DE3106876A1

DE3106876A1 - "verfahren zur reinigung von glucosaminoglucanen"

Info

Publication number: DE3106876A1
Application number: DE19813106876
Authority: DE
Inventors: Petro 5 Milan Cremonesi; Giancarlo 8 Milan Sportoletti
Original assignee: Italfarmaco SpA
Current assignee: Italfarmaco SpA
Priority date: 1980-02-29
Filing date: 1981-02-24
Publication date: 1981-12-03
Also published as: NL8100894A; ES499936A0; FR2479834A1; CA1155112A; NL186319C; GB2071127A; NL186319B; GB2071127B; FR2479834B1; US4507205A; ES8201595A1; SE8101114L

Description

Aufgrund ihrer chemischen Struktur weisen Glucosaminoglucane eine breite Molekulargewichtsstreuung auf. Der Zusammenhang zwischen biologischer Aktivität, Struktur und Molekulargewicht ist bisher nicht geklärt. In letzter Zeit wurde mehrfach berichtet, dass die Fraktionierung von Glucosaminoglucanen auf der Basis des Molekulargewichts oder auf der Basis ihrer Affinität für andere Substanzen mit entsprechender biologischer Aktivität möglich ist. Vom therapeutischen Standpunkt wäre es sehr wünschenswert, reinere Fraktionen und Fraktionen mit höherer spezifischer Aktivität (antikoagulierende, antilipämische,antithrombotisch usw.Aktivität) zu erhalten. Beispielsweise wurde im Fall von Heparin, das eine durchschnittliche Molekulargewichtsverteilung von 5000 bis 2o ooo aufv weist, von L.O. Andersson, T.W. Barrowcliffe, E. Holmer, E.A. Johnson und G.E.C. Sims, Thrombosis Research, Bd. 9 (1976),

S. 575 bis 583, von R. Jordan, D. Beeler und R. Rosenberg, J. Biol. Chem., Bd. 254 (1979), S. 2902 bis 2913 sowie von H.J. Rodriguez und A.J. Vanderwielen, J. Pharm. Sei. Bd. 68

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(1979), S. 588 bis 591 berichtet, dass Fraktionen mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 5000 bis 14 000 eine spezifische Antikcagulationsaktivität aufweisen, die in der Grössenordnung von 40 Prozent einer Fraktion mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 12 000 liegt.

Fraktionen mit einem Molekulargewicht von 5000, die durch Affinitätschromatographie gegen Antithrombin erhalten worden sind, ergeben Fraktionen, die teilweise eine hohe Antikoagulationsaktivität, beispielsweise 250 bis 300 l\ . I./mg, aufweisen, sowie andere Fraktionen mit antithrombotischer bzw. äntilipäntischer Aktivität. Diese Fraktionierungsverfahren sind im allgemeinen nur im Laboratoriumsmasstab unter Anwendung chromatographischer Verfahren durchgeführt worden. Obgleich die Mögliches keit gegeben ist, diese Verfahren auf einen grösseren Massstab auszudehnen, ist zu erwarten, dass die Fraktionen verunreinigt und die Stabilität des chromatographischen Trägers beeinträchtigt werden; beides Erscheinungen, die zu ernstlichen Störungen bei der Anwendung dieser Verfahren in gross-

*® technischem Masstab bei kontinuierlicher Verfahrensweise führen würden. Zu diesen Aktivitätsanreicheruags- bzw. Aktivitätsisolierungsproblemen kommen andere
Schwierigkeiten, die bei handelsüblichen Glucosaminoglucanen auftreten. Glucosaminoglucane werden nämlich aus Organen von verschiedenen Tieren, beispielsweise aus Lungen und Darm-Schleimhäuten von Rindern und Schweinen, gewonnen. Die Extraktionsverfahren sind sehr komplizierter Natur, da sie die enzymatisehe Proteolyse der als Ausgangsmaterialien verwendeten Glycoproteine, eine Salzbildung mit ammoniakalischen quaternären Salzen oder die Verwendung von Ionenaustauscher-

harzen umfasst und im allgemeinen mehr als eine Fällung mit alkoholischen Lösungsmitteln in Gegenwart von Salzen oder dergleichen erforderlich machen. Das bei der ersten Reinigung erhaltene Rohprodukt muß sodann weiteren zeitaufwendigen Reinigungsschritten unterworfen werden, die zu verschie-

denen handelsüblichen Glucosaminoglucanen von hoher Reinheit führen. In allen Fällen besteht aber die Wahrscheinlich-

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keit, dass folgende Bestandteile in den gereinigten Produkten verbleiben:

a) organische und anorganische Verunreinigungen, die einerseits keine spezifischen biologischen Aktivitäten aufweisen und andererseits bei der tatsächlichen Anwendung ernste technische Probleme befürchten lassen und schliesslich vermutlich zu einer Senkung der spezifischen biologischen Aktivität, beispielsweise von U .1. Antikoagulans/mg, führen, und

b) Verunreinigungen, deren Gegenwart aufgrund ihrer potentiellen negativen biologischen Aktivität nicht hingenommen werden kann. Typische Beispiele für derartige Verunreinigungen sind oxidierende Substanzen, die in der letzten Stufe zur Entfärbung des Produkts verwendet werden.

