NL8100894A - Werkwijze voor het zuiveren van glucosaminoglucan. - Google Patents

Description

Ψ « -1- 21777/Vk/jg

Korte aanduiding: Werkwijze voor het zuiveren van glucosaminoglucan.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het zuiveren van glucosaminoglucan door het afscheiden van verbindingen met een lage 5 of meer specifieke biologische activiteit of inactieve stoffen van glucosaminoglucan. Met name heeft de uitvinding betrekking op het zuiveren van glucosaminoglucan en het toepassen van deze stof vanwege de biologische en therapeutische activiteit. Glucosaminoglucan kan met name worden toegepast als anti-coagulatiemiddel, anti-lipemische stof en als middel 10 met een anti-X -activiteit, a

Door de chemische structuur heeft glucosaminoglucan een polydis-perse verdeling van het molecuulgewicht en het verband tussen de biologische activiteit, de structuur en het molecuulgewicht is nog niet duidelijk.

Er zijn diverse rapporten verschenen met betrekking tot het fractioneren 15 van glucosaminoglucanverbindingen op basis van het molecuulgewicht of op basis van de affiniteit hiervan voor andere stoffen met een geschikte biologische activiteit. Het zou natuurlijk zeer gewenst zijn uit therapeutisch oogpunt gezien om zuiverdere fracties te verkrijgen en fracties met een hogere graad van een specifieke activiteit, onafhankelijk van het feit 20 of de stof wordt gebruikt als anti-coagulatiemiddel, anti-lipemisch middel, of vanwege de antitrombotische activiteit. Wanneer bijvoorbeeld heparine een gemiddelde verdeling van het moleöuulgewicht tussen 5000 en 20000 heeft, zoals vermeld door L.0. Andersson, T.W. Barrowcliffe, Έ. Holmer, E.A. Johnson and G.E.C. Sims, Thrombosis Research, 9, 575-583 (1976), R. Jordan, D.

25 Beeler, R. Rosenberg, J. Biol. Chem., .254, 2902—2913 *(1979), H.J. Rodriquez en A.J. Vanderwielen, J. Pharm. "Sci., 68, 588-591 (1979), blijkt dat fracties met een gemiddeld molecuulgewicht tussen 5000 en 14.000 een anti-coagulerende specifieke activiteit hebben van ongeveer 40£ van een frac- tie met een gemiddeld molecuulgewicht van 12.000.De fracties met een mole-30 cuulgewicht van 5.000, die chromatografisch kunnen worden verkregen en een affiniteit hebben ten opzichte van anti-thrombine, geven fracties die een hoge anti-coagulerende werking hebben, van bijvoorbeeld 250-300 in- * ternationale eenheden/mg,. terwijl andere fracties een anti-thrombose of anti-lipemische activiteit hebben. Deze wijzen van fractioneren worden 35 in het algemeen uitgevoerd op laboratoriumschaal onder toepassing van chromatografische bewerkingen. Zelfs wanneer het mogelijk is om deze werk- . 8100894 Γ·ν / '» -2- 21777/Vk/jg wijzen op een grotere schaal uit te voeren, is het aannemelijk dat de fracties worden verontreinigd en dat de stabiliteit van de chromatografi-sche dragers wordt beïnvloed, welke verschijnselen van ernstig nadeel zijn op de toepassing van deze bewerkingen op industriële schaal wanneer een 5 continu procédé moet worden uitgevoerd. Naast deze problemen met betrekking tot het concentreren of scheiden naar activiteit, spelen andere problemen een rol met betrekking tot in de handel verkrijgbaar glucosamino-glucan. Meer specifiek geldt dat glucosaminoglucan wordt bereid door organen van verschillende dieren zoals door een rund of varken, waarbij 10 vooral de longen en de intestinale mucosa een rol spelen. De extractie-bewerking is zeer complex omdat deze een enzymatische proteolyse inhoudt van het glycoproteïne houdende uitgangsmateriaal, de zoutvorming met ammo-niakale quaternaire zouten of het gebruik van ionenwisselaars en in het algemeen is meer dan één precipitatie met alcohol houdende oplosmiddelen 15 in aanwezigheid van zouten en dergelijke vereist. Het ruwe produkt dat wordt verkregen uit de eerste zuivering moet dan worden onderworpen aan een tijdrovende zuivering, hetgeen leidt tot diverse in de handel verkrijgbare glucosaminoglucanverbindingen met een hoge zuiverheid. In het gezuiverde produkt blijven gewoonlijk de volgende stoffen achter: 20 a) organische of anorganische onzuiverheden die geen specifieke biologische activiteit hebben en anderzijds ernstige technologische problemen bewerkstelligen tijdens het gebruik en verder hebben deze stoffen de neiging om de specifieke biologische activiteit, uitgedrukt in internationale eenheden anti-coagulatiemiddel/mg te verlagen, 25 b) onzuiverheden waarvan de aanwezigheid niet kan wordeni.tgetole- reerd omdat deze een inherente negatieve potentiële activiteit hebben op de biologische werking; van deze onzuiverheden kunnen worden genoemd de oxyderende stoffen die worden toegepast in de laatste trap om het produkt te ontkleuren.

