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Verfahren zur Gewinnung von Heparin
Das Heparin ist ein sulfathaltiges Mucopolysaccharid, welches in einigen tierischen Geweben bzw.
Zellen in verhältnismässig sehr geringen Mengen vorkommt. Es zeigt eine hohe blutgerinnungshemmende
Aktivität und wird auf Grund dieser Eigenschaft als Arzneimittel verwendet.
In Wasser ist das Heparin gut löslich, es kommt aber in den Zellen in einer an Protein gebundenen Form vor und kann nur nach Zerstörung bzw. nach Autolyse der Zellen in wässerige Lösung gebracht werden. Die zur Gewinnung des Heparins angewandten verschiedenen Methoden sind zusammenfassend in der
Monographie von L. B. Jaques und H. J. Bell (Methods of Biochemical Analysis VII, 253-309, Interscience Publ. L. T. D. London) beschrieben. Zur Aufschliessung der Gewebe werden drastische Methoden, wie durch lange Zeit dauernde Autolyse, durch Zugabe eines fremden Enzyms erfolgende vollständige Proteolyse, oder mit chemischen Stoffen durchgeführte intensive Behandlungen angewandt.
Nach einer derartgen Befreiung des Heparins aus den Geweben wird eine schwach alkalische, wässerige, sehr verdünnte, rohe Heparinlösung erhalten, in welcher neben dem geringen (etwa 50-100 mg/l) Heparingehalt grosse Mengen von Eiweissstoffen, Eiweissabbauprodukten, Lipoiden und Geweberesten anwesend sind. Die Menge dieser begleitenden Verunreinigungen kann jene des Heparins mehrere hundertmal, sogar auch tausendmal übertreffen.
Sämtliche bekannten präparativen und industriellen Herstellungsverfahren für Heparin ergeben also als erstes Rohprodukt einen schwach alkalischen wässerigen Extrakt ; das am schwersten lösbare Problem der industriellen Heparinherstellung ist eben die Gewinnung des reinen Heparins aus dieser, viele organische Verunreinigungen neben wenig Heparin enthaltenden grossen Flüssigkeitsmenge ; dabei wird selbstverständlich verlangt, dass das Endprodukt wirtschaftlich, mit wenig Ballaststoffen und mit möglichst wenig Verlust aus diesem Extrakt gewonnen wird.
Die bisher angewendeten Gewinnungsmethoden beruhten auf den folgenden Prinzipien :
Das in Wasser gut lösliche Heparin ist in Alkohol oder in Azeton unlöslich, es wird also ausgefällt, wenn man den heparinhaltigen wässerigen Extrakt mit 1, 5 - 2 Vol. Alkohol oder Aceton versetzt. Unter solchen Bedingungen wird aber mit dem Heparin gleichzeitig auch eine grosse Menge der begleitenden organischen Verunreinigungen aus der Lösung gefällt. Das kann nach der USA-Patentschrift Nr. 2, 79 7, 184 derart vermieden werden, dass man einen grossen Teil der begleitenden Eiweissstoffe vor der Fällung des Heparins entfernt, u. zw. dadurch, dass man den Extrakt zu einem pH-Wert von 2,0 bis 2,5 ansäuert.
Dadurch wird die Hauptmenge der Eiweissstoffe und andern Verunreinigungen ausgefällt, dieser Niederschlag nimmt aber auch den grössten Teil des Heparins mit sich ; das kann nach dieser Methode derart verhindert werden, dass man die Elektrolytkonzentration des Extraktes vor dem Ansäuern durch Zugabe von Alkalisalzen auf mindestens 1 Mol/l erhöht. Wenn das Ansäuern unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, dann wird die Hauptmenge der Eiweissstoffe gefällt, ohne dass diese auch erhebliche Mengen des Heparins mit sich nehmen würden. Das in der wässerigen, saueren Lösung verbleibende Heparin wird dann durch Zugabe von Methanol, Aethanol oder Aceton aus der Lösung gefällt.