Es sind mehrere Verfahren bekannt geworden, die mehr oder • weniger zur Beseitigung dieser Verunreinigungen führen. Diese Verfahren beruhen auf der Anwendung von Ionenaustauscherharzen, selektiver Fällung und dergleichen.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein leicht auf grosstechnischen Masstab übertragbares Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem die Reinheit oder die spezifische Aktivität von handelsüblichen Glucosaminoglucanen erhöht werden können.

Die Erfindung beruht auf dem Befund, dass es möglich ist, Glucosaminoglucane mit einer starken Streuung des Molekulargewichts zu fraktionieren ■ .,...:.,-. und/oder einige Bestandteile von niederem
Molekulargewicht mit einer geringen biologischen Aktivität, beispielsweise Heparin mit einer geringen Antikoagulationsaktivität, mit Hilfe von Membranen zu entfernen. Es sind be-

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stimmte Membranen bekannt, die in Abhängigkeit von den Membraneigenschaften oder von den physiko-chemischen Eigenschaften des Lösungsmittels oder der Lösung die spezifische Passage

von vorbestimmten Substanzen erlauben. 5

Das erfindungsgemässe Verfahren besteht darin, dass man eine Lösung von zu reinigenden Glucosaminoglucanen der Ultrafiltration, Hyperfiltration (umgekehrte Osmose) oder Dialyse

mittels entsprechender Membranen unterwirft, so dass eine 10

partielle Passage durch die Membranen erfolgt. Beispiele für entsprechende Konzentrationen und andere Bedingungen sind in den Beispielen näher erläutert.

Je nach Art des gewünschten Endprodukts und des gewünschten Reinheitsgrads können Ultrafiltration, umgekehrte Osmose oder Strömungsdialyse angewendet werden, wie sich im einzelnen aus den nachstehenden Beispielen ergibt.

Ferner wurde berichtet, dass die Behandlung von Metallsalzen von Glucosaminoglucanen und insbesondere von Heparin nach Verfahren, bei denen die entsprechende freie Säure, d.h. Heparinsäure, als Zwischenprodukt gebildet wird, zu einer Verringerung der biologischen Aktivität des Endprodukts führt. Im allgemeinen wird eine derartige Behandlung mit Ionenaustauschern durchgeführt. Erfindungsgemäss wurde nunmehr festgestellt, dass bei einer Freisetzung der freien Säure nach den vorstehend erwähnten Verfahren unter geeigneter Temperaturkontrolle keine Abnahme der spezifischen biologischen Aktivität des gereinigten Endprodukts eintritt.

Die Beispiele erläutern die erfindungsgemässe Behandlung von Glucosaminoglucanen, wobei eine Anreicherungrbzw. Isolierung vcn Aktivitäten unter Verwendung vcn Msmbranen erreicht wird.

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Beispieli

Reinigung von Natriumheparinat mittels Ultrafiltration durch eine Membran mit einer molekularen Ausschlussgrenze von 10

Es wird eine Lösung von Natriumheparinat (U^ .1.155/mg Antikoagulationsaktivität) mit einer Konzentration von 1 bis 15 Prozent in bidestilliertem Wasser verwendet. Vorzugsweise wird eine Lösung mit einer Konzentration von 7 Prozent verwendet. Diese Lösung wird der Ultrafiltration in einer entsprechenden Vorrichtung, beispielsweise Amicon Modell 52, unterzogen, wobei die Lösung in entsprechender Weise gerührt wird, um das Auftreten von Polarisationserscheinungen aufgrund einer Anreicherung in der Nähe der Membran zu vermeiden. Dies ermöglicht die Aufrechterhaltung eines ausreichenden Diffusionsstroms durch die Membran von beispielsweise 0,2 cm/min unter Anwen-

dung von Drücken von 0,5 bis 5 at. Nachstehend sind die Endbedingungen angegeben: Temperatur 20⁰C (es ist jedoch möglich, im Temperaturbereich von 4 bis 35 C zu arbeiten); pH-Wert der Lösung: 6,5 (es ist jedoch möglich, im pH-Bereich von 2,5 bis 8,5 zu arbeiten).

