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Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Tetracyclin Tetracyclin,
ein Antibiotikum mit einer ausgedehnten Wirkungsbreite, wurde ursprünglich auf chemischem
Wege durch katalytische Entchlorung des Chlortetracyclins hergestellt.
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Dieses Verfahren ist jedoch teuer und schwierig.. Das Chlortetracyclin
muß erst durch Gärung hergestellt, dann regeneriert und gereinigt werden, bevor
die Entchlorung stattfinden kann. Aus diesem Grunde wurde nach einem Verfahren gesucht,
nach dem Tetracyclin direkt durch Gärung erhalten werden kann.
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Es ist bekannt, daß der chlortetracyclinbildende Mikroorganismus,
Streptomyces aureofaciens, der eine geringe Menge von Tetracyclin zusammen mit dem
Chlortetracyclin erzeugt, auch dazu verwendet werden kann, um hauptsächlich Tetracyclin
herzustellen, und zwar dann, wenn der Chlorgehalt des Nährbodens verringert wird,
die Chlorionen durch Bromionen ersetzt werden oder wenn ein Chlorierungsinhibitor
zugesetzt wird.
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Diese bekannten Verfahren sind aber oft schwierig und ergeben nur
eine geringe Ausbeute, unter anderem weil das Entfernen oder Ersetzen der Chlorionen
den Nährwert des verwendeten Mediums herabsetzt, während die Inhibitoren auf den
Mikroorganismus toxisch wirken.
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Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Streptomyces ATCC
13 938 zur Herstellung von Tetracyclin auf üblichem biologischem Wege, auch in chlorreichen
Nährmedien, unter submersen Bedingungen, Gewinnnung des Antibiotikums vorzugsweise
durch Fällen mit einem Gemisch von Barium-und Mangansalzen und gegebenenfalls dessen
Beindarstellung.
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Durch die Verwendung des bisher unbekannten Streptomyzets, von dem
eine Kultur Nummer ATCC 13 938 in eine »American Type Culture Collection«, Washington,
D. C., USA.-Kultur gesetzt wurde und dort eingehend beschrieben ist, wird auch in
chlorreichen Medien eine Ausbeute an Antibiotika der Tetracyclingruppe von etwa
90 bis 95% Tetracyclin erhalten mit nur wenigen Prozent Chlortetracyclin, wobei
dieses Verhältnis durch Zusatz von Brom nicht beeinflußt wird.
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Vergleich mit bekannten Streptomyzetarten Eine Versuchskultur wurde
angelegt, um verschiedene bekannte tetracyclinbildende Mikroorganismen miteinander
zu vergleichen, und zwar Streptomyces aureofaciens ATCC 10 762 (1), einige namenlose
Streptomyzetarten, wie ATCC 11652 (2), ATCC 11653 (3) und ATCC 11654 (4), Streptomyces
viridifaciensATCC 11989 (5), Streptomyces aureofaciens ATCC 12 416 a (6) und ATCC
12 416 c (7), Streptomyces feofaciens S 4623/33 (8) und das vorliegende Streptomyzet
ATCC 13 938. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgezeichnet:
| Nährboden I Organismus Wachstum Luftmycel I Farbe im Agar Rückseite |
| Glukose- 1 gut reichlich, weiß in leicht gelblich, hellbraun |
| Asparagin- dunkelgrau löslich |
| Fleisch wechselnd |
