DE2336550A1 - Verfahren zur reinigung von p-glutamylhistidylprolinamid - Google Patents

Description

PATENTANWALT DR. HANS-GUNTHER EGGERT₁ DIPLOMCHEMIKER

5 KÖLN Sl, OBERLÄNDER UFER 90

Köln, den 17. Juli 1973 Eg/Ax/lo9

Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois 6oo64

Verfahren zur Reinigung von p-Glutamylhistidylprolinamid

p-Glutamylhistidylprolinamid, das gewöhnlich als "thyrotropin release hormone" (die Bildung und Ausschüttung von Thyreotropin anregendes Hormon) oder TRH bezeichnet wird, spielt eine wichtige Rolle für die Diagnose von Punktionsstörungen der Schilddrüse und wird in neuerer Zeit auch therapeutisch als Hormonstimulans verwendet. Leider wird bei den bisher zur synthetischen Herstellung von TRH bekannten Verfahren nur ein Tripeptid von mäßiger Aktivität gebildet, es sei denn, daß auf die Synthese eine sorgfältige Reinigung folgt. Von den bisher bekannten Reinigungen erweist sich die Chromatographie allein als erfolgreich in Bezug auf Entfernung der verschiedenen Salze und nicht umgesetzten Amine und Aminosäuren, die mit TRH während des synthetischen Aufbaues des Moleküls angehäuft werden. Diese chromatographischen Verfahren sind jedoch umständlich und führen gewöhnlich nicht zu einem reinen Material, wenn nicht die Produktlösung mehrmals über die gleiche Säule oder über mehrere Säulen, die verschiedene Packungsmaterialien enthalten, geführt wird.

Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein einfaches Verfahren zur Reinigung von TRH, bei dem keine Chromatögraphiesäulen verwendet werden, und das es ermöglicht,

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hochreines TRH wirtschaftlich und schnell aus einen; rohen Reaktionsgemisch, das diese Verbindung enthält, zu erhalten.

Das Verfahren gemäß der Erfindung zur Isolierung von reinem TRH aus einem rohen Reaktionsgemiscb, das das TRH enthält, ist dadurch gekennzeichnet, daß nan durch Behandlung einer klaren wässrigen Lösung des Reaktionsgemisches mit einem in einer Menge von wenigstens 0,4- g/g TRH verwendeten stark sauren Kationenaustauscherharz, das nukleare Sulfonsäureaustauschgruppen enthält, die an eine teilweise vernetzte Styrolpolymermatrix gebunden sind, ein Harzadsorbat bildet, die Flüssigphase aus dem Harzadsorbat entfernt, das Harzadsorbat in einer wäßrigen Lösung einer flüchtigen wasserlöslichen Base mit einem pjj-Wert zwischen 9 und 12 abspaltet, das Harz aus der wäßrigen Lösung entfernt und das TRH aus der LösunR entfernt und das TRH aus der Lösung isoliert. FUr die üwooko dieser Beschreibung basieren alle Harzmengen auf dein Trokkengewicht des Harzes, falls nicht anders angegeben, und der Ausdruck "flüchtig" bedeutet, daß der Dampfdruck der betreffenden Verbindung über dem des Wassers liegt.

Das vorstehend genannte Styrolpolymeriaat kann mit den verschiedensten sonst inerten copolymerisierenden Materialien vernetzt sein, jedoch wird meistens Divinylbenzol für diesen Zweck verwendet. Eine Anzahl von in Handel erhältlichen Harzen fällt unter die vorstehende Definition, z.B. das "Bio-rRad"-Ionenaustauscherharz der Reihe AGr-50, hergestellt von den Bio-Rad Laboratories, Richmond, California; die Reihe "Dowex 50-X", hergestellt von der Dow Chemical Co., Midland, Michigan; die Duolite-Harzreihe C-20, C-25D und 25X, hergestellt von DiaEond-Shamrock, Cleveland, Ohio; die Amberlite-Reihe IR-112 bis IR-124, hergestellt von Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania; die Reihe Zeocarb 225, hergestellt von der Permutit Company of England; die Reihe Q-100 bis Q-15C

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der Ionac Chemical Go,, Birmingham, New Jersey, und die Harze Nalcite HCR, HGR und HDR, hergestellt von der Nalco Chemical Company, Chicago, Illinois« Weitere Materialien, die unter die vorstehende Definition fallen, werden in "Ion Exchangers in Organic and Biochemistry" von Calmon und Kressman (herausgegeben von Interscience Publishers, Inc., 1957) auf Seite 116 ff. genannt. Da alle diese Harze ungefähr das gleiche Kationenbindevermögen haben, sind sie austauschbar verwendbar. Sie können auch in allen verschiedenen Reinheitsgraden, d.h. grob, fein oder superfein, verwendet werden. Um das erforderliche Bindevermögen für 1 g des im Reaktionsgemisch vorhandenen TRH zu erreichen, müssen wenigstens etwa 0,4 £ des trockenen Austauscherharzes verwendet werden. Die obere Grenze der Menge wird hauptsächlich durch wirtschaftliche Erwägungen bestimmt. Mengen, die über einem Gewichtsverhältnis von Harz zu TRH von 10:1 liegen, wären in wirtschaftlicher Hinsicht unzweckmäßig. Ein bevorzugter, brauchbarer und zweckmäßiger Bereich des Verhältnisses von Harz zu TRH liegt zwischen 0,4 und 5»0 g trockenem Harz pro Gramm TRH.

