösung wurde einige Minuten bei Raumtemperatur gerührt, worauf 2,5 g des
lonenaustauscherharzes »Amberlite· IR-120«, das mit verdünnter Schwefelsäure und destilliertem Wasser
vorgewaschen worden war, zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde 5 Minuten gerührt, mit 4 ml Methanol verdünnt
und filtriert. Die feste Phase wurde mehrmals mit wäßrigem Methanol gewaschen. Die vereinigten
' Waschflüssigkeiten und das vorherige Filtrat wurden verworfen.
Das Harz, an dem das TRH adsorbiert war, wurde dann etwa 8 Minuten mit 10 ml 30%igem wäßrigem
Triäthylamin gerührt. Das Gemisch wurde filtriert. Das Harz wurde mit 20 ml wäßrigem Methanol und anschließend
zweimal mit 30%igem wäßrigem Triäthylamin gewaschen. Alle Filtrate und die Waschflüssigkeiten
wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft, wobei 0,33 g eines festen Rückstandes erhalten
wurden. Die chemischen und biologischen Analysen ergaben, daß das in dieser Weise erhaltene Material
aus TRH einer Reinheit von 98% bestand.
Der vorstehend beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch kein Methanol, sondern statt
dessen Wasser in jedem Fall verwendet wurde. Das gleiche Ergebnis wie oben wurde erhalten, jedoch ging
die Einengung unter vermindertem Druck langsamer vonstatten.
Beispiel 2
45
In 190 ml Wasser wurden 10 g rohes TRH1 das verunreinigende
Salze und Dipeptide enthielt, gelöst. Die Lösung wurde 3 Stunden mit 70 g des lonenaustau- so
scherharzes »Dowex· -50« (auf nasser Basis), das auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise vorgewaschen
worden war, gerührt. Das Gemisch wurde dann filtriert und das Harz mit 600 ml Wasser in drei gleichen Teilen
und anschließend mit 600 ml Methanol gewaschen.
Das Harzadsorbat wurde dann in 400 ml 1-molarem wäßrigem Ammoniak 8 Stunden aufgeschlämmt. Das
Gemisch wurde filtriert. Das Harz wurde dreimal mit IN Ammoniak gewaschen, das in einer Menge verwendet
wurde, die gerade genügte, um das Harz zu bedekken. Die vereinigten Filtrate und Waschflüssigkeiten
wurden unter vermindertem Druck eingedampft, wobei 6,2 g eines weißen festen Rückstandes erhalten wurden.
Die chemische Analyse ergab, daß dieses Produkt aus TRH einer Reinheit von 98% bestand. Das bei diesem
Versuch verwendete Ausgangsmaterial enthielt zwar eine erhebliche Menge an Dipeptiden, jedoch war das
Endprodukt im wesentlichen frei von Pepiiden.
Die vorstehend genannten Kationenaustauscherharze haben im trockenen Zustand ein Austauschvermögen
von etwa 5 Mi!!iäquivalent/g. In ihrem nassen Zustand haben sie ein Austauschvermögen zwischen 0,4
und 2,6 Milliäquivalent/ml, so daß ein viel größeres Volumen
des Harzes verwendet werden muß. Der vorstehend genannte bevorzugte Bereich von 0,4 bis 5 g
(trockenem) Harz pro Gramm TRH ändert sich daher beim nassen Harz in 0,75 bis 10 ml/g TRH in Abhängigkeit
von dem Grad der »Quellung« oder vom Wassergehalt des Harzes. Die Teilchengröße dieses Harzes
liegt gewöhnlich zwischen 840 und 37 μ. Vorzugsweise wird ein für die leichte Filtration vorteilhaftes Harz
verwendet, das eine Teilchengröße zwischen 840 und 149 μ hai.
Die für die Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung geeigneten Harze können sich ίη ihrem Vernetzungsgrad
etwas unterscheiden. Die meisten der vorstehen^ genannten Harze sind mit Divinylbenzol zu
1 bis 16% vernetzt, jedoch können auch ähnliche zweifach ungesättigte Materialien für die teilweise Vernetzung
der Polystyrolmatrix verwendet werden. Es ist gewöhnlich angezeigt, eine größere Harzmenge zu verwenden,
wenn die Vernetzung am oberen Ende des vorstehend genannten Verhältnisses liegt. Die Verwendung
eines Styrolpolymerisats, das zu mehr als 10% vernetzt ist, ist auf Grund seiner verringerten Fähigkeit,
das Peptid zu adsorbieren, weniger vorteilhaft. Gegebenenfalls können jedoch solche Harze verwendet
werden, indem ihre Menge aus der oberen Hälfte des vorstehend genannten Bereichs gewählt wird.
Bei der Entfernung des TRH vom Harz bestimmt die Stärke der verwendeten flüchtigen Base die Geschwindigkeit
dieser Abspaltung. Mit einer starken Base, z. B. Trimethylamin, genügen wenige Minuten, um diese Stufe
zu vollenden, während bei Verwendung einer schwachen Base, z.B. 1Λ/Ammoniak, eine Rührdauer von
einigen Stunden erforderlich ist. In jedem Fall kann die Reaktion leicht verfolgt werden, indem aliquote Teile
des Gemisches auf ihren TRH-Gehalt analysiert werden.
Das neue Verfahren zur Reinigung von TRH hat außer seiner Einfachheit und Zuverlässigkeit den weiteren
Vorteil, daß es äußerst wirtschaftlich ist. Mit einer geeigneten Wäsche kann das Harz regeneriert und für
zahlreiche weitere Chargen wiederverwendet werden. Da dieses neue Verfahren keine Spezialapparaturen
und keine teuren Chemikalien erfordert, kann es in jedem beliebigen Maßstab sowohl für die Herstellung
einer kleinen Menge im Laboratorium als auch für die Großherstellung angewandt werden. Das Verfahren
läßt sich auch ohne weiteres kontinuierlich gestalten, wobei jedoch verfeinerte und kompliziertere Apparaturen
erforderlich sind.
Claims (2)
1. Verfahren zur Reinigung von p-Glutamylhistidylprolinamid,
das in einem rohen Reaktionsgemisch enthalten ist, dadurch gekennzeichnet,
daß man durch Behandlung einer klaren wäßrigen Lösung des Reaktionsgemisches mit einem in
einer Menge von wenigstens 0,4 g/g p-Glutamylhistidylprolinamid
verwendeten stark sauren Kationenaustauscherharz, das nukleare Sulfonsäureaustauschgruppen
enthält, die an eine teilweise vernetzte Styrolpolymermatrix gebμndeι^ sind, ein
Harzadsorbat bildet die Flüssigphase aus dem Harzadsorbat entfernt, das Harzadsorbat in einer
wäßrigen Lösung einer flüchtigen wasserlöslichen Base mit einem pH-Wert zwischen 9 und 12 abspaltet,
das Harz aus der wäßrigen Lösung entfernt und das p-Glutamylhistidyiprolinamid aus der Lösung
isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Kationenaustauscherharz
in einer Menge von 0,4 bis 5,0 g (Trockengewicht) pro Gramm des im rohen Reaktionsgemisch
enthaltenen p-Glutamylhistidy!prolinamid verwendet v/ird.
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