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Verfahren zur Reinigung von Antibiotika der Tetracyclinreihe Die Erfindung
betrifft die Reinigung von unreinen Tetracychnantibiotika, insbesondere die Reinigung
von Chlortetracyclin.
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Seit der Entdeckung der Tetracyclinantibiotika, Chlortetracyclin,
Oxytetracyclin, Tetracyclin und Bromtetracyclin, wurden zahlreiche Verfahren zur
Gewinnung dieser Stoffe in pharmazeutisch annehmbarer Form vorgeschlagen. Einige
dieser Verfahren sind zwar verhältnismäßig einfach, doch wird durch die vorliegende
Erfindung ein diesen überlegenes Verfahren geschaffen, um diese Antibiotika in hochgereinigter
Form bei einem Minimum an Verarbeitungsstufen und unter Verwendung billiger Lösungsmittel
und Vorrichtungen zu erhalten.
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Ein bereits bekanntes Verfahren zur Gewinnung von Chlortetracyclin
aus Gärflüssigkeiten besteht darin, Chlortetracyclin unlöslich zu machen, die Lösung
zu filtrieren und den Filterkuchen mit einem organischen Lösungsmittel zu extrahieren.
Das Antibiotikum wird daraus dann nach Verringerung des Volumens und der Temperatur
durch Kristallisation erhalten. Dieses Verfahren ist zwar einfach, jedoch noch nicht
völlig zufriedenstellend, da die Ausbeuten verhältnismäßig niedrig sind und das
Produkt nicht die gewünschte Qualität aufweist.
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Bei einem anderen bekannten Verfahren, das sich im wesentlichen der
vorstehend beschriebenen Maßnahmen bedient, wird der durch alkalische Fällung aus
der filtrierten Fermentationsflüssigkeit erhaltene Niederschlag mit angesäuertem
Isopropanol extrahiert und der Isopropanolextrakt mittels Natriumchlorid ausgesalzen
und dekantiert, ehe er konzentriert wird.
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Die vorliegende Erfindung stellt nun insofern eine ausgesprochene
Verbesserung dar, als dadurch bei vereinfachter Arbeitsweise beträchtlich höhere
Ausbeuten und eine pharmazeutisch reine und annehmbare Qualität des Antibiotikums
bei der ersten Kristallisation erhalten werden.
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DieErfindung eignet sich insbesondere für die Isolierung und die Kristallisation
von Chlortetracyclin, doch hat sie sich auch bei der Isolierung anderer Antibiotika
der Tetracyclinreihe, wie der obenerwähnten, als brauchbar erwiesen. Die folgende
Beschreibung befaßt sich hauptsächlich mit der Gewinnung therapeutisch reinen Chlortetracyclins
aus dieses enthaltenden Gärflüssigkeiten. Es sei erwähnt, daß die im folgenden angegebenen
allgemeinen Richtlinien selbstverständlich auch in gleicher Weise für die Reinigung
anderer Antibiotika dieser Reihe bei der Gewinnung aus ihren wäßrigen Lösungen zutreffen.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Reinigung unreiner Tetracyclinantibiotika
wird ein unreines Tetracyclinantibiotikum mit einem polaren organischen Lösungsmittel
behandelt, das wenigstens 1 Moläquivalent Magnesiumchlorid, Calciumchlorid, Strontiumchlorid,
a Zinkchlorid oder Bariumchlorid enthält, und danach das Antibiotikum in gereinigter
Form aus der so erhaltenen Lösung gewonnen.
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Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wie es auf
die Reinigung von unreinem Chlortetracyclin angewandt wird, wird eine saure Lösung
des unreinen Chlortetracychns hergestellt und zur Entfernung unlöslicher Verunreinigungen
bei einem pH-Wert von etwa 1,5 filtriert.
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Die Wasserstoffionenkonzentration der Lösung wird dann mit einem Alkali,
beispielsweise mit Ammoniak, Ammoniumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Natriumhydroxyd,
Calciumhydroxyd, Bariumhydroxyd, Natriumcarbonat, Triäthylamin oder anderen Aminen
u. dgl, auf einen p11-Wert im Bereich von 4 bis 12 gebracht. Dadurch wird ein unlöslicher
Niederschlag von Chlortetracyclin gebildet, wenn Calciumionen in der Lösung vorhanden
sind. Gewöhnlich sind in den Gärflüssigkeiten genügend Calciumionen vorhanden, so
daß sich die Einstellung der Lösung mit weiteren Calciummer,_;en im allgemeinen
erübrigt. Es soll wenigstens 1 Mol Calciumionen je Mol in der Lösung, deren pH-Wert
mit Alkali erhöht wird, enthaltenem Chlortetracyclin vorhanden sein. Wenn rohes
Chlortetracyclin erfindungsgemäß gereinigt werden soll, ist es nicht nötig, den
erwähnten unlöslichen Niederschlag zu erzeugen. Das Rohmaterial kann, falls erwünscht,
nach der im folgenden beschriebenen Arbeitsweise extrahiert werden.
