DE1642592C

DE1642592C - Verfahren zur Gewinnung von praktisch Fremdoxydase freier Glucose oxydase

Info

Publication number: DE1642592C
Application number: DE19671642592
Authority: DE
Inventors: Hans Ulrich Dr rer nat 8132 Tutzmg Gruber Wolfgang Dr phil nat 8132 Garatbhausen Moellering Hans Thum Waldemar 8132 Tutzing Bergmeyer
Original assignee: Boehnnger Mannheim GmbH, 6800 Mann heim
Priority date: 1967-11-20
Filing date: 1967-11-20
Publication date: 1973-04-12

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von praktisch fremdo.xydasefreier Glucoseoxydase.

Es sind bereits mehrere Verfahren zur Gewinnung von Glucoseoxydase bekannt. Bei einem Verfahren wird die Glucoseoxydase aus dem wäßrigen Extrakt mit einer Suspension von Nntriumgluconat in Äthanol gefällt. Dieses Verfahren führt jedoch zu einem Produkt, welches eine für die Glucosebestimmung ?u hohe Menge an Aminoxydasen enthält. Auch andere Laboratoriumsmethoden sind bekannt, die zwar in zahlreichen Reinigungsschritten zu einem verhältnismäßig stark angereicherten Präparat führen, welches jedoch immer noch unerwünscht hohe Aminoxydasegehalte aufweist.

Es besteht daher ein Bedarf nach einem Verfahren zur Gewinnung von praktisch fremdoxydasefrji;r Glucoseoxydase.

Die Wirkung verschiedener Fällungsmittel auf die Ausfällung des Enzyms Glucoseoxydase ist bereits untersucht worden. Neben vieien anderen Fäiiuiigimitteln wurde dabei auch schon Methanol auf seine Brauchbarkeit untersucht. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse zeigten, daß Methanol zu diesem Zweck 'ihr schlecht geeignet ist und bei einem Zusatz von 50 Volumprozent nur zu einer Ausbeute von etwa H⁰O führt und auch mit wesentlich höheren Konzentrationen Ausbeuten von 5O⁰Zo nur knapp erreicht werden. Andere Fällungsmittel, insbesondere andere Alkohole, liefern demgegenüber wesentlich bessere Ausbeuten.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß bei ganz bestimmten Temperatur- und pH-Wert-Bedingungen und Einhaltung einer ganz scharf begrenzten Fällungsmittelkonzentration das Methanol sich völlig anders verhält, als die bekannten Untersuchungen erwarten ließen, und zu einem Glucoseoxydaseprodukt führt, welches praktisch frei ist von Fremdoxydase (Aminooxydase) und in ausgezeichneter Ausbeute anfällt.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von praktisch fremdoxydasefreier Glucoseoxydase aus einer in an sich bekannter Weise vorgereinigte Glucoseoxydase enthaltenden wäßrigen Lösung ist nun dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Lösung bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5 unter Einhaltung einer Temperatur von 15 bis 25° C, vorzugsweise von 19 bis 21° C, mit Methanol auf 58 bis 62 Volumprozent versetz» Mnd den gebildeten Niederschlag abtrennt. Hierbei ist es vorteilhaft, einen pH-Wert von 7,0 einzuhalten.

Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich sowohl frisch gewonnene Glucoseoxydaseextrakte als auch Lösungen handelsüblicher Präparate, die erhebliche Mengen an Aminoxydasen enthalten. Die Glucoseoxydase findet sich zwar in zahlreichen Geweben, besonders günstige Ausgangsmaterialien zu ihrer Gewinnung sind jedoch Penicillium- und Aspergillus-Stämme, insbesondere Aspergillus niger und Penicillium notatum. Durch einfache wäßnge Extraktion dieser Mikroorganismen und Abtrennung der unlöslichen Feststoffe in bekannter Weise lassen sich vorgereinigte Glucoseoxydase enthaltende wäßrige Lösungen gewinnen, auf die das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft anwendbar ist.