30 Er zijn diverse werkwijzen voorgesteld die kunnen leiden tot het verwijderen van deze onzuiverheden. Deze methoden zijn gebaseerd op het gebruik van ionenwisselaarsharsen, selectieve precipitatie en dergelijke.

De doelstelling volgens de uitvinding is een werkwijze waarbij het mogelijk wordt om een zuivering op grote schaal uit te voeren, het-35 geen leidt tot een hogere mate van zuiverheid van de in de handel verkrijgbare glucosaminoglucanverbindingen of waarmee de specifieke activiteit wordt verhoogd.

De werkwijze volgens de uitvinding wordt hierdoor gekenmerkt, dat 81 0089 4 • « •Γ ^ -3- 21777/Vk/jg * glucosaminoglucan in de vorm van een zout in een waterige oplossing door een membraan wordt gevoerd, dat geschikt is voor ultrafiltratie, hydrofil-tratie (inverse osmose) of dialyse met partiële doorvoering door het membraan, waarbij fracties met een lage activiteit door het membraan gaan en 5 fracties met een hogere activiteit het membraan niet passeren en worden ingedampt.

De werkwijze volgens de uitvinding is hierop gebaseerd dat het mogelijk is om glucosaminoglucanverbindingen met een polydispers molecuul-gewicht te fractioneren en/of meer specifiek om die verbindingen te ver-10 wijderen met een laag molecuulgewicht, die een lage biologische activiteit hebben zoals heparine, dat een lage anti-coagulerende activiteit heeft onder toepassing van membranen. Bepaalde membranen zijn bekend die kunnen worden toegepast om bepaalde stoffen door te laten, in afhankelijkheid van de karakteristieke eigenschappen van het membraan of afhankelijk 15 van de fysisch-chemische eigenschappen van het oplosmiddel of de fysisch-chemische eigenschappen van de oplossing.

De volgens de uitvinding toegepaste werkwijzen bestaan uit het doorleiden van een oplossing van glucosaminoglucan die moet worden gezuiverd, door een membraan door het toepassen van ultrafiltratie of hyperfil-20 tratie of door dialyse, mèt een hiertoe geschikte concentratie en onder omstandigheden die hieronder nader worden toegelicht, zodat een partiële doorlaat door het membraan plaatsheeft. In zijn algemeenheid kan worden gesteld dat ultrafiltratie, inverse osmose of stroomdialyse kan worden toegepast in afhankelijkheid van het type eindprodukt dat is vereist en 25 de gewenste mate van zuiverheid, zoals nader wordt toegelicht in de volgende voorbeelden.