| 2 mäßig weiß, in maus- gelbgrün orange |
| grauschwarz |
| wechselnd |
| (Fortsetzung) _ _ |
| Nährboden I Organismus Wachstum Luftmycel Farbe im Agar Rückseite |
| Glukose- 3 gut strohfarben gelbgrün braun |
| Asparagin- 4 mäßig bis gut braungrau _ braungrau dunkel- |
| Fleisch |
| olivbraun |
| 5 gut mausgrau gelbgrün braun |
| 6 gut weiß, in grau gelb - |
| wechselnd |
| 8 mäßig bis keines schwach- - |
| schlecht grünbraun |
| 9 mäßig bis gut weiß bis gelblich keine leicht hellbraun |
| Stärke-Agarmit 1 gut bis reichlich weiß, wechselnd keine rotbraun |
| anorganischen mit rotbraun |
| Salzen 2 schlecht leicht grüngelb gelborange - |
| 3 gut gelbweiß, wech- gelbgrün - |
| selnd in maus- |
| grau |
| 4 schlecht keines keine - |
| 9 gut weiß, in braun keine braunschwarz |
| wechselnd |
| Calciummalat 1 gut, Ca-Malat spärlich, weiß keine Lederfarben |
| ist gelöst |
| 2 schlecht, keines keine - |
| Ca-Malat |
| ist gelöst |
| 3 schlecht, spärlich, weiß keine - |
| Ca-Malat ist |
| nicht gelöst |
| 4 sehr schlecht, keines keine - |
| Ca-Malat ist |
| nicht gelöst |
| 6 gut, reichlich, weiß, in bräunlich - |
| Ca-Malat grau wechselnd |
| ist gelöst |
| 9 mäßig, keines keine - |
| Ca-Malat ist |
| nicht gelöst |
| Emerson's Agar 1 gut blaßgrau keine orange |
| 2 gut unzureichend orangebraun grünlich- |
| hellbraun |
| 3 mäßig blaßgrau, in Lederfarben orangebraun |
| braun gehend bis graubraun |
| 4 gut keines blaugrau olivbraun |
| 6 gut keines spärlich, braun bräunlich |
| 7 gut bis reichlich schwachgelb in - schwarz in |
| grau wechselnd alter Kultur |
| 9 gut keines keine leicht |
| hellbraun |
| Agar-Nährboden 1 gut spärlich, Maßgrau strohfarben - |
| 2 mäßig keines gelblich - |
| 5 gut keines rotbraun - |
| 6 gut keines spärlich, braun braun |
| 8 mäßig Lederfarben spärlich, gelb - |
| 9 schlecht keines keine - |
Weiter wurde die Wirkung der Organismen auf Magermilch und Gelatine
geprüft. Die Ergebnisse sind der folgenden Tabelle zu entnehmen:
| Organismus 1 1 2 I 3 4 6 7 I 9 |
| Magermilch Koagulation - - - -I- - + |
| Peptisieren - - - -(-f-) - |
| Gelatine . Auflösung - -f- + -I- - - |
Die Vergleiche zeigen, daß das Streptomyzet entscheidend von den bekannten tetracyclinbildenden
Streptomyzetarten abweicht. Gewerbliche Stufenzüchtung Die Züchtung von Streptomyzet
ATCC 13 938 erfolgt im wesentlichen gemäß der bekannten Methode zur Herstellung
von Antibiotika, d. h., die Kultur wird unter aeroben submersen Gärungsbedingungen
in einem sterilen Nährboden durchgeführt, der Nährstoffe von assimilierbarem Kohlenstoff
und Stickstoff zusammen mit wachstumsanregenden Stoffen enthält, und erfolgt bei
einer geeigneten Temperatur und einem geeigneten pH, bis sich im Medium ein Maximum
an Tetracyclin gebildet hat.
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Um gute Ausbeuten zu erhalten, wird die Züchtung gemäß der Erfindung
bei einer Temperatur zwischen 20 und 40° C innerhalb von 20 bis 200 Stunden durchgeführt,
wobei der pH-Wert zwischen 6 und 8 gehalten wird. Da während der Züchtung sich Säure
bildet, wird ein Puffer, z. B. pulverisierte Kreide, zugesetzt, um den pH-Wert zu
halten.