Das Verfahren der Erfindung läßt sich aber ebenso vorteilhaft zur Reinigung von bereits angereicherten handelsüblichen Glucoseoxydasepräparaten verwenden. Hierbei erfolgt nicht nur eine Beseitigung der störenden Aminoxydasen, sondern auch eine weitere beträchtliche Anreicherung.

Gut geeignet für das Verfahren der Erfindung sind Glucoseoxydasepräparate mit einer Mindestaktivität von etwa 7 bis K) U/mg. Ausgezeichnet sind handelsübliche Glucoseoxydasepräparate mit einer spezifischen Aktivität um 20 U mg. Bei Verwendung von rohen Extrakten sollte vorteilhaft eine Anreicherung nach einem der bekannten Verfahren durchgeführt werden, falls die Aktivitätswerte wesentlich unter dem oben angegebenen Bereich von etwa 7 bis 10 U mg liegen. Hierfür eignet sich beispielsweise das in Colowick und Kaplan »Methods in Enzymology«. Vol. I, S. 340 bis 345, beschriebene Verfahren Für das Verfahren der Erfindung können auch G'ucoseoxydasepräparate mit wesentlich höheren Aktivitatswerten verwendet werden.

Von besonderer Bedeutung für das erfindungsgeiviäße Verfahren ist eine genaue Einhaltung der Temperatur und pH-Wert Bedingungen. Die Temperatur sollte zur Erzielung bester Ergebnisse auf 20 ± 1 C gehalten werden. Brauchbare Ergebnisse werden auch noch zwischen 15 und 25 C erhalten. Der pH-Wert soll zwischen pH 6.5 und 7.5 liegen, vorzugsweise bei pH 7,0. Da sich der pH-Wert wahrend der Methanolfällung zum alkalischen Bereich hin verschiebt, muß zur Einhaltung des erwähnten Bereiches zumeist etwas Säure zugesetzt werden. Bei einer Verschiebung des pH-Wertes auf die saure Seile des angegebenen Bereiches wird zwar die Filtrierbarkeit der erhaltenen Fällung verbessert, die Abtrennung der unerwünschten Fremdoxydasen wird hierbei jedoch verschlechtert. Die günstigsten Ergebnisse werden bei pH 7,0 erzielt.

Der Methanolzusatz erfolgt auf 58 bis 62 Volumprozent. Um eine vollständige Abtrennung der Aminoxydasen zu gewährleisten, sollen etwa 5 bis 10⁰/o der Glukoseoxydaseaktivität im Überstand verbleiben. Bei den obenerwähnten bevorzugten Temperatur- und pH-Wert-Bedingungen wird bei einem Zusatz von 58 Volumprozent Methanol eine Ausbeute von etwa 90 bis 95 Vo eines hochgereinigten Prodtiktes erhalten.

Zwischen der Temperatur, bei der die Methanolfällung durchgeführt wird, und dem Volumprozentsatz an zugesetztem Methanol besteht ein Zusammenhang insofern, als bei den höheren Temperaturen im angegebenen Bereich auch der Methano'->rozentsatz an der oberen Grenze ausgenutzt werde., .»ann, d. h., bei einer Temperatur von 24 bis 25° C können bis 62 Volumprozent Methanol zugesetzt werden.

Die Ausfällung der Glucoseoxydase unter den angegebenen Bedingungen erstreckt sich über einen gewissen Zeitraum. Es ist daher vorteilhaft, die mit Methanol versetzte Lösung noch einige Zeit unter exakter Einhaltung der angegebenen Bedingungen stehenzulassen, vorzugsweise mindestens 1 Stunde lang. Anschließend wird der Niederschlag unter Aufrechterhaltung der Temperatur abgetrennt.

Zur Abtrennung des Niederschlages werden vorteilhaft Filtrierhilfsmittel zugesetzt. Hierzu eignen to sich die bekannten handelsüblichen Filtrierhilfsmittel. Es ist jedoch darauf zu achten, daß keine Filtrierhilfen verwendet werden, welche auf die Aktivität des Enzyms eine schädliche Einwirkung haben.

Bei Verwendung von Filtrierhilfsmitteln läßt sich der Niederschlag leicht abfiltrieren bzw. mittels Fi'terpressen abtrennen. Wenn keine Filirierhilfsn ittel angewendet werden, kann das Produkt direkt !^zentrifugiert und in der so gewonnenen Form nach Trocknen mit Luft verwendet werden.