Als wasserlösliche Basen werden für die Abspaltung des TRH vom Harz vorzugsweise Ammoniak und Trimethylamin oder Triäthylamin verwendet, jedoch können auch andere Basen, die einen höheren Dampfdruck als Wasser haben, statt dessen verwendet werden. Die Isolierung von TRH aus der wässrigen Lösung kann in verschiedener Weise erfolgen. Eine einfache Methode ist die Gefriertrocknung der wässrigen Lösung, die das gereinigte TRH enthält. Gegebenenfalls kann jedoch die das reine TRH enthaltende wässrige Lösung auch nach anderen Methoden aufgearbeitet werden, z.B. durch Entfernung der wässrigen Phase durch Vakuumdestillation oder nach ähnlichen Verfahren, die zur Abtrennung des gelösten Stoffs aus dem Lösungsmittel bekannt sind, beispielsweise durch Dialyse oder durch

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Zugabe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, in dem TRH unlöslich ist.

In einer allgemeinen Ausführungsform wird die Erfindung wie folgt durchgeführt: Das Reaktionsgemisch, das TRH enthält, wird in Wasser gelöst und filtriert. Das wässrige Filtrat wird mit der geeigneten Menge eines Kationenaustauscherharz des vorstehend beschriebenen Typs behandelt. Die Flüssigphase wird dann verworfen und das Harz, an dem das TRH adsorbiert ist, gewaschen, anschliessend in Wasser gegeben und einige Minuten mit einer flüchtigen wässrigen Base bei einem p_H-Wert zwischen 9 und 12 gerührt. Das Harz wird dann abfiltriert. Das zurückbleibende Filtrat und die Waschflüssigkeiten werden vereinigt und durch Entfernung der wässrigen Phase durch Destillation oder durch Gefriertrocknung aufgearbeitet.

Das Verfahren gemäß der Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1

In 4 ml Wasser wurden 0,5 g eines rohen Reaktionsgemisches gelöst, das TRH und verunreinigende Salze und Dipeptide enthielt. Die Lösung wurde einige Minuten bei Raumtemperatur gerührt, worauf 2,5 g des Ionenaustauscherharzes "Amberlite IR-120", das mit verdünnter Schwefelsäure und destilliertem Wasser vorgewaschen worden war, zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde 5 Minuten gerührt, mit 4 ml Methanol verdünnt und filtriert. Die feste Phase wurde mehrmals mit wässrigem Methanol gewaschen. Die vereinigten Waschflüssigkeiten und das vorherige Filtrat wurden verworfen.

Das Harz, an dem das TRH adsorbiert war, wurde dann etwa 8 Minuten mit 10 ml 30^igem wässrigem Triäthylamin gerührt. Das Gemisch wurde filtriert. Das Harz wurde mit 20 ml wässrigem Methanol und anschließend zweimal mit 30yügem wässrigem Triäthylamin gewaschen. Alle Filtrate

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und die Waschflüssigkeiten wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft, wobei 0,33 g eines festen Rückstandes erhalten wurden· Die chemischen und biologischen Analysen ergaben, daß das in dieser Weise erhaltene Material aus TRH einer Reinheit von 98$ bestand·

Der vorstehend beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch kein Methanol, sondern statt dessen Wasser in jedem Fall verwendet wurde. Das gleiche Ergebnis wie oben wurde erhalten, jedoch ging die Einengung unter vermindertem Druck langsamer vonstatten.

Beispiel 2

In 190 ml Wasser wurden 10 g rohes TRH, das verunreinigende Salze und Dipeptide enthielt, gelöst. Die Lösung wurde 3 Stunden mit 70 g des Ionenaustauscherharzes "Dowex-50" (auf nasser Basis), das auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise vorgewaschen worden war, gerührt· Das Gemisch wurde dann filtriert und da3 Harz mit 600 ml Wasser in drei gleichen Teilen und anschließend mit 600 ml Methanol gewaschen.

Das Harzadsorbat wurde dann in 4-00 ml 1-molarem wässrig em Ammoniak 8 Stunden aufgeschlämmt. Das Gemisch wurde filtriert. Das Harz wurde dreimal mit "TN Ammoniak: gewaschen, das in einer Menge verwendet wurde, die gerade genügte, um das Harz zu bedecken. Die vereinigten Filtrate und Waschflüssigkeiten wurden unter vermindertem Druck eingedampft, wobei 6,2 g eines weißen festen Rückstandes erhalten wurden. Die chemische Analyse ergab, daß dieses Produkt aus TRH einer Reinheit von 98$ bestand. Das bei diesem Versuch verwendete Ausgangsmaterial enthielt zwar eine erhebliche Menge an Dipeptiden, jedoch war das Endprodukt im wesentlichen frei von Peptiden.