.Verder is gevonden, dat de behandeling van metallische zouten van glucosaminoglucan en met name heparine met bewerkingen die de tussenvor-ming inhouden van het corresponderende vrije zuur, te weten heparine-3° zuur, leidt tot een daling van de biologische activiteit van het eindprodukt. Gewoonlijk wordt deze soort behandeling uitgevoerd met behulp van ionenwisselaars. Anderzijds is gebleken dat wanneer het vrije zuur wordt afgescheiden door middel van de bovenvermelde bewerkingen met een geschikte regeling van de temperatuur geen daling van de specifieke biologische 35 activiteit van het uiteindelijk gezuiverde produkt plaatsheeft.

De uitvinding wordt nader toegelicht aan de hand van de volgende voorbeelden, ter toelichting van de behandeling van glucosaminoglucan volgens de uitvinding, waardoor een verrijking plaatsheeft of een schei- 81 0 0 89 4 Ή - -4- 21777/Vk/jg ding naar activiteit met behulp van een membraan, welke voorbeelden niet als beperkend moeten worden opgevat.

Voorbeeld I

De zuivering van natriumheparinaat door ultrafiltratie door een 5 membraan met een scheiding bij een molecuulgeMcht van 10.000.

Een oplossing met een concentratie tussen 1 en 15$ natriumheparinaat (anti-coagulerende activiteit van 155 internationale eenheden/mg), in'twee keer gedestilleerd water werd gebruikt. Het verdiende de voorkeur om een oplossing te gebruiken met een concentratie van 7$, die werd order 10 worpen aan ultrafiltratie in hiertoe geschikte apparatuur, bijvoorbeeld Amicon model 52, waarbij de oplossing goed gekoeld bleef om polymerisatie-verschijnselen te voorkomen, hetgeen kan worden bewerkstelligd door concentratie in de nabijheid van het membraan. Dit maakt het mogelijk om een diffusieflux door het membraan te behouden van een voldoende mate, bij-15 voorbeeld 0,2 cm/minuut onder toepassing van een druk tussen 0,5 en 5 atmosfeer, De uiteindelijke omstandigheden zijn een temperatuur van 20 °C, maar het is ook mogelijk om te werken bij een temperatuur tussen 4 en 35 °C, terwijl de pH van de oplossing bij voorkeur is gelegen op 6,5, maar eveneens kan een traject worden toegepast tussen 2,5 en 8,5.

20 Een membraan met een nominale afscheiding van een molecuulgewicht van minder dan 10.000 is bijvoorbeeld Amicon P.M.-10.

De oplossing wordt ingedampt met behulp van het ultrafilter tot een waarde van 50$ van de beginwaarde. Het materiaal dat hierdoor gaat wordt verzameld en onderworpen aan lyofilisering. De biologische zuiver-25 heid van het materiaal na lyofilisering, uitgedrukt in eenheden anti-co-agulatiemiddel is lager dan 100 internationale eenheden/mg en de anti-X -activiteit is 180 internationale eenheden/mg.

cl

Het materiaal dat niet door het membraan gaat, wordt verzameld en onderworpen aan lyofilisering. De biologische zuiverheid van het ma-30 teriaal, uitgedrukt in anti-coaguleringseenheden, is 193 internationale eenheden/mg en de anti-X -activiteit is 78 internationale eenheden/mg.

Voorbeeld II

De zuivering van.·natriumheparinaat met behulp van ultrafiltratie door een membraan met een afscheiding bij een molecuulgewicht van 5000.

35 Dit voorbeeld is op dezelfde wijze uitgevoerd als voorbeeld I, behalve dat een membraan, waarmee een scheiding mogeljk was bij een molecuulgewicht van nominaal minder dan 5000 werd toegepast. Een voorbeeld hiervan is het membraan Berghoff BM 50. De waarden van de biologische 81 0089 4 ï?--- Λ -5- 21777/Vk/jg activiteit van de stof die het membraan passeert zijn 11 internationale/ eenheden/mg (I.E./mg) en voor het materiaal dat het membraan niet passeert 189 I.E./mg (de anti-X -waarde is respectievelijk 196 en 50 I.E./mg).

