DE1617766C

DE1617766C - Verfahren zur Herstellung von Poly peptidpraparaten mit kallikrein und trypsinhemmender Wirkung

Info

Publication number: DE1617766C
Authority: DE
Inventors: Agnes Dr Tolnay Pal Dr Dora Sandor Budapest Kelemen
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar R T, Budapest
Publication date: 1971-02-11

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptidpräparaten mit kallikrein- und trypsinhemmender Wirkung (nachstehend als aktive Polypeptide bezeichnet) in hoher Reinheit und Konzentration aus gereinigten Tierorganextrakten.

Es ist bekannt, daß zahlreiche tierische Organe, wie z. B. Lunge, Leber, Pankreas, Parotisdrüsen, Niere, Submaxillardrüsen, Milz, Magen, Darm und Muskeln, Polypeptide mit kallikrein- und trypsin hemmender Wirkung enthalten. Die in reiner Form hergestellten aktiven Polypeptide können therapeutisch zur Behandlung von Pankreatitis, ferner für prophylaktische Zwecke bei Bauchoperationen vorteilhaft verwendet werden. Bei den therapeutisch zu verwendenden Präparaten sind eine große Reinheit und geeignete Konzentration unentbehrlich. Die geeignete Konzentration ist wichtig, weil es bei therapeutischen Verwendungen vorteilhaft ist, eine große Menge dieser aktiven Polypeptide mit Hilfe von kleinen Lösungsmengen zu verabreichen.

Es sind zahlreiche Verfahren zur Weiterreinigung und Konzentrierung gereinigter Organextrakte, die solche aktive Polypeptide enthalten, bekannt. Nach der deutschen Patentschrift 1 179 333 werden die vorgereinigten und enteiweißten Polypeptide aus einer wäßrigen Lösung mit Gerbsäure in einem bestimmten pH-Bereich ausgeschieden, und die Entfernung der Eiweißstoffe wird mit Trichloressigsäure, Sulfosalicylsäure oder Perchlorsäure durchgeführt. Der auf diese Weise erhaltene, wasserunlösliche Niederschlag wird in In-HCl gelöst, worauf der Überschuß des Fällungsmittels und der Salzsäure von den aktiven Polypeptiden abgetrennt, die Polypeptide durch Zugabe von Aceton abgeschieden und der· Niederschlag in Wasser gelöst wird. '

Nach den deutschen Auslegeschriften 1146 616, 1 155 563,1181 370 und 1 181 371 werden Polypeptide mit kallikrein- und trypsinhemmender Wirkung aus enteiweißten Lösungen mit Metaphosphorsäure oder Polyphosphorsäure abgeschieden, der Niederschlag wird in einer wäßrigen Alkali- oder Salzslösung gelöst, die Lösung mit Kationen- und Anionenaustauschharzen von den Ionen befreit und dann durch' Eindampfen unter vermindertem Druck und Lyophilisierung konzentriert. '45

. Nach der deutschen Patentschrift 1 084 433 werden die aktiven Polypeptide aus den tierischen Organen mit Hilfe von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln in Gegenwart von Salzen extrahiert, worauf die Polypeptide durch Zugabe von Aceton aus dem Extrakt abgeschieden werden. Der Niederschlag wird in Wasser gelöst, wonach die verunreinigenden Eiweißstoffe durch Zugabe von Sulfosalizylsäure abgeschieden werden. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird mit Hilfe von Kationen- und Anionenaustauschern von den begleitenden Ionen befreit.

