PL162944B1 - Sposób otrzymywania alkaloidów bisindolowych o dzialaniu cytostatycznym PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób otrzymywania alkaloidów bisindolowych o dzialaniu cytostatycznym z surowca roslinnego, zwlaszcza z lisci lub ziela Catharanthus roseus (L) G. Don. o niskiej zawartosci zwiazków czynnych, przez ekstrakcje za pomoca kwasu, znamienny tym, ze ekstrakcje prowadzi sie co najmniej trzykrotnie wodnym roztworem kwasu mineralnego przy pH 2,0-3,5, w tempera- turze 10-20°C, po czym kwasny ekstrakt poddaje sie sorpcji na zywicy o malej polarnosci do calkowitego zaadsorbowania zasad alkaloidowych, nastepnie sorbent przemywa sie woda, wodnym roztworem amoniaku, powtórnie woda i zasady desorbuje sie acetonem, który odpa- rowuje sie z równoczesnym przeprowadzeniem zasad alkaloidowych w ich cytryniany, z których po ekstrakcji i wstepnym oczyszczeniu wytraca sie surowe siarczany alkaloidów bisindolowych, które rozdziela sie chromatograficznie, uzyskujac alkaloidy w postaci wolnych zasad, po czym ewentualnie przeprowadza sie je w sole winblastyny i winkrystyny. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania alkaloidów bisindolowych o działaniu cytostatycznym z surowca roślinnego, zwłaszcza z liści lub ziela Catharanthus roseus (L) G. Don. o wyjątkowo niskiej zawartości związków czynnych.

Do alkaloidów bisindolowych izolowanych w sposobie według wynalazku z rośliny Catharanthus roseus - C.r. należą winblastyna - VLB i winkrystyna - VCR, których sole, zwłaszcza siarczany są stosowane w chemioterapii przeciwnowotworowej. Siarczan winblastyny hamuje metabolizm komórek na etapie przemiany kwasu glutaminowego i cyklu kwasu cytrynowego i aplikuje się go przede wszystkim w ziarnicy złośliwej jako składnik terapii wielolekowych. Siarczan winkrystyny jest środkiem cytostatycznym, powodującym hamowanie mitozy w jej metafazie i stosuje się go w wielu chorobach nowotworowych, szczególnie w ostrej białaczce limfatycznej u dzieci.

Oba alkaloidy uzyskuje się dotychczas przez ich izolację z C.r. na drodze wieloetapowej ekstrakcji i chromatografii kolumnowej.

Znany z węgierskiego opisu patentowego nr 160 967 sposób wyodrębniania VLB i VCR polega na ekstrakcji liści C.r. roztworami wodno-alkoholowymi w środowisku obojętnym, odpędzeniu alkoholu w próżni, reekstrakcji przy zmiennym pH za pomocą benzenu, wytrąceniu surowych siarczanów alkaloidów bisindolowych i następnym rozdziale alkaloidów przez chromatografię na tlenku glinowym, częściowo zdezaktywizowanym przez przemycie rozcieńczonym kwasem octowym. W sposobie tym zużywa się jednak bardzo duże ilości rozpuszczalników. I tak w przeliczeniu na 1 kg surowca zużywa się 141 i 90% metanolu oraz 391 benzenu, z 1 kg liści C.r. otrzymuje się 7,0 g surowej frakcji zasadowej, z której wytrąca się 0,20-1,0 g surowych siarczanów alkaloidów bisindolowych, a stąd 0,15-0,75 g siarczanu VLB i 0,006-0,03 g siarczanu VCR.

Według belgijskiego opisu patentowego nr 867 670 ekstrakcję surowca roślinnego prowadzi się w środowisku kwaśnym, rozpuszczalnikami hydroksylowymi lub ich mieszaninami z rozpuszczalnikami węglowodorowymi. Uzyskane w wyniku ekstrakcji podstawowe wyciągi, po zagęszczeniu poddaje się następnie wieloetapowej i żmudnej ekstrakcji ciecz - ciecz, w celu oddzielenia większości balastowych alkaloidów monoindolowych, a alkaloidy bisindolowe o działaniu cytostatycznym wytrąca się w postaci siarczanów z frakcji uzyskanej przez ekstrakcję przy określonej wartości pH.