An
Stelle der Calciumionen kann die Lösung eine äquivalente Menge an Barium- oder Magnesiumionen
enthalten, da diese ungefähr die gleiche unlöslich machende Wirkung wie Calcium
besitzen.
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Die Fällungstemperatur ist nicht kritisch, und jede Temperatur vom
Gefrierpunkt, 0° C, bis zu einer Temperatur, bei welcher Chlortetracyclin instabil
ist, etwa 50°C, ist geeignet. Der Niederschlag fällt rasch aus. Lange Zeit beanspruchende
Rührung, Impfung, Alterung usw. sind nicht nötig. Bei den optimalen Wasserstoffionenkonzentrationen,
p$ 7 bis 9, wird das Chlortetracyclin aus der Lösung nahezu quantitativ in Form
eines unlöslichen Komplexsalzes ausgefällt.
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Der Niederschlag wird mit einer Filterhilfe, z. B. Diatomeenerde,
versetzt und von der Lösung abfiltriert. Falls erwünscht, können auch Zentrifugieren
oder andere Arbeitsweisen zum Abtrennen des unlöslichen Niederschlages von seiner
Mutterlauge angewandt werden.
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Der Niederschlag braucht gewöhnlich nicht gewaschen zu werden. Es
hat sich jedoch gezeigt, daß ein Überschuß an Wasser in dem Filterkuchen insofern
einen ausgesprochenen Nachteil mit sich bringt, als gewöhnlich niedrige Ausbeuten
erhalten werden, wenn zuviel Wasser vorhanden ist. Der Filterkuchen kann deshalb
durch Waschen mit etwas wasserfreiem Methanol oder einem anderen Lösungsmittel entwässert
oder auf andere Weise zur Verminderung des Wassergehaltes abgepreßt oder getrocknet
werden.
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Die nächste Stufe des Verfahrens ist eine kritische Stufe, durch welche
sich die vorliegende Erfindung von den bekannten Verfahren deutlich unterscheidet.
Sie umfaßt das Zerkleinern des Filterkuchens und dessen Aufschlämmung mit Methanol
oder anderen Lösungsmitteln der weiter unten erwähnten Art, die eine geringe Menge
Magnesiumchlorid oder Calciumchlorid oder eines anderen 2wertigen Salzes enthalten,
z. B. Bariumchlorid, Strontiumchlorid, Zinkchlorid u. dgl. Aus nicht bekannten Gründen
wird durch die Gegenwart von Magnesiumchlorid oder der obenerwähnten Salze in dem
Lösungsmittel dessen Lösungsvermögen stark erhöht, so daß außerordentlich hohe Anteile
des in dem Filterkuchen enthaltenen Chlortetracyclins extrahiert werden. Die Theorie
dieser Erscheinungen ist noch nicht geklärt, doch handelt es sich wahrscheinlich
unter anderem um die Bildung von Komplexsalzen und/oder Alkoholaten, an der das
Magnesiumchlorid, das organische Lösungsmittel und das in dem Filterkuchen enthaltene
Chlortetracyclinsalz teilnehmen.
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Zur näheren Erläuterung dieser Erscheinungen soll die folgende Beschreibung
dienen. Ein Volumen einer Chlortetracyclin enthaltenden Fermentationsmaische aus
einem Fermentationsgefäß wurde mit einem gleichen Volumen Wasser vermischt; die
Wasserstoffionenkonzentration der Lösung wurde mit Schwefelsäure auf p$ 1,5 eingestellt.
Dann wurde die Lösung abfiltriert und der Filterkuchen mit 11/2 Volumina Wasser
erneut aufgeschlämmt. Der pH-Wert wurde wieder auf 1,5 eingestellt, und der erneut
aufgeschlämmte Kuchen wurde nach Erwärmen auf 70°C auf Zimmertemperatur abgekühlt
und abfiltriert. Durch -Vereinigung der beiden Filtrate wurden etwa 21/21 erhalten.