Die vorstehend genannten Kationenaustauscherharze haben im trockenen Zustand ein Austauschvermögen von etwa 5 Milliäquivalent/g. In ihrem nassen Zustand haben- sie

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ein Austauschvermögen zwischen 0,4 und 2,6 Milliäquivalent/ml, so daß ein viel größeres Volumen des Harzes verwendet werden muß. Der vorstehend genannte bevorzugte Bereich von 0,4 "bis 5 g (trockenem) Harz pro Gramm TRH ändert sich daher "beim nassen Harz in 0,75 bis 10 ml/g TRH in Abhängigkeit von dem Grad der "Quellung" oder vom Wassergehalt des Harzes, Die Teilchengröße dieses Harzes liegt gewöhnlich zwischen 840 und 37 /U. Vorzugsweise wird ein für die leichte Filtration vorteilhaftes¹ Harz verwendet, das eine Teilchengröße zwischen 840 und 149 p. hat (Durchgang durch ein Sieb dieser Maschenweite) hat.

Die für die Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung geeigneten Harze können sich in ihrem Vernetzungsgrad etwas unterscheiden. Die meisten der vorstehend genannten Harze sind mit Divinylbenzol zu 1 bis 16% vernetzt, jedoch können auch ähnliche zweifach ungesättigte Materialien für die teilweise Vernetzung der Polystyrolmatrix verwendet werden. Es ist gewöhnlich angezeigt, eine größere Harzmenge zu verwenden, wenn die Vernetzung am oberen Ende des vorstehend genannten Verhältnisses liegt. Die Verwendung eines Styrolpolymerisats, das zu mehr als 10j6 vernetzt ist, ist auf Grund seiner verringerten Fähigkeit, das Peptid zu adsorbieren, weniger vorteilhaft. Gegebenenfalls können jedoch solche Harze verwendet werden, indem ihre Menge aus der oberen Hälfte des vorstehend genannten Bereichs gewählt wird.

Bei der Entfernung des TRH vom Harz bestimmt die Stärke der verwendeten flüchtigen Base die Geschwindigkeit dieser Abspaltung. Mit einer starken Base, z.B. Trimethylamin, genügend wenige Minuten, um diese Stufe zu vollenden, während bei Verwendung einer schwachen Base, z.B. 1N Ammoniak, eine Rührdauer von einigen Stunden erforderlich ist. In jedem Fall kann die Reaktion leicht verfolgt werden, indem aliquote Teile des Gemisches auf ihren TRH-Gehalt analysiert werden.

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Das neue Verfahren zur Reinigung von TRH hat außer seiner Einfachheit und Zuverlässigkeit den weiteren Vorteil, daß es äußerst wirtschaftlich ist. Mit einer geeigneten Wäsche kann das Harz regeneriert und für zahlreiche weitere Chargen wiederverwendet werden. Da dieses neue Verfahren keine äpezialapparaturen und keine teuren Chemikalien-erfordert, kann es in jedem "beliebigen Maßstab sowohl-für die Herstellung einer kleinen Menge im Laboratorium als auch für die Großherstellung angewandt werden· Das Verfahren läßt sich auch ohne weiteres kontinuierlich gestalten, wobei jedoch verfeinerte und kompliziertere Apparaturen erforderlich sind«

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Claims (6)

1. Patentans priAche

   (1.» Verfahren zur Reinigung von TRH, das in einem rohen Reaktionsgemisch enthalten ist, dadurch gekennzeichnet, daß man durch Behandlung einer klaren wäßrigen Lösung des Reaktionsgemisches mit einem in einer Menge von wenigstens 0,4'g/g TRH verwendeten stark sauren Kationenaustauscherharz, das nukleare Sulfonsäureaus— tauschgruppen enthält, die an eine teilweise vernetzte Styrolpolymermatrix gebunden sind, ein Harzadsorbat bildet, die PlUssigphase aus dem Harzadsorbat entfernt, das Harzadsorbat in einer wäßrigen Lösung einer flüchtigen wasserlöslichen Base mit einem p_H-Wert zwischen 9 und 12 abspaltet, das Harz aus der wäßrigen Lösung entfernt und das TRH aus der Lösung isoliert.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Kationenaustauscherharz in einer Menge von 0,4 bis 5,0 g (Trockengewicht) pro Gramm des im rohen Reaktionsgemisch enthaltenen TRH verwendet wird.
3. 3· Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein mit 1 bis 10 Gew.-^ Divinylbenzol vernetztes Styrolpolymerisat verwendet wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis ^, dadurch gekennzeichnet, daß Ammoniak als wasserlösliche Base verwendet wird.
5. 5· Verfahren nach Anspruch 1 bis j5> dadurch gekennzeichnet, daß Triäthylamin als wasserlösliche Base verwendet wird.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5 j dadurch gekennzeichnet, daß das TRH durch Gefriertrocknung aus der gereinigten Lösung isoliert wird.

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