162 944

Według innych opisów patentowych podstawowy wyciąg alkaloidowy frakcjonuje się przez chromatografię na tlenku glinowym, Sephadexie (na przykład według wyłożeniowego opisu patentowgo RFN nr 2 442 245) lub Bondapacku (patrz indyjski opis patentowy nr 154 331). Wydzielone alkaloidy przeprowadza się w ich trwalsze siarczany, rozdziela chromatograficznie i/lub oczyszcza przez krystalizację.

Wydajność wagowa uzyskiwanych z C.r. siarczanów alkaloidów bisindolowych uzyskiwana znanymi sposobami wynosi w zależności od użytego surowca: VLB.H 2 SO4 15-75 X 103%-2528 X 10-²%, VCR.H2SO4 6-30 X 10^_4%.

Znacznym utrudnieniem procesu jest równoczesna z alkaloidami ekstrakcja balastowych związków powierzchniowo czynnych, które powodują powstawanie uciążliwych emulsji przy rozdziale podczas ekstrakcji.

Znane sposoby izolacji alkaloidów bisindolowych zawodzą w przypadku surowca, w którym zawartość składników czynnych jest o rząd wielkości niższa, jak na przykład w liściach i zielu Catharanthus roseus uprawianego w warunkach klimatycznych Polski.

Okazało się, że sposobem według wynalazku można otrzymać alkaloidy bisindolowe, tj. winblastynę i winkrystynę z surowca o bardzo niskiej ich zawartości z równoczesnym korzystnym uproszczeniem procesu podczas oczyszczania oraz bez konieczności stosowania dużych ilości rozpuszczalników.

Ponadto uciążliwe balasty powierzchniowo czynne usuwa się już w pierwszej fazie wyodrębniania alkaloidów, co znacznie ułatwia rozdzielanie faz w dalszych etapach procesu.

Sposób otrzymywania alkaloidów bisindolowych o działaniu cytostatycznym z surowca roślinnego o niskiej zawartości związków czynnych, zwłaszcza z liści lub ziela Catharanthus roseus (L) G. Don. na drodze ekstrakcji kwasem według wynalazku polega na tym, że ekstrakcję prowadzi się co najmniej trzykrotnie wodnym roztworem kwasu mineralnego przy pH 2,0-3,5, w temperaturze 10-20°C, po czym kwaśny ekstrakt poddaje się sorpcji na żywicy o małej polarności do całkowitego zaadsorbowania zasad alkaloidowych, następnie sorbent przemywa się wodą, wodnym roztworem amoniaku, powtórnie wodą i zasady desorbuje się acetonem, który odparowuje się i równocześnie przeprowadza w ich cytryniany przy użyciu kwasu cytrynowego. Wodny roztwór cytrynianów o niewielkiej objętości i pozbawiony nadmiaru powierzchniowo czynnych balastów stanowi podstawowy wyciąg alkaloidowy, z którego po ekstrakcji uzyskuje się frakcję alkaloidową. Z frakcji tej wytrąca się surowe siarczany alkaloidów bisindolowyh, które rozdziela się chromatograficznie uzyskując alkaloidy w postaci wolnych zasad, po czym ewentualnie przeprowadza się je w sole winblastyny i winkrystyny.

Jako kwas mineralny w sposobie według wynalazku stosuje się korzystnie kwas siarkowy, kwas solny i kwas fosforowy.

Jako żywicę o małej polarności stosuje się niejonową żywicę polistyrenową. Stosuje się zwłaszcza żywice o nazwach handlowych Diaion HP-20, Amberlite XAD-2, XAD-4 i ER-181. Ilości stosowanej w sposobie według wynalazku żywicy, a także rozpuszczalnika do desorpcji i wody do przemywania zależą od jakości użytego surowca.

Różna zdolność adsorpcyjna mono- i bisindolowych zasad na żywicy powoduje, że w sposobie według wynalazku podstawowy wyciąg alkaloidowy jest już wstępnie wzbogacony w aktywne alkaloidy o działaniu cytostatycznym. Ich wydajność zależy od zastosowanego surowca i wynosi dla rośliny Catharanthus reseus pochodzącej z upraw w klimacie tropikalnym na 1 kg suchej masy. 15-20 X 10^_3% wagowego siarczanu winblastyny i 15-20 X 10-4% wagowego siarczanu winkrystyny, natomiast dla rośliny pochodzącej z upraw w warunkach klimatycznych Polski, odpowiednio 2-10X 10-3% wagowego siarczanu winblastyny i 1-8 X 10^% wagowego siarczanu winkrystyny.

