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Verfahren zur Übertragung von sogenannten Immunstoffen von spezifischen Eiweisskörper auf unspezifisches oder mit anders gearteten Immunstoffen beIadenesEiweiss.
In sogenannten Immunseris, d. h. in Seris von Tieren, die mit Bakterientoxinen oder mit Bakterienkulturen, also überhaupt mit sogenannten Antigenen immunisiert worden-sind, oder im Blute von Individuen, die durch das Überstehen einer Infektion Immunität erworben haben, sind die spezifischen Eigenschaften erfahrungsgemäss an das Eiweiss gebunden. Die spezifischen Eigenschaften verteilen sich auf die im Blute vorhandenen Eiweissstoffe nicht gleichmässig, sondern man muss zwischen spezifischem und unspezifische Eiweiss unterscheiden. In den antitoxischen und teilweise auch in den baktericiden Seris, also beispeilsweise im Diphterieund Tetanusserum, ebenso aber auch im Antistreptokokkenserum sowie im Pneumokokkenserum haben sich z. B. als vollkommen unspezifisch erwiesen : das Eiweiss der roten und weissen Blutkörperchen, das Fibrinogen bzw. das Fibrin und die Albumine.
Als eigentliche Träger der spezifischen Eigenschaften kommen also ausschliesslich die Globuline in Frage, aber auch auf diese Gruppe von Eiweisskörpern sind die spezifischen Eigenschaften nicht gleichmässig verteilt, sondern es besteht ein gradueller Unterschied in der Wirksamkeit des unlöslichen oder Euglobulins und der löslichen oder Para-bzw. Pseudoglobuline, und zwar so, dass die letzteren bei weitem als die Hauptträger der spezifischen Kräfte in den Immunseris anzusprechen sind, während die Wirksamkeit des Euglobulins verhältnismässig geringer ist.
Es wurde nun gefunden, dass diese eigenartige Verteilung der spezifischen Wirksamkeit auf einer graduell verschiedenen Affinität oder Anziehungskraft beruht, welche die Eiweisskörper zu den spezifischen Immunstoffen besitzen. Es wurde festgestellt, dass das Fibrinogen und die Albumine keine, das Euglobulin eine geringe und die Para oder Pseudoglobuline die stärkste Affinität für die spezifischen Immunstoffe besitzen.
Diese Erkenntnis wurde durch die Feststellung gewonnen, dass es gelingt, den Euglobulinen
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man an sich unspezifischen Paraglobulinen spezifische Wirksamkeit verleihen oder Paraglobuline von geringer spezifischer Wirkung in stärker wirksames Eiweiss umwandeln kann. Auf demselben Wege gelingt es, Kombinationen von verschieden gearteten Immunstoffen auf ein und denselben Eiweisskörper zu fixieren.
Es wurde fernerhin gefunden, dass die Übertragung der spezifischen Wirksamkeit von einem Eiweisskörper auf den anderen nicht nur bei Verwendung von Eiweisskörpern von ein und derselben Tierart gelingt, sondern auch dann, wenn das Euglobulin aus dem Blute einer Tierart, z. B. Pferdeserum stammt, während die Paraglobuline aus dem Blute einer beliebigen anderen Spezies, z. B. Menschenblut gewonnen waren.
Das Verfahren besteht im einzelnen darin, dass man das Euglobulin, am vorteilhaftesten auf elektroosmotischem Wege, in unlösliche Form überführt und das so isolierte Euglobulin auf gleichfalls elektroosmotisch gewonnenes Paraglobulin einwirken lässt, wobei es gleichgültig
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Im einzelnen besteht das Verfahren demnach aus der Abscheidung von Euglobulin aus spezifischen Immunseris, ferner aus der Darstellung von Paraglobulin aus normalen oder spezifischen Immunseris und drittens aus der Extraktion der spezifischen Immunstoffe aus Euglobulin durch Paraglobulinlösung, welche ihrerseits entweder aus normalen oder spezifischen Immunseris herstammen können.
Da das Verfahren zur Verarbeitung der verschiedenen Sera und die einzelnen Kombinationenderselben eine ganze Reihe gemeinsamer Punkte besitzt, so seien zunächst, bevor auf die Er-
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bei der Verarbeitung der verschiedenen normalen und spezifischen Sera stets in gleicher Weise wiederholen. i. Die Darstellung des Euglobulins.