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Die so erhaltene Lösung wurde dann mit Natriumhydroxyd auf einen pn-Wert
von 8,7 gebracht und mit 15 g Diatomeenerde-Filterhilfe versetzt. Nach dem Abfilirieren
der Lösung wurde der Filterkuchen mit 170 ml Methylalkohol aufgeschlämmt und diese
Aufschlämmung in fünf gleiche Teile geteilt. Den verschiedenen aliquoten Anteilen
wurde Magnesiumchlorid, wie in der folgenden Tabelle wiedergegeben, zugesetzt. Die
Prozentsätze von Magnesiumchlorid sind auf der Gewicht/Volumen-Basis angegeben,
d. h., 12,5 Gewichtsteile Mg C12 # 6 H20 wurden mit Methanol auf 100 Volumteile
gebracht. Die Aufschlämmung wurde eine Weile gerührt und dann abfiltriert und der
Filterkuchen mit der Magnesiumchlorid enthaltenden Methanollösung wie zuvor erneut
aufgeschlämmt. Das in jedem Fall erhaltene Filtrat wurde dann auf seinen Chlortetracyclingehalt,
wie im folgenden angegeben, geprüft.
| Tabelle I |
| Aliquoter Ex- 2. Ex |
| Anteil MgC12 # 6 HZ O 1. traktion |
| traktion Summe |
| A 12,5%Ge-#v./Vol. 81,00/0 12,70/0 93,70/0 |
| B 6,2%Gew./Vol. 78,8% 20,3010 99,10/0 |
| C 3,2 %Gew./Vol. 54,4 % 45,20/0 99,60/0 |
| D 1,5 %Gew./Vol. 36,40/, 59,20/0 95,60/0 |
| E 0 %Gew./Vol. 1,2% 1,2% 2,4% |
Wie ersichtlich, wurden mit einer 12,5%igen Lösung von MgCl2 - 6 H20 in Methanol
81% des gesamten Antibiotikums in dem Filterkuchen in einer einzigen Extraktion
extrahiert. Durch zwei Extraktionen mit einer 3,2%igen Lösung von Mg C12 - 6 H20
wurden insgesamt 99,6 % des in dem Filterkuchen enthaltenen Antibiotikums gewonnen.
Wenn das Methanol von Magnesiumchloiid frei war, wurden nur 2,4 % derAktivität gewonnen.
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Mit Calciumchlorid werden praktisch die gleichen Ergebnisse erhalten,
wie aus der folgenden Tabelle zu entnehmen ist.
| Tabelle II |
| 140 |
| 11 H20 1. Extraktion CaCIMo2 H20 Z. Extraktion |
| CaC12 2 |
| 1,5 65,7 1,0 17,7 |
| 3,0 |
| 67,6 |
| 2,0 |
| 19,2 |
Der mit magnesiumchloridhaltigem Methanol aufgeschlämmte Filterkuchen besteht beispielsweise
aus 500/" Feststoffen, von denen 4 Teile Chlortetracyclin, 12 Teile unlösliche Verunreinigungen
und 10 Teile Diatomeenerde-Filterhüfe sind. Es sei erwähnt, daß die Mengenverhältnisse
der verschiedenen Bestandteile in weiten Grenzen schwanken können. Die Verhältnisse
der einzelnen unlöslichen Bestandteile des Filterkuchens untereinander sind nicht
kritisch. Der Feuchtigkeitsgehalt wird zweckmäßig so niedrig wie möglich gehalten,
doch werden auch bei einem Feuchtigkeitsgehalt bis hinauf zu 75 % des Gewichts des
Kuchens gute Ergebnisse erzielt.
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Beispielsweise wird ein Filterkuchen der eben beschriebenen Zusammensetzung
mit etwa 100 Volumteilen Methanol aufgeschlämmt, die 1 bis 5 Gewichtsteile Magnesiumchloridhexahydrat
enthalten. Je mehr Tetracylinantibiotikum in dem Filterkuchen enthalten ist, desto
mehr Magnesiumchlorid ist erforderlich. Wenn auch die Theorie des Verfahrens nicht
geklärt ist, so ist doch offenbar wenigstens 1 Moläquivalent Magnesiumchlorid je
Moläquivalent Chlortetracyclin oder eines anderen Tetracyclinantibiotikums in dem
jeweils behandelten Filterkuchen erforderlich.