Die obigen Methoden sind aus mehreren Gesichtspunkten nachteilig. Die mit Metaphosphorsäure, Polyphosphorsäure oder Gerbsäure abgeschiedenen Polypeptide sind nicht in Wasser, sondern nur in Alkali-, Salz- oder Säurelösungen löslich. Zur Entfernung der durch das Auflösen hineingebrachten Ionen ist ein zusätzlicher Schritt nötig, wodurch auch das Volumen der Lösung beträchtlich erhöht wird. Zum Beispiel wird bei Ausfällung mit Gerbsäure das Lösungsvolumen auf das Dreifache erhöht. Die' erwünschte Konzentration des Endproduktes wird durch langwieriges Eindampfen unter vermindertem Druck und Lyophilisierung erreicht. Mit Hilfe dieser komplizierten Methode kann nur eine verhältnismäßig geringfügige Reinigung erreicht werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durchdie Beseitigung der Nachteile der bekannten Methoden . ein Verfahren zu schaffen, nach dem Polypeptidpräparate mit kallikrein- und trypsinhemmender Wirkung in großer Reinheit und Konzentration hergestellt werden können.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß die aktiven Polypeptide aus einer wäßrigen Lösung, die Sulfosalicylsäure und gegebenenfalls auch niedere Alkohole oder Ketone in einer bestimmten Konzentration enthält, unterhalb einer Temperatur von 15⁰C abgeschieden werden können, und auf diese Weise ein in Wasser leicht löslicher Niederschlag erhalten werden kann. Diese Erkenntnis ist überraschend, weil im Zusammenhang mit der für Enteiweißung allgemein verwendeten Sulfosalicylsäure bisher bekannt war, daß mit ihrer Hilfe die aktiven Polypeptide nicht abgeschieden werden können (deutsche Patentschriften 1 084 433 und 1 155 563). Diese Erkenntnis ist auch deshalb überraschend, weil durch Versuche festgestellt wurde, daß diese Polypeptide bei der Herabsetzung der Temperatur mit anderen Eiweißfällungsmitteln, wie Trichloressigsäure und Perchlorsäure, nicht abgeschieden werden können. So wird z. B. nach der deutschen Patentschrift 1151 859 die zur Entfernung von Eiweißstoffen verwendete Perchlorsäure bei einer Temperatur von 4° C aus der die aktiven Polypeptide enthaltenden Lösung in Form ihres Kaliumsalzes entfernt. In Gegenwart von Perchlorsäure können die aktiven Polypeptide bei dieser Temperatur nicht abgeschieden werden. Im Falle von Gerbsäure, Metaphosphorsäure und Polyphosphorsäure erfolgt die Abscheidung nicht auf Grund einer Temperaturerniedrigung, sondern in einem stark sauren Medium, unter dem Einfluß eines großen Überschusses des Fällungsmittels, und der auf diese Weise erhaltene Niederschlag kann nur in Alkali-, Salz- oder Säurelösungen, nicht aber in Wasser gelöst werden.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptidpräparaten mit kallikrein- und trypsinhemmender Wirkung, in hoher Reinheit und Konzentration aus gereinigten Tierorganextrakten; das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß in einer die genannten Polypeptide enthaltenden wäßrigen Lösung, die nach Enteiweißung der gereinigten Tierorganextrakte erhalten wurde, die Sulfosalicylsäurekonzentration auf einen Wert von 2 bis 10% (Gew./Vol.) eingestellt und die Lösung bis zu einer Temperatur von unter 15° C, zweckmäßig unter O⁰C abgekühlt, der ausgeschiedene Niederschlag abgetrennt und in Wasser gelöst wird, und die in der Lösung gebliebenen Spuren der Sulfosalicylsäure in bekannter Weise entfernt werden, wobei gegebenenfalls der wäßrigen, nach Enteiweißung der gereinigten Tierorganextrakte erhaltenen Lösung vor der Abkühlung niedere Alkohole und/oder Ketone in einer Höchstkonzentration von 30% (Gew./Vol.) zugegeben werden.

Falls die Lösung schon auf Grund des Enteiweißungsprozesses wenigstens 2% (Gew./Vol.) Sulfosalicylsäure enthält, braucht der Lösung keine Sulfosalicylsäure mehr zugesetzt zu werden.

Das auf diese Weise erhaltene Produkt weist eine für therapeutische Zwecke ausreichende Reinheit und Konzentration auf. Es wurde festgestellt, daß die

Claims

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/[enge der abgeschiedenen Polypeptide umso größer austauscherharzes auf Polystyrolgrundlage mit

st, je tiefer die Lösung abgekühlt wird. Die Ab- —(NR₂R₁)P-Wirkungsgruppen der Lösung zugesetzt

cheidung beginnt schon bei 15⁰C; bei 0⁰C scheiden und nachdem sich der pH-Wert der Lösung auf neutral

ich etwa 80% der aktiven Polypeptide aus, und bei eingestellt hat, wird das Harz abfiltriert. Die auf diese

-4⁰C ist die Abscheidung schon beinahe quantitativ. 5 Weise erhaltene Lösung enthält 28 TIE und 7 600 000

Jurch Zugabe von niederen Alkoholen oder Ketonen KIE mit einer Reinheit von 13 TIE/g Polypeptid.

ann die Lösung zwecks Vervollständigung der Aus- . .