Zur Darstellung des Euglobulins verwendet man Blutserum oder fibrinogenfreies Blutplasma. Das Serum oder Plasma wird in den Mittelraum des bekannten Dreizellenapparates gebracht und der Einwirkung des elektrischen Stromes unterworfen. Spannung und Stromstärke richten sich hierbei nach dem Elektrolytgehalt des Serums, so dass man am Anfange des Prozesses einen Strom von verhältnismässig geringer Spannung und hoher Stromstärke. am Ende des Versuches dagegen einen Strom von hoher Spannung und sehr geringer Stromstärke erhält. Zu Beginn des Prozesses beträgt die Spannung zirka 20 Volt, die Stromstärke etwa 15 Amp. Spannung und Stromstärke durchlaufen dann alle Phasen, bis man den Versuch bei einer Spannung von 500 Volt und einer Stromstärke von o-i bis 0-2 Amp. abbricht.
Die Gesamtdauer der Einwirkung des elektrischen Stromes bis zur Elektrolytfreiheit beträgt durchschnittlich 2 Y2 Stunden. Die Reaktion im Mittelraum des Apparates ist anfänglich sehr schwach alkalisch. wird aber nach kurzer Zeit neutral, vorübergehend stärker alkalisch, um dann schliesslich in saure Reaktion umzuschlagen. Beim Eintritt der sauren Reaktion beginnt die Ausfällung der Euglobuline, welche ihr Maximum im Moment vollkommener Salzfreiheit erreicht. Auch das Endprodukt besitzt sehr schwache saure Reaktion, welche reinen Eiweisskörpern bekanntlich eigentümlich ist. Nach Beendigung des Prozesses wird der Mittelraum des Apparates entleert. die Euglobuline werden entweder durch Filtration oder mit Hilfe der Zentrifuge gesammelt und mit salzfreiem Wasser sehr gründlich gewaschen.
Das Waschen hat den Zweck, alles noch anhaftende lösliche Eiweiss vollkommen zu entfernen.
Bei Verwendung von spezifischem Serum tritt eine Verteilung der spezifischen Immunkörper auf das ausgefällte Euglobulin und die in Lösung gebliebenen Eiweisskörper zutage, und zwar so, dass etwa der fünfte Teil der spezifischen Immunkörper dem Euglobulin und der Rest dem löslichen Eiweiss anhaftet. Eine Schädigung spezifischer Immunstoffe durch den elektrischen Strom bei der Verarbeitung der Sera im Dreizellenapparat tritt niemals ein, was durch zahlreiche Tierexperimente einwandfrei nachgewiesen wurde.
Für die weitere Verarbeitung wird das Euglobulin in feuchtem Zustande, also als Paste, verwendet.
2. Die Darstellung des Paraglobulins.
Zur Gewinnung von Paraglobulinen aus Serum oder Plasma beseitigt man zunächst, auf elektroosmotischem Wege, wie unter i angegeben, das Euglobulin, vereinigt das Filtrat bzw. Zentrifugat mit den Waschwässern und verarbeitet diese Mischung in bekannter Weise durch fraktionierte Salzfällung. So versetzt man beispielsweise das Gemisch dieser Zentrifugate, Filtrate und Waschwässer mit einem gleichen Volumen gesättigter Ammonsulfatlösung und sammelt das sich hierbei ausscheidende Paraglobulin durch Filtration oder mit Hilfe der'Zentrifuge. Nach gründlichem Auswaschen mit halbgesättigter Ammonsulfatlösung löst man diesen Niederschlag in Wasser und unterwirft die Lösung in Pergamentschläuchen der Dialyse gegen strömendes Wasser, bis Salzfreiheit erzielt worden ist.
Man erhält hierdurch eine annähernd salzfreie, meist schwach gelbgefärbte Lösung, welche zur Konservierung am besten im luftverdünnten Raume bei niederer Temperatur zu einem im Wasser leicht löslichen und dauernd unverändert haltbaren Trockenpräparat eingedampft wird.
3. Die Extraktion von spezifischen Immunstoffen aus Euglo-
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Es hat sich gezeigt, dass man am zweckmässigsten eine 5%ige Paraglobulinlösung zur Extraktion des spezifischen Euglobuline benutzt. Das Euglobulin ist in Paraglobulinlösungen löslich ; um diese Löslichkeit zu erhöhen und der Lösung gleichzeitig die erforderliche elektrische Leitfähigkeit zu verleihen, fügt man der Paraglobulinlösung 0-4 bis 0'5% Kochsalz hinzu. In diese Lösung trägt man die feuchte Paste des Euglobulins ein, und zwar soviel, dass die resultierende Flüssigkeit Paraglobuline und Euglobuline ungefähr in gleicher Menge enthält.
