DE1200475B

DE1200475B - Verfahren zur Herstellung von reinstem Hirudin aus medizinischen Blutegeln

Info

Publication number: DE1200475B
Application number: DEV25657A
Authority: DE
Inventors: Dr Dr Fritz Markwardt; Dr-Ing Gerhard Schaefer; Dipl-Chem Horst Toepfer; Dr Peter Walsmann
Original assignee: Arzneimittelwerk Dresden GmbH
Current assignee: AWD Pharma GmbH and Co KG
Priority date: 1964-03-21
Filing date: 1964-03-21
Publication date: 1965-09-09

Description

Verfahren zur Herstellung von reinstem Hirudin aus medizinischen Blutegeln Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Reinigung des im medizinischen Blutegel enthaltenen Hemmstoffes der Blutgerinnung, des Hirudins.
Es ist bekannt, daß der medizinische Blutegel einen Hemmstoff enthält, der spezifisch in den Ablauf der Blutgerinnung eingreift, indem er mit dem Gerinnungsenzym Thrombin einen stöchiometrisch gut definierten Komplex bildet, wodurch die Wirkung des Thrombins erlischt.
Nach einem bekannten Verfahren erhält man durch Extraktion entwässerter Blutegelköpfe mit Aceton-Wasser-Gemischen und fraktionierterAcetonfällung ein Rohprodukt, das durch Elektrodialyse, Propanolextraktion sowie anschließende Papierelektrophorese gereinigt wurde.
Es wurde weiter vorgeschlagen, das Hirudin durch Äthanolfraktionierung, Oxycellulosebehandlung und Adsorption an - einen schwach sauren Kationenaustauscher auf Kunstharzbasis in hochgereinigter Form zu gewinnen.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß eine weitere Reinigung des Präparates durch Anwendung der Gelfiltrationsmethode mit Hilfe von stark vernetzten Dextranen möglich ist. Durch Filtration von wäßrigen Hirudinlösungen über lange Gelsäulen gelang es, weitere Ballaststoffe abzutrennen. Das Polypepti.d Hirudin ließ sich aus den aufgefangenen Fraktionen durch Alkoholfällung oder Lyophilisation leicht gewinnen. Durch die Anwendung der Gelfiltration wird die spezifische Aktivität vorgereinigter Präparate des Hirudins auf das 1,5- bis 2fache gesteigert. Dabei liegt die Ausbeute an hochgereinigtem Hirudin zwischen 80 und 90%.
Die Vorzüge des Verfahrens bestehen .darin, daß die Trennung in rein wäßriger Lösung erfolgt und daß durch Vergrößerung des Säulendurchmessers beliebig große Mengen des Hirudin-Präparates gereinigt werden können.
Beispiel 25 omg Hirudin mit einer spezifischen Aktivität von 4420 ATE/mg (Antithrombineinheiten) werden in 1 ml Wasser gelöst und die Lösung auf eine mit Dextrangel gefüllte Säule gegeben. Die günstigste Dimension der Säule beträgt 130 X 1 cm. Nach Eindringen der Lösung in das Gelbett wird dieses vorsichtig mit destilliertem Wasser überschichtet und danach mit der Elution begonnen. Die Eluierungsgeschwindigkeit beträgt etwa 10 ml/Std. Das Eluat wird in Fraktionen zu 3 ml aufgefangen. Die ersten 60 ml enthalten Ballaststoffe und nur einen sehr geringen Teil der Hirudinaktivität. Die Hauptmenge des Hirudins ist in den danach folgenden 20 ml enthalten. Anschließend folgen niedermolekulare Verunreinigungen ohne jede Hirudinaktivität. In jeder Fraktion wird der Proteingehalt durch spektrophotometrische Adsorptionsmessung bei 280 nm und die Hemmstoftkonzentration durch Hirudintitration bestimmt (F. Markwardt: »Die Bestimmung des Thrombins durch Titration mit Hirudin«, Arch. pharm., 290, S. 280 [1957] ). Aus der wäßrigen Lösung wird das Hirudin durch Lyophilisation oder durch Ausfällen mit der 10fachen Menge Äthanols gewonnen. Die Ausbeute beträgt etwa 90,°/o der eingesetzten Menge ATE. Die spezifische Aktivität des Präparates beträgt etwa 8400 ATE/mg.

Claims

Patentanspruch: Verfahren zur Reinigung der durch Äthanolfraktionierung, Oxycellulosebehandlung und Adsorption an einem schwach sauren Kationenaustauscher vorgereinigten wäßrigen Hirudinlösungen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lösungen über Säulen mit stark vernetzten Dextranen filtriert und das Hirudin aus dem Filtrat gewinnt.