Sposób otrzymywania alkaloidów bisindolowych o działaniu cytostatycznym według wynalazku jest prostszy w wykonaniu w stosunku do dotychczas stosowanych.

Zastosowanie w trakcie desorpcji równoczesnego przeprowadzania zasad alkoloidowych w trwalsze ich cytryniany, pozwala uniknąć znacznych strat, wrażliwych związków na skutek zetknięcia się ich z powietrzem.

162 944

Ponadto wszystkie operacje sposobu prowadzi się w temperaturze pokojowej, przy użyciu tanich i łatwo dostępnych rozpuszczalników. Oprócz tego stosowana w sposobie według wynalazku polistyrenowa żywica o małej polarności po prostej regeneracji, może służyć do wielokrotnego użycia.

Przedmiot wynalazku jest bliżej objaśniony w przykładach wykonania.

Przykład I. Rozdrobnione suche liście rośliny Catharanthus roseus z uprawy krajowej o masie 5 kg umieszcza się w kwasoodpornym naczyniu ekstrakcyjnym zaopatrzonym w mieszadło, nawilża wodą w stosunku 2 kg wody na 1 kg liści i pozostawia do napęcznienia na 18-24 godzin. Następnie dodaje się tyle wody, by zawartość naczynia mogła być swobodnie mieszana i mieszając, zakwasza się jego zawartość przy użyciu stężonego kwasu siarkowego - tak, by końcowe pH mieszaniny mieściło się w granicach 2,5-3,5, po czym przeprowadza się pierwszą ekstrakcję w temperaturze pokojowej, polegającą na mechanicznym mieszaniu całości przez 2 godziny i pozostawieniu na 20-24 godziny w celu sklarowania wyciągu i wytrącenia się chlorofilu.

Wyciąg dekantuje się i sączy przez filtr z bibuły twardej lub lniane płótno i od razu nanosi na kolumnę z żywicą. Ekstrakcję surowca prowadzi się jeszcze dwukrotnie, za każdym razem nastawiając pH mieszaniny pomiędzy 2,5 i 3,5. Ostatecznie otrzymuje się 140-1601 klarownego brunatnego roztworu, dającego dodatnie odczyny strątowe z testami na obecność alkaloidów (odczynnik Meyera i odczynnik Dragendorffa). Ekstrakty te sukcesywnie nanosi się na kolumnę z polistyrenową żywicą o małej polarności typu Diaion HP-20 o objętości złoża 1,6-2,01. Brak alkaloidów w wycieku stwierdza się testami jak wyżej.

Żywicę z zaadsorbowanymi alkaloidami przemywa się wodą, 2%-owym roztworem amoniaku, powtórnie wodą i prowadzi desorpcję acetonem, przepuszczając go z taką szybkością, by nie spowodować rozmycia pasm na kolumnie ze złożem. Do desorpcji używa się 6-81 acetonu, który przy wylocie kolumny zbierany jest porcjami do naczynia zawierającego wodny roztwór kwasu cytrynowego o takiej jego zawartości, by pH mieszaniny ustalało się na 3,0-4,0. Zebrane wodnoacetonowe eluaty zagęszcza się następnie pod próżnią do całkowitego odpędzenia acetonu. Pozostający ciemnobrunatny wyciąg wodno-kwaśny w ilości 1,0-1,5 litra stanowi podstawowy ekstrakt zawierający sumę alkaloidów bisindolowych i towarzyszące im alkaloidy monomeryczne, które rozdziela się w znany sposób przez dwukrotną ekstrakcję z fazy wodnej rozpuszczalnikami nie mieszającymi się z wodą przy pH roztworu odpowiednio 3 i 6. Z frakcji zawierającej alkaloidy bisindolowe wytrąca się najpierw leurozynę, następnie sumę siarczanów alkaloidów bisindolowych pod działaniem etanolowego roztworu kwasu siarkowego. Uzyskuje się 340 mg mieszaniny surowych siarczanów oraz 245 mg leurozyny.