Das Gemisch von Paraglobulinen und Euglobulinen bleibt 24 Stunden bei niederer Temperatur am besten im Eischrank stehen und wird sodann erneut in den Mittelraum eines Dreizellenapparates
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gebracht und der Einwirkung des elektrischen Stromes ausgesetzt. Die Stromrelation ist wiederum die, wie sie oben bei der Herstellung des Euglobulins aus Serum beschrieben worden ist ; ebenso läuft die Reaktion alle Phasen von der Alkalität bis zur Acidität durch und es kommt bei Salzfreiheit zur vollkommenen Abscheidung des Euglobulins.
Dasselbe wird wiederum durch Filtration oder mit Hilfe der Zentrifuge aus der Flüssigkeit beseitigt, wodurch man eine salzfreie Lösung von Paraglobulinen erhält, die sich von der ursprünglichen nur dadurch unterscheidet, dass sie nunmehr diejenigen spezifischen Eigenschaften besitzt, welche vorher dem Euglobulin anhaftet.
Gewichtsanalytisch kann die hierdurch bedingte Zunahme nicht erkannt werden.
Durch die bekannte Präzipitinreaktion mit einem spezifischen Antiserum kann man sich davon überzeugen, dass die auf diesem Wege erhaltene Paraglobulinlösung kein heterogenes Eiweiss enthält.
Die weiteren Einzelheiten des Verfahrens werden am besten aus nachstehenden speziellen Beispielen. ersehen werden können.
Beispiele.
I. Die Übertragung von Diphterieantitoxin aus Pferdeserum auf humanes Eiweiss wurde wie folgt ausgeführt :
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<tb>
<tb> 9'8 <SEP> g <SEP> Trockensubstanz,
<tb> 8'9 <SEP> g <SEP> organische <SEP> Substanz,
<tb> 0#9 <SEP> g <SEP> anorganische <SEP> Substanz,
<tb> 8'i <SEP> µ'Eiweisse <SEP> und <SEP> zwar
<tb> 2. <SEP> 3 <SEP> g <SEP> Euglobulin,
<tb> 4'5 <SEP> g <SEP> Paraglobulin,
<tb> 2-0 <SEP> ? <SEP> Albumin.
<tb>
i c ? des Serums enthält 250 Diphterieantitoxineinheiten. 2 l dieses Serums werden nach dem oben geschilderten Verfahren zur Darstellung des Euglobulins behandelt. Zur Anwendung gelangten also 176 g Eiweiss mit goo. ooo A. E. Es resultierte zum Schluss eine feuchte Paste mit 46 g Trockensubstanz (Euglobulin) und 92. 000 A. E.
Ein humanes Serum enthielt in 100 Teilen
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<tb>
<tb> 9'4 <SEP> g <SEP> Trockensubstanz,
<tb> 8'4 <SEP> g <SEP> organische <SEP> Substanz,
<tb> 1'0 <SEP> g <SEP> anorganische <SEP> Substanz,
<tb> 8'4 <SEP> g <SEP> Eiweiss <SEP> mit
<tb> 2#2 <SEP> g <SEP> Euglobulin,
<tb> 2-0 <SEP> g <SEP> Paraglobulin,
<tb> 4#2 <SEP> g <SEP> Albumin.
<tb>
In dem Serum war keine Spur von Diphterieantitoxin nachweisbar.
Aus I l Serum wurde nun zunächst das Euglobulin nach dem oben unter I geschilderten elektroosmotischen Verfahren beseitigt. Das abgeschiedene Euglobulin wurde gut gewaschen, das Waschwasser mit dem Filtrat bzw. Zentrifugat der elektroosmotisch gewonnenen Euglobulinabscheidung vereinigt und zur Entfernung des Albumins nach der oben unter 2 angegebenen Methode verfahren. Es resultierte eine vollkommen klare Flüssigkeit, welche im Vakuum bei niederer Temperatur eingedampft) 20 g reinstes annähernd salzfreies Paraglobulin lieferte.
Da die Beschaffung von humanem Serum, welches man in Gestalt von Aderlass-oder Operationsblut aus Krankenanstalten gelegentlich erhalten kann, nicht immeJ durchführbar ist, so wird zur Herstellung von humanem Paraglobulin gelegentlich auch Aseitesflüssigkeit verwendet, die erfahrungsgemäss hinsichtlich ihrer qualitativen Zusammensetzung mit dem Blutserum des Menschen vollkommen übereinstimmt und welche von Krankenanstalten leicht in beliebig grosser Menge zu erhalten ist.
