DE1181859B

DE1181859B - Verfahren zur Gewinnung eines Trypsin-Inhibitors

Info

Publication number: DE1181859B
Application number: DEK44511A
Authority: DE
Inventors: Dipl-Chem Dr Walter Appel
Original assignee: Knoll GmbH
Current assignee: Abbott GmbH and Co KG
Priority date: 1961-08-16
Filing date: 1961-08-16
Publication date: 1964-11-19

Description

Verfahren zur Gewinnung eines Trypsin-Inhibitors Gegenstand des Hauptpatents 1168 605 ist ein Verfahren zur Gewinnung eines Trypsin-Inhibitors aus tierischen Organen, vorzugsweise aus Milz oder Lunge. Das Verfahren des Hauptpatents ist dadurch gekennzeichnet, daß man homogenisierte, den Trypsin Inhibitor enthaltende tierische Organe, vorzugsweise Milz oder Lunge, mit verdünnter -wäßriger Perchlorsäure extrahiert, die Lösung mit Kalium- oder Ammoniumcarbonat bzw. -bicarbonat neutralisiert, nach Abtrennung des Niederschlages die wäßrige Lösung bis fast zur Sättigung mit Ammoniumsulfat versetzt, die ausgefällten Anteile nach Abtrennung in Wasser löst und zunächst über einen Anionen- und dann über einen Kationenaustauscher laufen läßt, den Trypsin-Inhibitor aus letzterem mit Säuren eluiert und aus der Lösung die Säure vermittels eines Anionenaustauschers oder nach Neutralisieren,der Lösung durch Dextran-Gelfiltration entfernt.
Bei der weiteren Ausbildung dieses Verfahrens wurde gefunden, daß der gleiche Trypsin-Inhibitor in vereinfachter Weise aus den Inhibitor enthaltenden tierischen Organen, vorzugsweise Milz oder Lunge, auch dadurch gewonnen werden kann, daß- der gemäß Hauptpatent mit wäßriger Perchlorsäure erhaltene Extrakt nach Neutralisation mit Kalium- oder Ammoniumcarbonat bzw. -bicarbonat und- Abtrennung des Niederschlages direkt mit den Ionenaustauschern behandelt wird. Im Anschluß an diese Verfahrensverbesserung wird der Trypsin-Inhibitor wie im Hauptpatent angegeben aufgearbeitet.
Bei der erfindungsgemäßen Arbeitsweise - soll der Gehalt der Perchlorsäurelösung 5 bis 40, vorzugsweise etwa 10% betragen. Die Anwendung der Perchlorsäurelösung gestattet die Ausfällung von Eiweißstoffen, ohne daß es bei der F'ällungsreaktion in nennenswertem Ausmaß zum Einschluß und somit zum Verlust von Trypsin-Inhibitor kommt. Gegenüber der bekannten Fällungsreaktion mit Trichloressigsäure besitzt die Anwendung der Perchlorsäurelösung den Vorteil, daß ein Überschuß an Perchlorat-Ionen durch Zugabe von Kalium- oder Ammoniumcarbonat bzw. -bicarbonat leicht ausgefällt werden kann, so daß nach Entfernung des Perchlorniederschlages durch Dekantieren, Filtrieren oder Zentrifugieren eine neutrale, eiweiß- und perchloratfreie Lösung zurückbleibt, während erfahrungsgemäß bei Verwendung von Trichloressigsäure deren Überschuß bei Arbeitsweisen in technischem Maßstabe nur sehr schwer zu entfernen ist.
Weitere Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus dem Verzicht auf organische Lösungsmittel. Die Verwendung organischer Lösungsmittel erfordert aus Kostengründen deren Rückgewinnung und bedingt überdies zwangläufig ein Arbeiten mit größeren Flüssigkeitsvolumina, wodurch die Aufarbeitung der Ansätze zusätzlich erschwert wird.
Die den Trypsin-Inhibitor enthaltende Lösung wird anschließend mit einem.- Kationenaustauscher verrührt, an welchen der Inhibitor gebunden wird. Hierbei verwendet man vorzugsweise schwach saure Kationenaustauscher, H+-Form: Die Freisetzung des Trypsin-Inhibitors aus dem- Iationenaustauscher erfolgt durch Elution mit Säuren, vorzugsweise mit wäßrigen Lösungen von Säurea mit einem pH von maximal 2,1. Für die Flution,eignen sich beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure,- Phosphorsäure oder starke organische Säuren wie Ameisensäure.
