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Verfahren zur Herstellung von reinen Präparaten des Kallikrein-Inaktivators
Es ist bekannt, daß man eiweißfreie Präparate des Kallikrein-Inaktivators aus tierischen
Organen herstellen kann, indem man seine Lösungen mit Eiweißfällungsmitteln, wie
Sulfosalicylsäure, Trichloressigsäure u. dgl. umsetzt. Der Kallikrein-Inaktivator
wird dabei nicht gefällt, sondern bleibt in Lösung (vgl. deutsche Patentschrift
1084 433).
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Eine grundsätzliche Ausnahme macht die Metaphosphorsäure, die ebenfalls
als typisches Eiweißfällungsmittel bekannt ist. Sie fällt den Wirkstoff nämlich
aus, und zwar auch aus solchen Lösungen, die zuvor mit Sulfosalicylsäure, Trichloressigsäure
u. dgl. quantitativ enteiweißt worden sind. Es handelt sich bei dieser Abscheidung
des Kallikrein-Inaktivator-Metaphosphats also nicht um eine Eiweißfällung; vielmehr
gibt das Verfahren die Möglichkeit, ein eiweißfreies, schwerlösliches Derivat des
Wirkstoffes zu gewinnen.
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Gegenstand des deutschen Patentes 1146 616 ist ein Verfahren
zur Herstellung eines schwerlöslichen Derivates des Kallikrein-Inaktivators, welches
dadurch gekennzeichnet ist, daß man ihn mit Metaphosphorsäure umsetzt. Man kann
dabei auch so vorgehen, daß man die Lösungen des Wirkstoffes mit wasserlöslichen
Salzen der Metaphosphorsäure versetzt, wobei keine Fällung eintritt, und dann durch
Ansäuern das schwerlösliche Derivat abscheidet.
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Durch die Fällung mit Metaphosphorsäure findet keine Denaturierung
des Kallikrein-Inaktivators statt, sondern seine biologische Wirkung bleibt in vollem
Ausmaß erhalten. Auf Grund der Schwerlöslichkeit des erhaltenen Produktes ist die
Abscheidung quantitativ, wodurch eine Abtrennung des Wirkstoffes von unwirksamen
Begleitstoffen erfolgt.
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Es wurde nun gefunden, daß man Präparate höchster Reinheit dadurch
herstellen kann, daß man den Kallikrein-Inaktivator aus seinen Lösungen mit Metaphosphorsäure
ausfällt, den Niederschlag abtrennt, durch Auflösen in Laugen oder Salzlösungen
zerlegt und die Lösung nach an sich bekannten Methoden von den Salzen befreit.
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Die Zerlegung der schwerlöslichen Verbindung kann erfolgen durch Auflösung
in Natronlauge oder in Salzlösungen, beispielsweise wäßrigen Lösungen von NaCI oder
NH4C1 in Konzentrationen von mehr als 1'%.
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Die Entfernung der Metaphosphorsäure bzw. der Salze erfolgt nach an
sich bekannten Methoden, z. B. durch Behandlung der Lösungen mit Austauschern, Fällung
mit Erdalkalisalzen, Dialyse usw.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann angewendet werden auf Lösungen,
die den Kallikrein-Inaktivator enthalten und die gewonnen wurden aus inaktivatorhaltigen
tierischen Organen, wie Parotis, Lunge, Leber, Pankreas, Milz, Lymphdrüsen usw.
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Nach den erfindungsgemäßen Verfahren wird der Kallikrein-Inaktivator
in Ausbeuten, die über 800/0 liegen, in Form von nahezu reinen Lösungen g;.wonnen,
was bisher auch nicht annäherungsweise möglich war. Lyophilisiert man die Lösungen,
so erhält man eine leicht wasserlösliche weiße Substanz, von der 0,16 bis 0,19 ;,
die biologische Aktivität einer Kallikrein-Inaktivator-Einheit haben (1 KIE).