Bei Verwendung von Filtrierhilfsmitteln erfolgt i/ach der Ausfällung eine Abtrennung des Enzyms durch Auflösen in Wasser mit neutralem bis schwachvaurein pH-Wert. Abtrennung des Unlöslichen. Einengen des Filtrats und Lyophilisieren. Vorzugsweise wird zur Auflösung bzw. Aufschlämmung des filtriernilfsmiuelhaltigen Präparates Wasser von pH 5 bis 6 verwendet. Es können jedoch auch außerhalb des Bereiches liegende pH-Werte angewendet werden, wobei jedoch die bekannten Grenzen der pH-Wertsiabilität des bnzyms eingehalten werden sollen. Diese Grenzen liegen bei etwa pH 3.5 und 8.0. Wenn sor der Lyophilisierung die Glucoseoxydaselösung konzentriert wird, so erfolgt dies vorzugsweise im Vakuum bei nur mäßig erhöhten Temperaturen. Vor-(eilhaft sollte eine Temperatur von etwa 4V C nicht überschritten werden. Besonders gute Ergebnisse werden bei etwa 37 C erzielt.

Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu einem von Fremdoxydasen praktisch freien Produkt. Als frei von störender Fremdoxydase, insbesondere Aminoxydase. wird im Rahmen der Erfindung ein Produkt angesehen, welches bei 25' C. einer Aktivität von K)U ml, bei 436 nm und 1 cm Weglänge im Photometer eine Extinktionsdifferenz von weniger als 0,010 pro Stunde ergibt.

Die Durchführung der photometrischen Reinheitsbestimmung wird in einem Reagens durchgeführt, welches wie folgt zusammengesetzt ist:

100 ml Phosphatpuffer (0,1 Mol, pH 7,0)
1 mg Peroxydase

6,6 mg o-Dianisidin (in Form einer Lösung von 6,6 mg/ml)

Abgesehen von der Entfernung der Fremdoxydasen, welche bei der Verwendung der Glucoseoxydase zur Bestimmung von Glucose erhebliche Störungen verursachen und bisher die Herstellung von Testpräparaten, welche in Lösung einen ganzen

Tag lang verwendbar bleiben, unmöglich machten, führt das erfindungsgemäße Verfahren auch zu einer weiteren Anreicherung um etwa 300 °/o. Bei Verwendung einer handelsüblichen Glucoseoxydase von 20 U/mg als Ausgangsprodukt führt das Verfahren zu einem Produkt von etwa 60 U/mg.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß es auch in technischem-Maßstab ohne Schwierigkeiten durchführbar ist und keine teuren Hilfsreagenzien benötigt.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern.

Beispiel 1

10 kg handelsübliche Glucoseoxydase mit einer spezifischen Aktivität von 20 U mg werden in 195 1 voll entsalztem Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung wird auf 7,0 und die Temperatur auf 20"C eingestellt. Dann wird unter laufender pH-Wertkorrektur mit 2 η-Salzsäure auf 7.0 bis 2701 Methanol auf eire Methanolkonzentration von 58 Volumprozent versetzt. Die mit Methanol versetzte Lösung wird bei genau 20 C anschließend etwa 1 Stunde lang stehengelassen. Dann werden 5 kg Hyflo-Supercel (Filtrieriiilfsmittel der Firma Mansfield USA) zugesetzt und der Niederschlag in einer Filterpresse abgetrennt.

Der Filterkuchen wird mit 501 kaltem voll entsalztem Wasser 15 Minuten schaumfrei homogenisiert. Dann wird der pH-Wert der Suspension mit 2 η-Salzsäure auf. 6,0 eingestellt und die erhaltene Suspension filtriert.

Das Filttat wird bei 35 bis 40 C im Glasumlaufverdampfer auf etwa 20 1 eingeengt und lyophilisicrt. Ausbeute etwa 3 kg Glucoseoxydase mit einer Aktivität von etwa 6OU mg. Dies entspricht einer Ausbeute von 9O°/o der Ausgangsaktivität.