Eine ganz andere Methode haben O'Keefe und seine Mitarbeiter (USA-Patentschrift Nr. 2, 552, 50'1) vorgeschlagen ; nach dieser Methode wird der rohe heparinhaltige Extrakt mit Alkylaminen behandelt und das derart gebildete Reaktionsprodukt des Heparins wird mit organischen Lösungsmitteln ausgeschüttelt.
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Die Anwendung von verschiedenen Metallsalzen zur präparativen Reinigung des Heparins wurde zwar schon verschiedentlich vorgeschlagen, aber in anderer Weise und mit andern Zielsetzungen. Bei den be- kannten Verfahren wurden nämlich die Metallsalze entweder zur Entfernung der inerten Verunreinigungen, also in erster Linie der Eiweissstoffe (Salze :. gi. z. B. Homanlens Bioch- und Biophys. Acta 2, [1948J
S. 333 ; sämtliche wasserlösliche Metallsalze : deutsche Patentschrift Nr. 950954 und USA-Patentschrift
Nr. 2, 797, 184), oder zur weiteren Reinigung, bzw. Fraktionierung des aus Organextrakten gewonnenen reinen, aber noch nicht völlig einheitlichen Heparins (Bariumsalze : Charles Scott, Bioch. 30, [1936]
S. 1927 ; Cadmium-Zink-Salze : Deutsche Patentschrift Nr. 806994) angewendet.
Demgegenüber ist die Zielsetzung des erfindungsgemässen Verfahrens eine Fällung des rohen Heparins aus den wässerigen Organextrakten, in welchem der Organextrakt von den Ballaststoffen und von einem überwiegenden Teil der Eiweissstoffe durch Vorbehandlung mit Calciumchlorid weitgehend befreit wird und das Heparin unter Anwendung des im Extrakt verbliebenen Teiles der Eiweissstoffe durch Zugabe von bestimmten Metallsalzen in der Form von Heparin-Protein-Metallkomplexen gefällt wird.
Das in der deutschen Patentschrift Nr. 806994 beschriebene Verfahren und auch die andern ähnlichen
Methoden beziehen sich also auf die Reinigung des schon isolierten Heparin-Rohkonzentrates. Zur Auf- arbeitung des rohen Organextraktes können solche Verfahren wirtschaftlich nicht angewendet werden, da die Behandlung der grösseren Volumina des rohen Extraktes mit organischen Lösungsmittel zu teuer wäre.
Zur Gewinnung des Rohheparins aus diesen rohen Extrakten ist bisher noch immer das weiter oben ausführ- lich behandelte Charles Scott-Verfahren am rationellsten. Dieses Verfahren zeigt aber die bereits er- wähnten Nachteile.
Die Bedeutung des erfindungsgemässen Verfahrens liegt eben darin, dass die grossen Mengen der be- gleitenden Verunreinigungen in solcher Weise entfernt werden können, dass danach kein organisches Lö- sungsmittel mehr zur Abscheidung des Heparins eingesetzt werden muss. Durch Zusatz von entsprechenden
Mengen von Calciumchlorid und durch darauf folgendes Kochen wird eine Koagulation der Proteine von regulierbarem Ausmass erreicht, nach welcher aber noch eine genügende-an sich kleine - Menge von
Proteinen in der Lösung zurückbleibt, um das nachfolgende Fällen des Proteins mit Hilfe eines andern
Metallsalzes in der Form eines Protein-Heparin-Metallkomplexes zu ermöglichen.
Diese beiden Opera- tionen des Verfahrens, also die regulierte, weitgehende, aber nicht vollständige Entfernung der Proteine, nachher die Abscheidung des Heparins mit Hilfe der verbliebenen Proteinmenge mittels eines Metallsal- zes, ergeben wesentliche praktische Vorteile des vorliegenden, sich im Grossbetrieb vorzüglich bewährenden Verfahrens. Die Anwendung dieser beiden Operationen zur Gewinnung des Heparin-Rohkonzentra- tes wurde in der Literatur bisher noch nicht beschrieben.