Eine Membran mit einer nominalen Ausschlussgrenze (cut-off) von weniger als IO OOO,beispielsweise Amicon P.M. 10, kann verwendet werden.

Die Lösung wird mit der Ultrafiltrationsvorrichtung bis .auf etwa 50 Prozent des ursprünglichen Werts eingeengt. Das die Membran passierende Material wird gewonnen und lyophilisiert. Der biologische Titer des lyophilisierten Materials, ausgedrückt in Antikoagulationseinheiten, beträgt weniger als 100 l\ -I./mg . die anti X_a Aktivität ist 180 U.I./mj.

Das nicht durch die Membran tretende Material wird ebenfalls gewonnen und lyophilisiert. Der biologische Titer dieses Materials beträgt, ausgedrückt in Antikoagulationseinheiten, 193 U_x-I./mg; anti X_a = 78 ü.I./ng.

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Beispiel 2 Reinigung von Natriumheparinat mittels Ultrafiltration durch eine Membran mit einer nominalen, molekularen Ausschlussgrenze von 5000

Man verfährt wie in Beispiel 1, verwendet aber eine Membran mit einer nominalen, molekularen Ausschlussgrenze von 5000. Ein Beispiel für eine derartige Membran ist unter der Bezeichnung Berghoff BM:50 erhältlich. Die biologische Aktivität des die Membran passierenden Materials beträgt Π U.I./mg und des nicht die Membran passierenden Materials 189 If. I./mg ,-{die anti X₃ Aktivität ist 196 bzw. 50 U.I./itg).

Beispiel 3 Reinigung von Heparin durch Hyperfiltration mittels einer

„_ Membran mit einer molekularen Ausschlussgrenze von weniger

'

als 600

Eine wässrige Heparinlösung, in Form des Salzes mit Natrium oder Calcium oder einem anderen Ion, wird in einer Konzentration von 1 bis 15 Prozent und vorzugsweise von 4 Prozent verwendet. Diese Lösung wird in einer entsprechenden Vorrichtung, die mit einer Speisepumpe mit einem Druck von 2 bis 25 at und vorzugsweise von mehr als 5 at versehen ist, der Hyperfiltration unterzogen. Die Heparinlösung fliesst in laminarer Strömung auf eine entsprechende Membran, beispielsweise Osmonix Sepa 50, mit einer molekularen Ausschlussgrenze von weniger als 6Q0.

Das die Membran passierende Material wird unberücksichtigt gelassen. Das nicht die Membran passierende Material wird zurückgeleitet. Die Heparinkonzentration im zurückgeleiteten Material wird durch kontinuierliche Wasserzugabe konstant gehalten.

Auf diese Weise werden aus der ursprünglichen Lösung Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 600, die die Membran passieren, entfernt.

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-ιοί Bei diesem Versuch wird das Natriumsalz von Heparin mit einer Antikoagulationsaktivität von 171 t\.I./mg, das ein hohes Oxidationsvermögen aufweist, verwendet. Das Oxidationsvermögen ist darauf zurückzuführen, dass zur Entfärbung des Materials Wasserstoffperoxid oder Persäuren verwendet worden sind.

Das Natriumsalz von Heparin, das aus dem Material, das die Membran nicht passiert, gewonnen wird, weist eine Antikoagulationsaktivität von 178 U.I./mg. auf, besitzt aber keinerlei Oxidationsvermögen.

Die Ausbeute beträgt mehr als 90 Gewichtsprozent.

Beispiel 4

Reinigung von Heparin mittels Strömungsdialyse zur Entfernung von oxidierenden Substanzen

Wässrige Heparinlösungen in Form des Salzes mit Natrium, Calcium oder anderen Ionen werden verwendet. Die Konzentration beträgt 1 bis 20 Prozent und vorzugsweise 5 Prozent. Die Lösungen werden—in einem Dialysator mit laminarer Strömung, wie er normalerweise für die Hämodialyse verwendet wird, dialysiert. Der Dialysator weist Hohlfasern oder Mehrfachschichten auf. Die Dialyse wird gegen wässrige Lösungen vom pH-Wert 2 bis 3 durchgeführt. Der pH-Wert wird mittels einer Mineral-

säure eingestellt. Die Temperatur wird mittels eines entsprechenden Kühlsystems auf den Bereich 4 bis 7 C eingestellt. Die Strömungsgeschwindigkeit beträgt 10 bis 100 ml/min pro

ρ
0,7 m Membran im Abteil der dialysierenden Lösung und 20 bis

ρ
400 ml/min pro 0,7 m Membran im Abteil der dialysierten lösung.