Eine frische Ascitesflüssigkeit enthielt in 100 Teilen
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<tb>
<tb> 6#6 <SEP> g <SEP> Trockensubstanz,
<tb> 1#2 <SEP> g <SEP> anorganische <SEP> Bestandteile,
<tb> 5#4 <SEP> g <SEP> organische <SEP> Bestandteile,
<tb> 5#2 <SEP> g <SEP> Eiweiss, <SEP> und <SEP> zwar
<tb> 1#6 <SEP> g <SEP> Euglobulin,
<tb> 1#5 <SEP> g <SEP> Paraglobulin.
<tb>
2#5 <SEP> g <SEP> Albumin.
<tb>
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unter Zusatz von 5 g Kochsalz gelöst. In diese Lösung wurden die aus Diphteriepferdeblutserum in Gestalt einer feuchten Paste isolierten Euglobuline, deren Trockensubstanz 46 g mit einem Antitoxingehalt von 92. 0OC Einheiten betrug, eingetragen. Es erfolgte vollkommen glatte Lösung des Euglobulins. Dieses Gemisch von humanem Paraglobulin und Euglohulin aus Pferdeblut-
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serum wurde nun zunächst 24 Stunden lang bei niederer Temperatur (Eisschrank) sich selbst überlassen und hierauf von neuem in den Mittelraum des Dreizellenapparates gebracht und der Einwirkung des elektrischen Stromes ausgesetzt.
Nach erneuter Abscheidung des Euglobulins wurde eine klare Flüssigkeit erhalten, welche aus reinstem humanem Paraglobulin bestand, und zwar betrug dessen Gesamtmenge wiederum 50 g.
Bei der Antitoxinbestimmung wurde gefunden, dass 1 g dieses humanen Paraglobulins 1000 Antitoxineinheiten enthielt ; es waren demnach aus dem antitoxischen Euglobulin des Pferdeserums. zirka 50% des Antitoxins auf das. humane Eiweiss übertragen worden.
Bei einem weiteren Versuch wurde in dieselbe Lösung des humanen Paraglobulins eine weitere Menge von 50 g aus Diphteriepferdeserum gewonnenen'Euglobulins eingetragen. Der
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Abscheidung dieses Euglobulins wurde eine Lösung von humanem Paraglobulin mit 50 g Trockensubstanz erhalten, in welcher im ganzen zirka r00. 000 A. E. enthalten waren. Diese Lösung wurde im luftverdünnten Raume bei niederer Temperatur soweit eingeengt, dass die nunmehr erhaltene Lösung 10% humanes Eiweiss enthielt. i cm3 dieser Lösung enthielt 200 A. E. Sie stellten somit ein Serum dar, dessen Antitoxingehalt hoch genug war, um zu prophylaktischen und therapeutischen Zwecken praktische Verwendung zu finden.
II. Aus 2 Z Antistreptokokkenserum mit einem Trockengehalt von 9'7%, welcher aus 8'9% Eiweiss und 0'8% anorganischen Stoffen bestand, wurde ebenfalls das Euglobulin auf elektroosmotischem Wege abgeschieden. Es wurde eine feuchte Paste erhalten, deren Trockengehalt 60 g betrug. Eine biologische Prüfung ergab, dass in diesem Euglobulin etwa 25% der . Immunstoffe enthalten waren, welche im ursprünglichen Antistreptokokkenserum nachgewiesen werden konnten.
Andrerseits wurde aus 2 l Pneumokokkenserum 2 1 einer Paraglobulinlösung hergestellt, deren Trockengehalt 48 g betrug. In diese Lösung wurden die 30 g Euglobulin aus Antistreptokokkenserum eingetragen und gleichzeitig mit 10 g Kochsalz zur Auflösung gebracht. Nach der erneuten Abscheidung dieses Euglobulins auf elektroosmotischem Wege resultierte eine Eiweiss- lösung, welche sich sowohl gegen Streptokokken als auch gegen Pneumokokken als wirksam erwies.
Nach einer im luftverdünnten Raum bei niedriger Temperatur vorzunehmenden Konzentration kann dieses Serum zur Bekämpfung von Mischinfektionen von Streptokokken und Pneumokokken verwendet werden,
In gleicher Weise wurden Mischsera aus antitoxischen Seris hergestellt, also beispielsweise ein Serum Antidiphtericum, Antitetanicum oder auch Mischsera mit antitoxischen und baktericiden Eigenschaften.
PATENT-ANSPRÜCHE :
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körpern auf unspezifische oder mit anders gearteten Immunstoffen beladenes Eiweiss, dadurch gekennzeichnet, dass man aus einem Immunserum das Euglobulin abscheidet, dasselbe in Blutserum oder besser in Lösung von Paraglobulin aus dem Blutserum normaler oder immunisierter Individuen auflöst und aus diesem Gemische das Euglobulin von neuem abscheidet.