Die oben erwähnten Eiweissstoffe u. a. begleitende Verunreinigungen können im Sinne der Erfindung derart abgeschieden werden, dass man den Extrakt im pH-Bereich von 8, 5 bis 10, 0 mit einer entspre chender Menge von Calciumchlorid versetzt und einer intensiven Wärmebehandlung unterwirft. Wenn man den schwach alkalischen und mit Calciumchlorid versetzten Rohextrakt nur bis 600 C erwärmt, werden die genannten Begleitstoffe nur teilweise koaguliert, der Extrakt bleibt aber trüb ; wird aber der Extrakt unter entsprechenden Bedingungen zu einer Temperatur von 1000 C oder darüber erhitzt, dann koagulieren die Begleitstoffe in der Form eines massiven Niederschlages und die Lösung kann in wasserklarem Zustand, beinahe verlustfrei dekantiert werden.
Diese Lösung ergibt aber beim Ansäuern keinen Niederschlag mehr (höchstens eine kolloidale Trübung), weil die Träger-Eiweissstoffe schon entfernt wurden und so kann auch das Heparin nicht durch Ansäuern abgeschieden werden.
Es wurde aber festgestellt, dass das Heparin aus den derart vorbehandelten Lösungen sehr vorteilhaft, höchstens in der Begleitung von wenig niedermolekularen Eiweisskörpern gefällt werden kann, wenn man die Lösung mit Al-, Fe- oder Zn-Ionen behandelt. Bei diesem Verfahren werden also sämtliche unerwünschten begleitenden Verunreinigungen des Rohextraktes noch vor der Abscheidung des Heparins entfernt und es wird durch die Zugabe der erwähnten Metallionen ein Protein-Metallkomplex in der eben nötigen Menge hergestellt, welcher dann bei der Abscheidung auch das Heparin mit sich führt.
Die Möglichkeit, dass die Menge des als Trägerstoff dienenden Komplexes durch eine entsprechende Bemessung der Menge der zugesetzten Metallionen reguliert werden kann, ist sehr vorteilhaft, da auf diese Weise einerseits die Abscheidung von überflüssigen Ballaststoffen vermieden werden kann, anderseits aber auch die wegen Mangel an Trägerstoffen eventuell auftretenden Verluste ausgeschaltet werden.
Die Bildung einer optimalen Menge des Trägerkomplexes kann ausser einer entsprechenden Bemessung der Menge der zugesetzten Metallionen auch durch eine entsprechende Regulierung der Menge der bei der mit Hilfe von Calciumchlorid und Wärmebehandlung erfolgenden Proteinabscheidung in der Lösung verbleibenden Eiweissstoffe erreicht werden ; der Anteil der abscheidenden Eiweisskörper hängt nämlich nur von der Men-
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ge des zugesetzten Calciumchlorids ab.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Gewinnung des Heparins aus heparinhaltigen rohen wässerigen
Organextrakten besteht demnach also darin, dass man den rohen Extrakt von den suspendierten und kollo- idalen Verunreinigungen und von dem überwiegenden Teil der mit Säure koagulierenden Eiweissstoffe durch in alkalischem Medium, unter Zusatz von Calciumchlorid erfolgendes Kochen weitgehend befreit, die heparinhaltige klare Lösung von den koagulierten Begleitstoffen trennt und das Heparin aus dieser Lösung durch Zugabe von wasserlöslichen Aluminium-, Eisen- oder Zinksalzen, zweckmässig von Aluminiumsalzen bei pH 2, 0-4, 0, in der Form eines Heparin-Protein-Metallkomplexes fällt und schliesslich den getrennten Komplex mit an sich bekannten Methoden zu reinem Heparin aufarbeitet.
Der optimale pH-Bereich zur Fällung des Heparin-Protein-Metallkomplexes liegt zwischen 2,5 bis
3, 5. Das ist ebenfalls ein vorteilhafter Zug des erfindungsgemässen Verfahrens im Vergleich mit der sau- ren Fällung, welche bei pH-Werten zwischen 2, 0-2, 5 optimalerfolgt ; bei letzterem ist die untere Grenze des pH-Wertes sehr vorsichtig einzuhalten, da das Heparin unter pH 2,0 schon sehr rasch zersetzt wird.