& t

Voorbeeld III

5 De zuivering van heparine door middel van hyperfiltratie door een membraan waarmee een afscheiding mogelijk is op basis van een molecuul-gewicht minder dan 600.

Een waterige oplossing van-heparine in de vorm van een natrium-zout of calciumzout of een ander ion kan worden gebruikt, waarvan de con-10 centratie gelegen is tussen 1 en 15%, bij/voorkeur 4?. Deze oplossing werd onderworpen aan hyperfiltratie met behulp van hiervoor geschikte apparatuur voorzien van een toevoerpomp onder een druk tussen 2 en 25 atmosfeer, bij voorkeur hoger dan 5 atmosfeer. De heparineoplossing stroomt laminair door een geschikt membraan, bijvoorbeeld Osmonix Sepa 50, waar-15 mee stoffen kunnen worden gescheiden op basis van het molecuulgewicht bij een waarde van 600. Zodoende werd een stof verkregen die door het membraan gaat (niet-geanalyseerd). Het materiaal dat het membraan niet passeert werd gerecirculeerd. De heparineconcentratie in het gerecirculeer-de materiaal werd constant gehouden door het continu toevoeren van water.

20 op deze manier werden uit de oorspronkelijke oplossing die stoffen verwijderd met een molecuulgewicht lager dan 600, die door het membraan konden worden gevoerd.

In dit experiment werd het natriumzout gebruikt van heparine met 171 I.E./mg met betrekking tot de anti-coagulerende activiteit, hetgeen 25 -een hoge oxyderende kracht heeft, waarbij de oxyderende kracht wordt afgeleid uit het procédé dat wordt toegepast voor de ontkleuring van het materiaal met behulp van waterstofperoxyde of perzuren.

Het natriumzout van heparine dat wordt teruggewonnen uit het materiaal dat hier niet doorgaat heeft een anti-coagulerende activiteit van 30 778 I.E./mg maar geen oxyderende kracht. De opbrengst is hoger dan 40 gew.i.

Voorbeeld IV

De zuivering van heparine .door middel van stroomdialyse voor het verwijderen van oxyderende stoffen.

Waterige oplossingen van heparine in de vorm van het natriumzout 35 en calciumzout of van een ander ion werden toegepast voor» dit experiment.

De concentratie was gelegen tussen 1 en 20%, bij voorkeur bij 5%. De stoffen werden gedialyseerd met behulp van een laminaire stroomdialyse-inrich-ting van het type dat gewoonlijk wordt toegepast voor hemodialyse, be- 81 0089 4 -6- 21777/Vk/jg staande uit holle fibers of uit een aantal lagen, tegen een waterige oplossing met een pH tussen 2 en 3. De pH werd ingesteld met behulp van mineraal zuur. De temperatuur werd gehouden tussen 4 en 7 °C met behulp van hiertoe geschikte koelorganen.

5 De stroomsnelheid die werd toegepast voor dit experiment lag tus- 2 sen 10 en 100 ml/minuut per 0,7 m membraan in de ruimte van de dialyseer- 2 oplossing en tussen 20 en 400 ml/rainuut per 0,7 m membraan in het compart ent met de gedialyseerde vloeistof.

De dialyse-oplossing die het natriumheparinaat bevatte werd ge-10 recirculeerd, terwijl de oplossing in het compartiment van het dialisaat continu werd vernieuwd. De dialyse bleef voortgaan tot oxydatie optrad in de oplossing van de dialysestof, evenals het dialy-saat. Het heparinezuur werd vervolgens omgezet tot calciumheparinaat door neutralisatie met calciuraoxyde en reactie met calciumehloride, gevolgd 15 door een van de bekende conventionele bewerkingen. Het calciumheparinaat dat werd teruggewonnen door alcoholische precipitatie had een anti-coagu-latiewaarde, gelijk aan 156I.E./mg, wanneer natriumheparinaat werd gebruikt als uitgangsmateriaal met een nagenoeg gelijke anti-coagulerende activiteit.