Die dialysierende Lösung, die Natriumheparinat enthält, wird zurückgeleitet, während die Lösung im Dialysatabteil kontinuierlich erneuert wird.

Die Dialyse wird so lange durchgeführt, bis das Oxidationsvermögen in der Lösung der dialysierenden Substanz und im

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Dialysat verschwunden ist. Die Heparinsäure wird anschliessend durch Neutralisation mit Calciumoxid und Behandlung mit Calciumchlorid geraäss üblichen Verfahren in Calciumheparinat übergeführt.

Das durch alkoholische Fällung erhaltene Calciumheparinat weist einen Antikoagulationstiter von 156 U.I./mg auf. Das als Ausgangsmaterial verwendete Natriumheparinat besitzt im wesentlichen die gleiche Antikoagulationsaktivitat.

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Claims

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PATENTANWÄLTE *3 1 Π R fi 7 fi

SIEBERTSTRASSE 4· ■ 8OOO MÜNCHEN 86 · PHONE: (O89) 47 4Ο75 CABLE: B EN ZOLPATENT MÖNCHEN TELEX 5-29453 VOPAT D

u.Z.: R 029 (Ra/kä)
Case: 998 V

ITALFARMACO S.P.A.
Mailand, Italien
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" Verfahren zur Reinigung von Glucosaminoglucanen "

Patentansprüche

Verfahren zur Trennung von Komponenten mit verschiedener, geringer oder fehlender biologischer Aktivität ^aus Glucosaminoglucanen,

dadurch gekennzeichnet, daß man das Glucosaminoglucan in Form eines Salzes in wäßriger Lösung auf eine für die Ultrafiltration, Hyperfiltration (umgekehrte Osmose) oder Dialyse geeignete Membran unter partieller Passage durch die Membran fließen läßt, wobei Fraktionen von geringer Aktivität die Membran passieren und Fraktionen höherer Aktivität die Membran nicht passieren und angereichert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Gewinnung von Fraktionen mit verschiedenen, spezifischen biologischen Aktivitäten das Glucosaminoglucan durch eine für die Ultrafiltration geeignete Membran fließen läßt, wobei die Membran eine nominale, molekulare Grenze von 1000 bis 15 000 aufweist.

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3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die wässrige Lösung des Glucosaminoglucans durch eine für die Hyperfiltration (umgekehrte Osmose) geeignete Membran mit einer nominalen Abweisung für Natrium zwischen 0 und 75 Prozent fliessen lässt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die wässrige Lösung des GIucosaminoglucans durch eine für die Dialyse geeignete Membran mit einer nominalen, molekularen Grenze von weniger als 30 000 fliessen lässt.
5- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Dialyse unter Verwendung eines Hämodialysators durchführt.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 4_r dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Dialyse als

Gegenlösung für die Glucosaminoglucanlösung eine wässrige Lösung mit einem pH-Wert von 2 bis 9 verwendet.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Glucosaminoglucan Heparin in Form des Natrium- oder Calciumsalzes verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Natriumheparinat von U.I.155/mg der Ultrafiltration mit einer Membran mit einer Grenze von 10 000 unterwirft und das die Membran nicht passierende Material gewinnt, das nach der Lyophilisation eine Antikoagulationsaktivität von 193~U.I./mg und eine anti X -Aktivität von 78 U.I. aufweist, während die entsprechenden Aktivitäten des die Membran passierenden Materials weniger als 1OO U.I./mg und 180 ü.I./mg betragen.

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9· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Natriumheparinat mit einer Antikoagulationsaktivität von 155 U.I./mg der Ultrafiltration mit einer Membran mit einer nominalen Grenze von 5000 unterwirft und ein nicht durchgetretenes Material mit Antikoagulationsaktivität von 189 U.I./mg und mit anti X -Aktivität von

' el

50 Ü.I./mg abtrennt, während die entsprechenden Aktivitäten im durchgetretenen Material 11 U.I./mg bzw. 196 U.I./mg betragen.
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10. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet, dass man Heparin in Form eines anorganischen Salzes der Hyperfiltration mit einer Membran mit

einer Grenze von 600 unterwirft.
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11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Heparin in Form eines anorganischen Salzes gegen eine wässrige Lösung vom pH-Wert 2 bis 3 dialysiert, Heparinsäure aus der Dialyselösung gewinnt

und die Heparinsäure in das Calciumsalz überführt.

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