;heidung unter 0⁰C abgekühlt werden, ohne daß sie B e ι s ρ ι e 1 2

jfriert. Zu 8 ml einer wäßrigen gereinigten und enteiweißten

Als Alkohole können zweckmäßig Methanol, io Lösung von aus Rinderpankreas hergestellten aktiven

.thanol oder Propanol, als Ketone Aceton, Methyl- Polypeptiden werden 20 ml 96%iger Äthanol und

thylketon oder Dioxan verwendet werden. 14 ml einer 30%'gen (Gew./Vol.) Sulfosalicylsäure-

Das erfindungsgemäße Verfahren hat zahlreiche lösung gegeben; die Lösung der Polypeptide enthält

Orteile. Der mit SuIf©salicylsäure gebildete Nieder- 8 TIE und 2 200 000 KIE in einer Reinheit von

■;hlag ist in Wasser leicht löslich, im Gegensatz zu 15 3,2 TIE/g Polypeptid. Die Lösung wird bis auf -8⁰C

en mit Metaphosphorsäure, Polyphosphorsäure oder abgekühlt und 1 Stunde lang bei dieser Temperatur

Jerbsäure abgeschiedenen Polypeptide, die nur in gehalten. Dann wird der die aktiven Polypeptide ent-

lkali-, Salz- oder Säurelösungen gelöst werden haltende Niederschlag in einer bis auf — 8⁰C ab-

önnen. Dementsprechend sind Schritte, die nach dem gekühlten Zentrifuge abgeschieden. Der Niederschlag

ösen des Niederschlages eine beträchtliche Erhöhung 20 wird in 20 ml Wasser gelöst, und die Spuren von

<is Lösungsvolumens, d. h. die Verdünnung der ak- Sulfosalicylsäure werden mit Hilfe eines Anionen-

ven Polypeptide verursachen, nicht nötig. Der austauschers von Diäthylaminoäthylcellulose-Typ ent-

liederschlag ist in Wasser gut löslich, wodurch man fernt. Die auf diese Weise erhaltene Lösung enthält

ösungen beliebiger Konzentration herstellen kann; 7,1 TIE und 1950 000 KIE in einer Reinheit von

i sind also sowohl die umständliche Destillation 35 11 TIE/g Polypeptid.
nter vermindertem Druck — wobei sich ein Teil der