Es ist vorteilhaft, das komplexbildende Metallsalz gleichzeitig mit der zur Einstellung des pH-Wertes dienenden Säure der mit Calciumchlorid vorbehandelten, schwach alkalischen Lösung stufenweise zuzusetzen, da in dieser Weise eine vollständigere Abscheidung erreicht werden kann.
Als komplexbildende Kationen werden Aluminium-, Eisen- oder Zinkionen angewendet. Sehr gute Erfolge werden mit Aluminiumsalzen erreicht, die-vom Heparingehalt abhängend - in einer Menge von etwa 600 - 800 mg Al/1 Lösung angewendet werden können, es werden aber durchaus befriedigende Resultate auch mit entsprechenden Mengen von Eisen- oder Zinksalzen erreicht.
. Die weiteren Einzelheiten und die wichtigsten Vorteile des erfindungsgemässen Verfahrens werden durch die folgenden vergleichenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiel 1 : Von einem nach der Charles-Scott'schen Methode - durch intensive, 24h dauernde Autolyse - gewonnenen Rohextrakt, dessen mit der üblichen Blutgerinnungsmethode bestimmter Wirkstoffgehalt 9,7 IE/ml beträgt, werden je 2 1 zu den einzelnen Versuchen verwendet. Die Flüssigkeit ist dunkelbraun, undurchsichtig ; sie enthält ausser den kolloidalen Verunreinigungen auch suspendierte Or- ganteilchel1 ; ihr pH-Wert ist 8,6. a) 2 1 dieses Rohextraktes werden nach der bekannten Methode aufgearbeitet, indem man die Flüssigkeit mit verdünnter Schwefelsäure bis PH = 2, 3 ansäuert, um das Heparin mit Hilfe der anwesenden Träger-Eiweissstoffe zu fällen. Es wird ein reichlicher Niederschlag erhalten, dessen Volumen nach 24stündigem Sedimentieren 34% des gesamten Flüssigkeitsvolumens beträgt.
Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren weiter verdichtet, dann in zentrifugenfeuchtem Zustand gewogen ; sein Gewicht beträgt 164 g. Die supernatante Flüssigkeit zeigt einen Wirkstoffgehalt von 3, 5 IE/ml, während der Niederschlag einen Wirkstoffgehalt von 84 IE/mg aufweist ; demnach beträgt der gesamte Wirkstoffgehalt des Niederschlags 13000 IE, es wurde also im Niederschlag 71% des gesamten Heparins erhalten. b) 2 l des obigen Rohextraktes werden mit einer Lösung von 26 g trockenem Calciumchlorid in 50 ml Wasser versetzt, das Gemisch wird unter Rühren zum Sieden erhitzt und 5 min gekocht. Es scheidet dabei ein Niederschlag ab, welcher sich nach Abkühlen schwammartig verdichtet und absetzt.
Darüber steht
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;rückbleibende Niederschlag wird mit 200 ml Wasser gewaschen und die Waschflüssigkeit der Hauptmenge der Lösung zugesetzt.
Der auf obige Weise gewonnene vorbehandelte Extrakt, dessen Volumen 2 030 ml beträgt, wird erfindungsgemäss mit Aluminiumchlorid behandelt. Zu diesem Zweck wird zuerst durch potentiometrische Titrierung eines entnommenen Teiles die zur Einstellung des pH-Wertes der Lösung auf 3, 0-nötige Menge von Seiger Salzsäure festgestellt. Diese Menge eiger Salzsäure (im gegebenen Fall 33,4 ml) wird mit 9,6 ml100/0iger AlCl3-Lösung versetzt und dieses Gemisch wird zur Fällung des Heparin-Protein-Metallkomplexes aus der vorher mit 4,8 ml 10' iger AlCl-Lösung versetzten Lösung verwendet.
Das Gemisch der Säure und der AICI-Lösung wird langsam, innerhalb von 10 min, unter stetigem Rühren, tropfenweise zugesetzt, das Rühren wird noch 10 min fortgesetzt und dann wird das Reaktionsgemisch über Nacht zur Sedimentierung des Niederschlages stehen gelassen.
