AT251191B - Verfahren zur Herstellung von reinstem Hirudin - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung von reinstem Hirudin 
Die Erfindung betrifft ein Verfahren für dieHochreinigung des im medizinischen Blutegel enthaltenen Hemmstoffes der Blutgerinnung, des Hirudins. 



   Es ist bekannt, dass der medizinische Blutegel einen Hemmstoff enthält, der spezifisch In den Ablauf der Blutgerinnung eingreift, indem er mit dem Gerinnungsenzym Thrombin einen stöchiometrisch gut definierten Komplex bildet. wodurch die Wirkung des Thrombins erlischt. 



   Nach einem bekannten Verfahren erhält man durch Extraktion entwässerter Blutegelköpfe mit Aceton-Wasser-Gemischen und fraktionierter Acetonfällung ein Rohprodukt, das durch Elektrodialyse, Propanolextraktion sowie anschliessende Papierelektrophorese gereinigt wurde. 



   Es wurde weiters vorgeschlagen, das Hirudin durch Äthanolfraktionierung, Oxycellulosebehandlung und Adsorption an einen schwach sauren Kationenaustauscher auf Kunstharzbasis in hochgereinigter Form zu gewinnen. 



   Es wurde nun festgestellt, dass eine weitere Reinigung des Präparates durch Anwendung der Gelfiltrationsmethode mit Hilfe von stark vernetzten Dextranen möglich ist. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von reinstem Hirudin aus vorzugsweise durch Ätha-   nolfraktionierung,   Oxycellulosebehandlung und Adsorption an einem schwach sauren Kationenaustauscher vorgereinigten Hirudinlösungen ist dadurch gekennzeichnet, dass diese Hirudinlösungen durch Gelfiltration über Säulen mit stark vernetzten Dextrane, insbesondere mittels Filtration über mit Epichlorhydrin vernetzte Dextrane mit einem Wasseraufnahmevermögen von 4,7 bis 5, 3 (g/g) von Ballaststoffen befreit und das Hirudin in höchster Reinheit gewonnen wird. 



   Das Wasseraufnahmevermögen bzw. der sogenannte "water regain"-Wert der Dextrane ist durch die Wasseraufnahme in ml pro Gramm trockener Gelsubstanz definiert. 



   Durch Filtration von wässerigen Hirudinlösungen über lange Gelsäulen gelingt es, weitere Ballaststoffe abzutrennen. Das Polypeptid Hirudin lässt sich aus den aufgefangenen Fraktionen durch Alkoholfällung oder Lyophilisation leicht gewinnen. Durch die Anwendung der Gelfiltration wird die spezifische 
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   Die Vorzüge des Verfahrens bestehen darin, dass die Trennung in rein wässeriger Lösung erfolgt und dass durch Vergrösserung des Säulendurchmessers beliebig grosse Mengen des Hirudin-Präparates gereinigt werden können. 



   Beispiel : 250 g Hirudin mit einer spezifischen Aktivität von 4420 ATE/mg (Antithrombin-Einheiten) werden in 1 ml Wasser gelöst und die Lösung auf eine mit Dextrangel gefüllte Säule gegeben. Die günstigste Dimension der Säule beträgt 130 X 1 cm. Nach Eindringen der Lösung in das Gelbett wird dieses vorsichtig mit   dest.   Wasser überschichtet und danach mit der Elution begonnen. Die Eluierungsgeschwindigkeit beträgt etwa 10 ml/h. Das Eluat wird in Fraktionen zu 3 ml aufgefangen. Die ersten 

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 60 ml enthalten Ballaststoffe und nur einen sehr geringen Teil der Hirudin-Aktivität. Die Hauptmenge des Hirudins ist in den danach folgenden 20 ml enthalten. Anschliessend folgen niedermolekulare Verunreinigungen ohne jede Hirudin-Aktivität.

   In jeder Fraktion wird der Proteingehalt durch spektrophotometrische Adsorptionsmessung bei 280   mli   und die Hemmstoffkonzentration durch Hirudin-Titration bestimmt, vgl. Markwardt : Die Bestimmung des Thrombins durch Titration mit Hirudin ; Arch. pharm. 290. 280   [1957].   Aus der   wässerigen   Lösung wird das Hirudin durch Lyophilisation oder durch Ausfällen mit der 10fachen Menge Äthanol gewonnen. Die Ausbeute beträgt zirka   90%   der eingesetzten Menge ATE. 



  Die spezifische Aktivität des Präparates beträgt zirka 8400 ATE/mg.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH : Verfahren zur Herstellung von reinstem Hirudin aus vorzugsweise durch Äthanolfraktionierung, Oxycellulosebehandlung und Adsorption an einem schwach sauren Kationenaustauscher vorgereinigten Hirudinlösungen, dadurch gekennzeichnet, dass die Hirudinlosungen durch Gelfiltration über Säulen mit stark vernetzten Dextrane, insbesondere mittels Filtration über mit Epichlorhydrin vemetzte Dextrane mit einem Wasseraufnahmevermögen von 4, 7 bis 5, 3 (g/g) von Ballaststoffen befreit und das Hirudin in höchster Reinheit gewonnen wird.