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Zur Gewinnung des Chlortetracyclins aus dem methanolischen Extrakt
wird dieser Extrakt vorzugsweise durch Vakuumdestillation eingeengt, bis das Chlortetracyclin
auszufallen beginnt. Ein wichtiger Teil dieser Arbeitsweise besteht in der Gewinnung
der Kristalle des Chlortetracyclins als Säuresalz, z. B. als Hydrochlorid. Aus ungeklärten
Gründen wird ein schwierig zu handhabendes schmieriges Material abgelagert, wenn
die Konzentration des Chlortetracyclins in der methanolischen Lösung beim Eindampfen
einen bestimmten Grad erreicht; dieses schmierige Material kann das Magnesiumsalz
oder ein
Komplex desselben mit Chlortetracyclin oder neutrales Chlortetracyclin
sein. Es ist sehr schwierig aufzuarbeiten, und es ist deshalb zweckmäßig, den pH-Wert
der methanolischen Lösung während des Eindampfens auf 3 oder darunter einzustellen,
so daß bei Beginn der Kristallabscheidung aus der Lösung diese in Form eines Säuresalzes
erfolgt.
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Methanol ist das bevorzugte Lösungsmittel für das erfindungsgemäße
Verfahren, doch können auch andere niedermolekulare aliphatische Alkohole, z. B.
Äthylalkohol, n-Propylalkohol, n-Butylalkohol, sowie Aceton, Tetrahydrofuran, 2-Äthoxy-äthanol
und andere Cellosolven und andere polare Lösungsmittel verwendet werden.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
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Beispiel 1 Ein 3 1 ausmachender Anteil des vereinigten blanken sauren
Filtrats (Gärflüssigkeit angesäuert und filtriert) mit einem Wirkstoffgehalt von
2720 y/ml wurde mit 9,5 n-Natriumhydroxyd auf p$ 8,7 eingestellt und 15 Minuten
gerührt. Der sich bildende Niederschlag wurde über Nacht bei 5° absitzen gelassen,
und die überstehende Lösung wurde abdekantiert. Der abgesetzte Niederschlag wurde
nach Vermischen mit 15 g Diatomeenerde abfiltriert. Die feste Substanz wurde 30
Minuten mit 175 ml einer methanolischen Lösung von Magnesiumchlorid (0,025 mg/ml)
aufgeschlämmt und abfiltriert. Zur Durchführung einer zweiten Extraktion der festen
Substanz wurden 100 ml der methanolischen Lösung und anschließend 50 ml Methanol
zum Waschen des Kuchens verwendet. Nach Vereinigung der Extrakte wurden sie durch
Vakuumdestillation auf 60 ml eingeengt. Während des Einengens wurden zur Verhinderung
des Ausfallens von neutralem Chlortetracyclin 30 ml Methanol zugesetzt, die 4 ml
konzentrierte Salzsäure enthielten. Die konzentrierte Lösung wurde mit konz. Salzsäure
auf pu 1,9 eingestellt, und die gebildeten Kristalle wurden 24 Stunden gealtert.
Die Kristalle wurden mit 2-Äthoxyäthanol, Wasser und Isopropanol gewaschen.
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Gehaltsprüfung der Kristalle: Chlortetracyclin 986 y/mg (durch Fluoreszenzbestimmung)
Ausbeute in °/o: 78,7 (bezogen auf die Gehaltsprüfung durch Fluoreszenzbestimmung)
Wie aus der vorstehenden Analyse zu entnehmen ist, ist das erhaltene Produkt pharmazeutisch
annehmbar und kann ohne Reinigung für die meisten Chlortetracyclinpräparate verwendet
werden.
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Beispiel 2 8,0 g eines noch lösungsmittelhaltigen, rohen Chlortetracyclins
mit einem Wirkstoffgehalt von 535 y/mg Chlortetracyclin wurden mit 40 ml 2-Äthoxyäthanol
mit einem Gehalt von 2 Mol Mg C12 - 6 H20 bis zur Lösung aufgeschlämmt. Nach
Abfiltrieren der Lösung wurde der pH-Wert des Filtrats mit Salzsäure auf 0,80 eingestellt.
Die gebildeten Kristalle wurden 24 Stunden gealtert, abfiltriert und mit 2-Äthoxyäthanol,
Wasser und Isopropanol gewaschen. Die 3,83 g ausmachenden getrockneten Kristalle
ergaben bei der Prüfung einen Gehalt von 969 y/mg Chlortetracyclinhydrochlorid;
die Ausbeute, bezogen auf die rohen Kristalle, betrug 86,7 °/o.