ktiven Substanz zersetzen würde — als auch das B e i s ρ i e 1 3
yophilisieren überflüssig. Zu 100 ml einer wäßrigen, aus Rinderlunge her-Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine gestellten, gereinigten und mit Trichloressigsäure von eitgehende Reinigung der aktiven Polypeptide und 30 den Eiweißstoffen befreiten, aktive Polypeptide in ann sehr einfach durchgeführt werden. Ein weiterer einer Konzentration von 0,05TIE/ml und 16600KIE/ml orteil besteht darin, daß, falls die Enteiweißung mit und in einer Reinheit von 3,1 TIE/g Polypeptid entulfosalicylsäure erfolgt, die aktiven Polypeptide ohne haltenden Lösung werden 25 ml einer 20°/₀igen ntfernung der Sulfosalicylsäure und ohne Zugabe (Gew./Vol.) Sulfosalicylsäurelösung und 15 ml Meon Chemikalien einfach durch Temperaturerniedri- 35 thanol zugesetzt, worauf die Lösung bis auf —4° C ung abgeschieden werden können. Der aus der Sulfo- abgekühlt wird. Nach 2 Stunden wird der die aktiven ilicylsäure enthaltenden Lösung abgeschiedene Nie- Polypeptide enthaltende Niederschlag bei —4°C durch erschlag enthält nur Spuren von Sulfosalicylsäure, Zentrifugieren entfernt und in 50 ml Wasser gelöst, ie viel einfacher entfernt werden können als die zum Spuren an Sulfosalizylsäure werden mit Hilfe des im bscheiden der Eiweißstoffe verwendete Gesamt-. 40 Beispiel 1 verwendeten Anionenaustauschers entfernt, lenge an Sulfosalicylsäure. Die auf diese Weise erhaltene Lösungenthält 0,09TIEmI Die kallikreinhemmende Wirkung (KIE) wurde nach und 29500 KIE/ml in einer Reinheit von 10 TIE/g /erle — Kaufmann — Boetsch (Hoppe- Polypeptid.
eyler's Z. f. physiol. Chem., 319, S. 52, 1960) und die ■ ■ t_A
ypsinhemmende Wirkung (TIE) nach A η s ο η (J. 45 Beispiel4
ien. Physiol., 22, S. 79, 1939) gemessen. 100 ml einer wäßrigen, aus Rinderparotis herge-Das erfindungsgemäße Verfahren wird an Hand der stellten, gereinigten, aktive Polypeptide in einer Konachstehenden Beispiele näher erläutert. . zentration von 0,0086 TIE/ml und 2700 KIE/ml in ■ . -I₁ einer Reinheit von 4,2 TIE/g Eiweiß enthaltenden B e 1 s ρ ι e 1 1 _{5o Lösung wer(}jen mit 10 ml einer 30%igen (Gew./Vol.) Zu 200 ml einer wäßrigen Lösung, die aus Rinder- Sulfosalicylsäurelösurig versetzt. Die Suspension wird inge extrahierte, gereinigte aktive Polypeptide ent- 2 Stunden bei 20° C stehengelassen. Die ausgeschiedenen alt, werden 20 ml einer 50%'g^en Sulfosalicylsäure- Eiweißverunreinigungen werden durch Zentrifugieren isung gegeben; die Gesamtaktivität der die aktiven entfernt. Der überstehenden Lösung werden 6 ml olypepetide enthaltenden Lösung beträgt 35 TIE und 55 Aceton zugesetzt, worauf die Lösung bis auf — 2°C 00 000 KIE mit einer Reinheit von 2,5 TIE/g Eiweiß. abgekühlt wird. Nach 2stündigem Stehen bei -2⁰C )ie den Niederschlag enthaltende Lösung wird bei wird der aktive Polypeptide enthaltende Niederschlag i)°C 2 Stunden stehengelassen und dann zentrifugiert. durch Zentrifugieren abgetrennt und in 10 ml Wasser )er überstehende Teil der Lösung enthält 31 TIE und gelöst. Spuren an Sulfosalicylsäure werden mit Hilfe 100 000 KIE mit einer Reinheit von 4,8 TIE/g Poly- 60 von 0,5 g des im Beispiel 1 verwendeten Anioneneptid. Die Lösung, die die Sulfosalicylsäure, ferner austauschers entfernt. Die auf diese Weise erhaltene ie von Eiweißstoffen befreiten aktiven Polypeptide Lösung enthält 0,08 TIE/ml und 25000 KIE/ml in iithält, wird über Nacht bei 0⁰C gehalten, wonach einer Reinheit von 13,5 TIE/g Polypeptid.
tr Niederschlag bei dieser Temperatur durch FiI- _v
ieren entfernt wird. Der die aktiven Polypeptide 65 Patentanspruch:
lthaltende Niederschlag wird in 100 ml destilliertem

/asser gelöst. Zwecks Entfernung der Sulfosalicyl- Verfahren zur Herstellung von Polypeptid-

iurespuren werden 2 g eines stark basischen Anionen- präparaten mit kallikrein- und trypsinhemmender

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Wirkung in hoher Reinheit und Konzentration aus gereinigten Tierorganextrakten, dadurch gekennzeichnet, daß in einer die genannten Polypeptide enthaltenden wäßrigen Lösung, die nach Enteiweißung der gereinigten Tierorganextrakte erhalten wurde, die Sulfosalicylsäurekonzentration auf einen Wert von 2 bis 10% (Gew./Vol.) eingestellt und die Lösung bis zu einer Temperatur von unter 15°C, zweckmäßig unter 0⁰C, abgekühlt, der ausgeschiedene Niederschi abgetrennt und in Wasser gelöst wird, und die der Lösung gebliebenen Spuren der Sulfosalic; säure in bekannter Weise entfernt werden, wob gegebenenfalls der wäßrigen, nach Enteiweißui der gereinigten Tierorganextrakte erhaltenen L sung vor der Abkühlung niedere Alkohole und/oci Ketone in einer Höchstkonzentration von 30' (Gew./Vol.) zugegeben werden.