Am nächsten Tag wird die wasserklare Lösung von sedimentierten Niederschlag (welcher nach der Sedimentierung etwa 7, 55o des gesamten Flüssigkeitsvolumens einnimmt) dekantiert und der Niederschlag durch Zentrifugieren verdichtet und abgetrennt. Es werden 30,5 g zentrifugenfeuchter Niederschlag erhalten, welcher eine Heparin-Aktivität von 530 IE/g zeigt, während der Heparingehalt der dekantierten supernatanten Flüssigkeit weniger als l, l E/ml ist. Der gesamte Heparingehalt des Niederschlages ist 16200 IE, das entspricht einer Heparinausbeute von 83%.
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Der Vergleich der beiden Ergebnisse zeigt, dass das erfindungsgemässe Verfahren ein Heparin-Rohprodukt von 6,3-mal grösserer Konzentration (530 gegenüber 84 IE/g) liefert, mit einer um 120 höheren Gesamtausbeute.
Beispiel 2 : Aus 800 kg Rindslungen werden nach der im ungarischen Patent Nr. 148. 661 beschrie- benenMethode 1560 1 Rohextrakt hergestellt. Aus diesem gelbbraunen, viel Eiweissstoffe und Lungenteilchen enthaltenden schwach alkalischen (PH = 8,6) Rohextrakt kann das Heparin im Sinne der vorliegenden Erfindung folgendermassen gewonnen werden :
Zum Rohextrakt wird unter langsamen Rühren eine konzentrierte wässerige Lösung von 20 kg Calciumchlorid (auf wasserfreiem CaCl berechnet) zugesetzt, dann wird das Gemisch unter fortgesetztem Rühren bis zum Sieden erhitzt und 5 min gekocht.
Dann wird das Gemisch bis 25 - 300 C abgekühlt, die klare, gelb liehe Flüssigkeit vom abgesetzten schwammartig koagulierten Niederschlag mit Hilfe eines Drahtsiebes getrennt und der Niederschlag wird verworfen. Das Volumen des Filtrates wird pünktlich festgestellt (1 350 1), dann wird mittels einer entnommenen Probe (l l) die zur Einstellung des pH-Wertes auf 3, 0 nötige Menge von konzentrierter Salzsäure bestimmt. Diese Menge beträgt bei der Probe von 1 l 5,4 ml; zur ganzen Menge des Filtrates sind also 7, 31 konzentrierte Salzsäure nötig.
In dieser Säuremenge werden 650 g AlCL (auf wasserfreiem Salz berechnet) gelöst und diese Lösung wird dem Filtrat langsam, unter stetigem Rühren, innerhalb von 10 min zugesetzt. Dann wird das Rühren noch 10 min lang fortgesetzt, dann wird das Gemisch über Nacht stehen gelassen. Am nächsten Tag wird die wasserklare supernatante Flüssigkeit vorsichtig vom schneeweissen, lockeren Niederschlag dekantiert, dessen Volumen nach dem Sedimentieren 117 1 beträgt. Die dekantierte Flüssigkeit zeigt einen Wirkstoffgehalt von 1, 8 lE/ml, während der gesamte Wirkstoffgehalt des Niederschlages 18 Millionen IE beträgt.
Die Aufarbeitung dieses Niederschlages kann in an sich bekannter Weise erfolgen, z. B. derart, dass man den durch Dekantieren abgetrennten und zu einem pH-Wert von 8, 5 eingestellten Niederschlag mit 5 g/l trockenem gepulverten Pankreas versetzt und mit wenig Toluol bedeckt und 48h unter Aufrechterhalten des obigen PH-Wertes bei 400 C behandelt. Dann wird das Gemisch mit Salzsäure und Trichloressigsäure angesäuert, filtriert und das in der Lösung befindliche Heparin durch Zugabe von 2 Volumenteilen vom Aethanol gefällt. Der Niederschlag wird in Wasser gelöst, mit Natriumkarbonat zu Heparin-Na-
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wird dann durch Fraktionieren mit Alkohol aus der Lösung gefällt.