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Beispiel 1 150 ccm einer salzarmen wäßrigen Lösung von Kallikrein-Inaktivator
aus Lunge vom Reinheitsgrad 0,3 ", enthaltend 9,9 Millionen KIE, wurden mit 10 ccm
einer 10%igen Metaphosphorsäurelösung gefällt. Der Niederschlag wurde abzentrifuaiert
und zweimal mit redestilliertem Wasser gewaschen. Dann wurde der Rückstand in 300
ccm redestilliertem Wasser suspendiert und unter Rühren mit 2.25 ccm n/1-Natronlauge
gelöst. Diese Lösung ließ man durch eine Austauschersäule fließen, die mit 70 ccm
Kationenaustauscher (Levatit S 100 oder Amberlite IR 120) und 220 ccm Anionenaustauscher
Amberlite IRA 410 beschickt war.
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Aus der Säule floß eine salzfreie Lösung vom pH 9,4. Es wurde mit
120 ccm aqua redest nachgewaschen. Man erhielt insgesamt 430 ccm, die mit 3 ccm
n/1-Salzsäure neutralisiert wurden. Die Lösung enthielt 8,524 Millionen KIE gleich
86% der angewandten Menge in einem Reinheitsgrad von 0,16 "/KIE. Das Produkt, das
rd. 20 000 KIE/ccm
enthielt und frei von Phosphorsäure ist, wurde
lyophilisiert.
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Beispiel 2 300 mg eines aus Pankreas hergestellten lyophilisierten
Inaktivatorpräparates vom Reinheitsgrad 0,6 7, entsprechend 500 000 KIE, werden
in 25 ccm redestilliertem Wasser gelöst und mit 14,4 ccm 5 %iger Metaphosphorsäure
gefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, zweimal mit je 40 ccm aqua redest
gewaschen und in 50 ccm redestilliertem Wasser suspendiert. Dann gibt man unter
Rühren so viel n/10-Natronlauge zu, bis der Niederschlag eben gelöst ist, was bei
einem PH von 8 bis 9 der Fall ist, und läßt die Lösung durch eine Austauschersäule
laufen, die mit 5 ccm des Kationenaustauschers Amberlite IR 120 und 20 ccm des Anionenaustauschers
IRA 410 beschickt ist. Es sollen nicht mehr als 10 Tropfen pro Minute ablaufen.
Am Schluß wird mit 25 ccm aqua redest nachgewaschen.
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Die vereinten Lösungen enthalten 380 000 KIE, was einer Ausbeute von
76% entspricht. Der Reinheitsgrad beträgt 0,19 y für 1 KIE. Beispiel 3 1001
eines Kallikrein-Inaktivator-Präparates, das aus Parotis hergestellt wurde und das
im Kubikzentimeter 2500 KIE vom Reinheitsgrad 0,65 y enthält - insgesamt also 250
Millionen KIE -, werden unter Rühren mit 220 ccm 10%iger Metaphosphorsäurelösung
gefällt. Der Niederschlag wird abgetrennt, zweimal mit je 171 aqua redest gewaschen
und nach Suspendieren in 71 redestilliertem Wasser mit 39 ccm n/1-Natronlauge gelöst.
Jetzt enthält 1 ccm der schwach viskosen Lösung 35 000 KIE. Die Fällung war also
quantitativ.
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Nun läßt man die Lösung nacheinander durch zwei Austauschersäulen
laufen, deren eine 6,61 des Anionenaustauschers Amberlite IRA 410, die andere 2,21
Kationenaustauscher Levatit S 100 oder Amberlite IR 120 enthält. Es wird mit 51
aqua redest nachgewaschen.
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Die aus der Säule ausfließende salzfreie Lösung wird mit n/1-Salzsäure
auf ein pH von 6,0 eingestellt. Es sind 121, die 210 Millionen KIE, das sind 84%
der eingesetzten Menge, enthalten. 1 ccm enthält 17 500 KIE vom Reinheitsgrad
0,16 y. Das Präparat ergibt nach Lyophilisierung 33,6 g.