Surowe siarczany alkaloidów bisindolowych rozdziela się w znany sposób przez chromatografię na kwaśnym tlenku glinowym, otrzymując 140 mg winblastyny oraz 13 mg winkrystyny, które w znany sposób przeprowadza się ponownie w ich siarczany. Otrzymuje się siarczan winblastyny, VLB. H 2 SO4 (C 46H 58 N4 O9 .H 2 SO4), masa cząsteczkowa 908,07 z wydajnością w stosunku do suchej masy 3,5 X 10^_3% wagowego, temperatura topnienia (z rozkładem) 283-285°C, skręcalność właściwa (σ)ο²² = -31° (c = 0,1 metanol) oraz siarczan winkrystyny, VCR.H2SO4 (C46H56W N 4 010· H2SO4), masa cząsteczkowa 923,06 z wydajnością 2,5 X 10^_4% wagowego, temperatura topnienia 276-279°C, skręcalność właściwa (α)ϋ²² = +9 (metanol).

Przykład II. Proces ekstrakcji 5kg suchych importowanych z Indii liści Catharanthus roseus prowadzi się jak w przykładzie I, stosując do ekstrakcji wodny roztwór kwasu solnego o pH w granicach 2,5-3,5 w temperaturze 10°C. Każdą porcję przesączonego wyciągu nanosi się sukcesywnie na żywicę polistyrenową XAD 4 w ilości 2,61, z równoczesną kontrolą wycieku na obecność alkaloidów za pomocą odczynników, jak w przykładzie I. Sorbent przemywa się wodą (3,01 ), wodnym 2%-owym roztworem amoniaku (1,21), wodą (2,01 ). Alkaloidy desorbuje się acetonem jak u przykładzie I, zbierając kolejne porcje eluatu od razu do wodnego roztworu zawierającego kwas cytrynowy w takiej ilości, by pH mieszaniny ustalało się na 3,0-3,8. Żywicę regeneruje się przemywając ją 80%-owym roztworem wodnym acetonu, metanolem, 2%-owym roztworem amoniaku do zaniku żółtego zabarwienia eluatu każdorazowo, a następnie wodą do odczynu obojętnego Otrzymuje się 725 mg leurozyny oraz 1,85 g mieszaniny surowych siarczanów alkaloidów bisindolowych, z których po rozdziale chromatograficznym wydziela się 0,88 g winblastyny oraz

162 944 mg winkrystyny, co stanowi odpowiednio 1,8 X 10³% wagowych w stosunku do suchej masy surowca. Winblastyna, C46H58N 4O9, masa cząsteczkowa 810.646, temperatura topnienia 213216°C (metanol), skręcalność właściwa (α)τ>^2Ζ = +42° Winkrystyna, C 46H 58 N 4 010, masa cząsteczkowa 824,78, temperatura topnienia 218-220°C (z rozkładem) skręcalność właściwa (o)d²2 = + 26° (chlorek etylenu).

Charakterystyka siarczanów otrzymanych zasad jak w przykładzie I.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 10 000 zł

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania alkaloidów bisindolowych o działaniu cytostatycznym z surowca roślinnego, zwłaszcza z liści lub ziela Catharanthus roseus (L) G. Don. o niskiej zawartości związków czynnych, przez ekstrakcję za pomocą kwasu, znamienny tym, że ekstrakcję prowadzi się co najmniej trzykrotnie wodnym roztworem kwasu mineralnego przy pH 2,0-3,5, w temperaturze 10-20°C, po czym kwaśny ekstrakt poddaje się sorpcji na żywicy o małej polarności do całkowitego zaadsorbowania zasad alkaloidowych, następnie sorbent przemywa się wodą, wodnym roztworem amoniaku, powtórnie wodą i zasady desorbuje się acetonem, który odparowuje się z równoczesnym przeprowadzeniem zasad alkaloidowych w ich cytryniany, z których po ekstrakcji i wstępnym oczyszczeniu wytrąca się surowe siarczany alkaloidów bisindolowych, które rozdziela się chromatograficznie, uzyskując alkaloidy w postaci wolnych zasad, po czym ewentualnie przeprowadza się je w sole winblastyny i winkrystyny.
2. 2. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że jako kwas mineralny stosuje się kwas siarkowy, kwas solny i kwas fosforowy.
3. 3. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że jako żywicę o małej polarności stosuje się niejonową żywicę polistyrenową.