Das erhaltene Produkt zeigt bei 436 nm in der 1-cm-Küvette bei 25 C eine Extinktionsdifferenz von weniger als 0,010 pro Stunde. Das eingesetzte handelsübliche Präparat ergibt unter den gleichen Bedingungen eine Extinktionsdifferenz von etwa 0,08 pro Stunde.

Beispiel 2

5 g einer aus Mycel durch direkte Extraktion mit salzhaltigem Wasser und Fällung der Proteine mit Alkohol erhaltenen Rohoxydase wurden in 100 ml H₂O gelöst und auf pH 6,0 eingestellt. Der Salzgehalt der Lösung war < 0,01 Mol. U/mg = 1,23.

97 ml dieser Lösung = 4,85 g wurden bei 20' C auf 61 "/ο Methanol gebracht, der pH-Wert mit wenig HCl auf 6,9 zurückgestellt und zentrifugiert. Der aufgenommene Niederschlag enthielt die Glucoseoxydase. Nach einer Glucoseoxydase- und Aminooxydasebestimmung wurde eingeengt und der Rückstand getrocknet.

In der folgenden Tabelle werden die hierbei erzielte Anreicherung und Reinigung dargestellt.

Schritt	Gewicht	Glucoseoxydase- Aktivität	U/mg	Fremd oxydasen	Aus beute
Gelöste Glucoseoxydase	4,85 g 0,150 g	6 -10» 4,5 · 10* 5,5 · 10»	1,23 36,5	0,015 <0,001	100 »/ο 7,5% 91 °/o
Methanolzusatz auf über 61 Volumprozent Nach Methanolzusatz auf 61 Volumprozent erhaltener Niederschlag

Zum Nachweis des technischen Fortschrittes wurde· η Vergleichsversuche durchgeführt, bei denen ein bestimmtes zu reinigendes Glucoseoxydasepräparat einerseits nach dem Verfahren der Erfindung und andererseits nach den bekannten Verfahren gereinigt und jeweils die nach der Reinigung verbleibende Fremdoxydaseaktivität in gleicher Weise bestimmt wurde.

Zur Durchführung der Versuche wurde in allen Fällen ein GOD-Präparat mit einer Aktivität von 1,95 U/mg und einem Fremdoxydasewert von A EIh = 0,050 eingesetzt. Der Wert Δ EIh wurde bei 25°C, lern Meßlänge, 436nm, bei lOUGOD/ml Testvolumen mit Peroxydase und o-Dianisidin, wie oben beschrieben, gemessen.

Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der Versuche gemäß der deutschen Auslegeschrift 1198 772. Bei den Versuchen wurde ein Gewichtsverhältnis GOD: Natriumgluconat von 1:1 eingehalten. Die Versuche entsprechen den in Tabelle II der deutschen Auslegeschrift 1198 772 angegebenen Bedingungen, jedoch ίο wurden je Fällungsmittel nur drei verschiedene Volumina eingesetzt.

Tabelle Fallungsmittel

Volumen

Im Niederschlag

GOD

Fremdoxydasen Δ E/h

GOD*·

U/mg

GOD-Lösung, 50 mg/ml
Äthanol 95°/„ig

Isopropanol 99°/,ig

Methanol 99°/,ig

Aceton 99°/„ig

1,5
2,0
3,0

1,0
1,5
2,5
1,5
2,0
3,0

1,5
2,0
3,0

100
100

97

76
100

92,5
100

92

96,5
100

82

82
100

0,050

0,055

0,073

0,055

0,040

0,060

0,100*

0,020

0,024

0,067

0,060

0,103

0,136*

1,94 1,62 0,75 0,94

4,3 1,0 0,59

1,12 0,78 0,33 1,22 0,63 0,44

* Mögliche Aktivierung der Frcmdoxydase.

** Bei steigender Zugabe von organischen Lösungsmitteln wird Na-Gluconat mit ausgefällt. Die spezifische Aktivität der GOD sinkt dabei.

Tabelle 2 zeigt die nach dem Verfahren der USA.-Patentschrift 2 926 122 erhaltenen Werte. Die verwendeten Fallungsmittel entsprechen deren Beispielen 3, 4 und 5 und deren Patentanspruch 3.