2Ω

Uit het bovenvermelde blijkt dat het membraan dat geschikt is voor ultrafiltratie een afscheiding bewerkstelligt bij nominaal een molecuul-gewicht van 1000-15000 . Het membraan dat geschikt is voor dialyse kan een afscheiding bewerkstelligen op basis van het molecuulgewicht lager dan 30.000. Het glucosaminoglucan kan heparine zijn in de vorm van het 25 natrium- of calciumzout.

4 -CONCLUSIES- * 81 0 089 4

Claims (11)

1. Werkwijze voor het zuiveren van glucosaminoglucan door het afscheiden van verbindingen met een lage of meer specifieke biologische 5 activiteit of inactieve stoffen van glucosaminoglucan, met het kenmerk, dat glucosaminoglucan in de vorm van een zout in een waterige oplossing door een membraan wordt gevoerd dat gebruikt is voor ultrafiltratie, hyper filtratie (inverse osmose) of dialyse met partiële doorvoering door het membraan, waarbij fracties met een lage activiteit door het membraan gaan en fracties met een hogere activiteit het membraan niet passeren en worden ingedampt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de waterige oplossing van het glucosaminoglucan door een membraan stroomt dat geschikt is voor ultrafiltratie, welk membraan een scheiding geeft in afhanke- 15 lijkheid van het molecuulgewicht tussen 1000 en 15.000, ten einde fracties te verkrijgen met verschillende, specifieke biologische activiteiten.

3- Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de waterige oplossing van het glucosaminoglucan door een membraan' stroomt dat geschikt is voor de hyperfiltratie (inverse osmose) met nominale afstoting 20 voor natrium tussen 0 en 75

4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de waterige oplossing van glucosaminoglucan door een filter stroomt dat geschikt is voor dialyse, welk membraan een scheiding geeft op molecuulgewicht, dat minder is dan 30.000.

5. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, .dat de dialy se wordt uitgevoerd met behulp van een hemodialyse.

6. Werkwijze volgens conclusie 1 of 4, met het kenmerk, dat de oplossing, waartegen de dialyse wordt uitgevoerd met betrekking tot de oplossing van het glycosaminoglucan een waterige oplossing is met een pH 30 tussen 2 en 9.

7. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat glucosa-minogluèan heparine is in de vorm van het natrium- of calciumzout.

8. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat natrium-heparinaat met een anti-coagulatie-activiteit van 155 I.E./mg wordt onder- 35 worpen aan ultrafiltratie met een membraan met een afscheiding bij 10.000 en het materiaal wordt teruggewonnen uit dat deel dat niet door het membraan gaat, na lyofilisering een anti-coagulatie-activiteit heeft van 193 I.E./ mg en een anti-X -activiteit van 78 I.E./mg, terwijl de corresponderende 81 0089 4 Ή -8- 21777/Vk/jg activiteit van het permeaat minder is dan respectievelijk 100 I.E./mg en 180 I.E./mg.

9. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat natrium-heparinaat met een anti-coagulatie-activiteit van 155 I.E./mg wordt onder-5 worpen aan ultrafiltratie met een membraan met een nominale afscheiding bij 5000 en een non-permeabel materiaal met een anti-coagulatie-activiteit van 189 I.E./mg en een anti-X -activiteit van 50 I.E./mg worden afge- SI scheiden, terwijl de corresponderende activiteiten van het membraan respectievelijk zijn 11 I.E./mg en 196 I.E./mg.

10. Werkwijze volgens dbnclusie 1, met het kenmerk, dat heparine in de vorm van een anorganisch zout wordt onderworpen aan hyperfiltratie met een membraan met een afscheiding bij 600.

11. Werkwijze volgens conclusie J, met het kenmerk, dat heparine in de vorm van een anorganisch zout wordt gedialyseerd tegen een waterige Ï5 oplossing met een pH van 2-3, heparinezuur wordt teruggewonnen uit de dialyse -op lossing en het heparinezuur wordt omgezet in het calciumzout. Eindhoven, februari 1981. •Φ 81 0089 4