Aus der so erhaltenen Lösung wird die Säure vermittels eines Anionenaustauschers entfernt. Hierbei kann man so vorgehen, daß man die Lösung entweder über einen Anionenaustauscher, OH-Form, chromatographiert oder den Anionenaustauscher in die Lösung einrührt. Die so erhaltene, annähernd neutrale Lösung kann anschließend im Vakuum oder vermittels Gefriertrocknung weiter eingeengt werden. Bei der Einengung auftretende Ausfällungen werden durch Zentrifugieren entfernt.
Der so gewonnene Trypsin-Inhibitor eignet sich als Arzneimittel zur Therapie gewisser proteolytischer Hyperfunktionen.
Beispiel 3,5 kg Rindermilz werden zerkleinert und mit 3500 ml 10%iger Perchlorsäure bei Temperaturen von nicht über 25° C 5 bis 10 Minuten homogenisiert. Das Homogenat wird 60 Minuten lang bei 4° C und 2700 U/min zentrifugiert. Der Niederschlag wird ausgewaschen, indem man ihn mit 500 ml Wasser homogenisiert und zentrifugiert. Der Vorgang wird zwei- bis dreimal wiederholt. Die vereinigten Oberstände (5000 ml) werden durch Glaswolle filtriert und mit etwa 800 ml 10 n-Kalilauge auf pH 7,0 eingestellt. Nach 15stündigem Stehenlassen bei 4° C wird vom ausgefallenen Kaliumperchlorat abdekantiert und die letzten Anteile bei 4° C und 2700 U/min 10 Minuten abzentrifugiert. Der Kaliumperchlorat-Niederschlag wird mit zweimal 200 ml destilliertem Wasser zentrifugierend unter gleichen Bedingungen gewaschen. Das Endvolumen des klaren Extraktes beträgt 6200 ml.
In diesen Extrakt werden 500 g Kationenaustauscher, H+-Form, mechanisch eingerührt. Nach 1stündigem Rühren und 5minutigem Sedimentieren wird dekantiert; der beladene Austauscher wird 5 bis 10 Minuten mit 500 ml destilliertem Wasser verrührt, 5 Minuten sedimentiert und wiederum dekantiert. Dieser Vorgang wird mit 500 ml 0,08 n-Essigsäure wiederholt. Zur Elution des Wirkstoffes wird etwa zehnmal mit 200 ml 0,2 n-Salzsäure unter den gleichen Bedingungen verrührt. Alle Salzsäure-Eluate werden vereinigt und über eine 3,5 - 22-cm-Säule des Anionenaustauschers, OH-Form, mit einer Tropfgeschwindigkeit von 800 ml/Std. neutralisiert. Die Säule wird mit 200 ml destilliertem Wasser gewaschen und das Waschwasser mit dem Filtrat zu einem Gesamtvolumen von 3200 m1 vereinigt.
Diese Lösung wird erneut, wie oben beschrieben, mit einem Kationenaustauscher behandelt. Zur Elution werden jedoch nur 7 -,200 ml 0,2 n-Salzsäure benötigt. Die Neutralisation erfolgt anschließend unter gleichen Bedingungen. Das Endvolumen der Lösung beträgt 2600 ml. Bei ungenügendem Reinheitsgrad kann der Reinigungsvorgang wiederholt werden.
Zur Konzentrierung des Wirkstoffes wird die klare, gelbe, verdünnte Lösung bei 40 bis 45° C Badtemperatur im Vakuum auf eine Konzentration von etwa 1000 Trypsin-Inhibitor-Einheiten (TIE)/rrtl eingeengt. Zur Darstellung stärker konzentrierter Lösungen wird zweckmäßig von dieser Konzentration ausgehend mit Hilfe der Gefriertrocknung weiter eingeengt. Anschließend wird in jedem Falle bei 5000 U/min und 4° C 30 Minuten vom inaktiven Niederschlag abzentrifugiert.
Die so erhaltenen klaren Konzentrate werden auf pH 5 eingestellt und können bei Zimmertemperatur aufbewahrt werden. Für Injektionslösungen lassen sich die Konzentrate auch auf andere pH-Werte einstellen. Sie enthalten den Trypsin-Inhibitor in einer Reinheit von.etwa 5 .bis 10 organischer Substanz pro TIE. Die Gesamtausbeute beträgt etwa 350 000 bis 500 000 TIE, d. h. 100 000 bis 150 000 TIE/kg.
Die erhaltenen konzentrierten Lösungen , lassen sich durch Anwendung der G'efriertrocknung auch in Trockenpulver überführen..

Claims

Patentanspruch: Weitere Ausbildung des Verfahrens gemäß Par tent 1.168 605 zur Gewinnung eines Trypsin-Inh bitors aus den Inhibitor.-snthaltenden tierischen Organen, vorzugsweise Milz oder Lunge, d a.-durch gekennzeichnet, daß der mit wä8-riger Perchlorsäure erhaltene Extrakt nach Neutralisation mit. Kalium- oder Ammoniumcarbogat bzw. -bicarbonat und Abtrennung, des ,Niecgischlages direkt mit den ,Ionenaustauschern behandelt wird.