Tabelle Fällungsmittel

Volumen
zugesetzt

Im Niederschlag

GOD

U/

Fremdoxydasen Δ E/h

GOD

U/mg

2
3
1
2
1
2

100
64,5
72,2
76,5
72
90
76,4

0,050 0,070 0,050 0,107 0,080 0,043 0,100

1,94 4,2 3,1 4,13

1,77

7,1 2,4

GOD-Lösung, 50 mg/ml

1 Volumen Isopropanol mit 1 Volumen Methanol ί gemischt \

n-Propanol \

1 Volumen n-Propanol mit 2 Volumen Isopropanol ( gemischt \

Tabelle 3 zeigt die Durchführung des Verfahrens Lösung in das zur Diagnose verwendete Testsystem gemäß USA.-Patentschrift 3 265 587. Hierbei ist zu fällt ein gefärbter Niederschlag durch überschüssige bemerken, daß die Messung der Fremdcxydasen und 55 Bariumionen aus. Um diese Schwierigkeit zu beseidamit auch die Verwendung der erhaltenen GOD zu tigen, wurde zur Bestimmung von GOD und Fremddiagnostischen Zwecken nach einer BaCl₂-Abtren- oxydase nach der Bariumionenzugabe vorher ernung nicht möglich ist, denn bei Einsatz der GOD- schöpfend dialysiert.

Tabelle

Fallungsmittel	<NH,)_SSO, Mol	Im Überstand GOD 7o	l-remdoxydasen .1 *EIh*
GOD-Lösung, 50 mg/ml CaCIs, 93 °/₀ der Theorie BaCI₂, 100⁰/₀ der Theorie	0,88 0,175 O	100 80 47,5	0.040 0,050 0,120

Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse nach dem Verfahren der USA.-Patentschrift 3 269 918. Zu bemerken ist, daß dieses Verfahren so aufwendig ist, daß eine Übertragung in den technischen Maßstab kaum möglich ist.

Tabelle

Schritt GOD, %

Frcmdoxydasen, Δ Ejh

Enzymlösung, 50 mg/ml

Ammoniumsulfatfraktion nach Dialyse pH = 4,5

Chromatographie (DE-52)

a) Durchlauf

b) Waschwasser (0,07 Mol Acetatpuffer pH = 4,5) .

c) Eluate vereinigt (0,1 Mol Acetatpuffer pH = 3,7)

100
86

3,2
25
66

0,050
0,053

nicht getestet
0,025
0,030

Tabelle 5 zeigt unter den oben erwähnten Bedingungen die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Ergebnisse.

Tabelle Fällungsmittel

Gehalt der der GOD-	GOD Vq	Im Niederschlag
Lösung an	100
Methanol 7o	88	U/mg
0	85	1,95
59°/o	10,8
60°/„	8,6

Fremdoxydase Λ E/h

GOD-Lösung, 50 mg/ml
Methanol

Die obigen Vergleichsversuchsergebnisse zeigen, daß nach der erwähnten deutschen Auslegeschrifi nur eine völlig unbefriedigende Abtrennung der Fremdoxydasen, nach den Verfahren der USA.-Patentschriften praktisch überhaupt keine Abtrennung der 0,050

0,0016

0,0045

Fremdoxydasen möglich ist. Beim erfindungsgemäßer Verfahren hingegen wird in einem einzigen Arbeitsschritt eine Verringerung des Fremdoxydasegehaltes bis auf weniger als 5 Vo des Ausgangswertes bei gleichzeitig mehr als vierfacher Reinigung der GOD erzielt

309615/4

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von praktisch fremdoxydasefreier Glucos^oxydase aus einer in an sich bekannter Weise vorgereinigte Glucoseoxydase enthaltenden wäßrigen Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Lösung bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5 unter Einhaltung einer Temperatur von 15 bis 25° C, vorzugsweise von 19 bis 21° C, mit Methanol auf 58 bis 62 Volumprozent versetzt und den gebildeten Niederschlag abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein pH-Wert von 7,0 eingehalten wird.