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Zusätzlich zu den obengenannten Kohlenstoffnährstoffen oder, falls
gewünscht, zusammen mit einem oder mehreren von diesen können als Kohlenstoffspender
verschiedene pflanzliche Fette, z. B. Sojabohnenöl, Erdnußöl, Palmöl, Olivenöl und
Kottonöl, sowie tierische Fette, z. B. Talg, verwendet werden. Außerdem eignen sich
hierfür auch freie Fettsäuren, wie Linolensäure, Oleinsäure, Stearinsäure und Palmitinsäure.
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Die Stickstoffspender können hydrolysierte oder nicht hydrolysierte
pflanzliche oder tierische Proteine sein, wie Sojabohnenmehl, Erdnußmehl oder andere
Mehle aus Samen mit reichlichem Proteingehalt, Glutin und Kasein. Anorganische Stickstoffnährstoffe
wie Ammoniumverbindungen und Nitrate können auch verwendet werden.
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Es wurde gefunden, daß ein Nährboden, der 0,5 bis 20% Getreideeinweichffüssigkeit,
0,2 bis 10% Erdnußöl und die nötigen Mineralsalze enthält, ein besonders gutes Wachstum
der Mikroorganismen gibt.
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Das Tetracyclin ist eine amphotere Substanz mit einem isoelektrischen
Punkt bei einem pH von 5,5. Es ist bei einem niederen pH hauptsächlich positiv und
bei einem höheren pH negativ geladen. Genauso wie die anderen amphoteren Substanzen
ist die geringere Löslichkeit bei dem isoelektrischen Punkt.
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Es ist bekannt, daß Tetracyclin Komplexverbindungen mit Metallen der
II. Gruppe des Periodischen Systems und mit Kombinationen zweier Metalle dieser
Gruppe bildet, insbesondere mit Barium und Magnesium, deren Komplexverbindungen
gefällt werden können und daher zur Reinigung verwendet werden können: Allerdings
ist eine Reinigung des Tetracyclins auf diese Weise nicht besonders zufriedenstellend,
denn wenn man von einem Titer von 1 mg pro Milliliter im Ausgangsmaterial ausgeht,
findet man 0,3 bis 0,5 mg pro Milliliter von der Fällung wieder im Filtrat. Diese
Substanzmenge ist entweder verloren, oder es werden weitere Schritte zur Wiedergewinnung
benötigt.
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Es zeigte sich nun, daß Tetracyclin Komplexverbindungen mit Barium-
und Mangansalzen bildet, die im pH-Bereich von 6,5 bis 10,5 wenig löslich sind.
Daher wird gemäß der Erfindung Tetracyclin aus einer wäßrigen Lösung gewonnen und
durch Fällung mit einem Barium- und Mangansalz gereinigt.
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Unter sonst gleichen Bedingungen ist diese Fällung weit wirksamer
als die früher durchgeführte Fällung mit einer Kombination von Barium- und Magnesiumsalzen,
da bei den vorliegenden Verfahren durch Fällung des Tetracyclins z. B. bei einem
pH von 7 der Titer der Lösung bis auf 0,1 mg Tetracyclin pro Milliliter oder weniger
gebracht werden kann, im Gegensatz zu 0,3 bis 0,5 mg pro Milliliter bei Fällung
mit Barium- und Magnesiumsalzen.
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Die Verwendung von Mangan in der Fällung hat weiter den Vorteil, daß
Mangan das Tetracyclin nicht inaktiviert, daß es nicht toxisch ist und daß es beim
isoelektrischen Punkt des Tetracyclins nicht in wesentlichen Mengen ausfällt.
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Weiter fällt die Kombination von Barium- und Mangansalzen das Tetracyclin
unabhängig von der Zusammensetzung des zur Züchtung verwendeten Nährbodens aus.
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Auf Grund der geringen Löslichkeit des Komplexes kann eine Fällung
des Tetracyclins auch aus Lösungen erfolgen, die nur eine geringe Menge des Präparates
enthalten, z. B. aus dem wäßrigen Gärungsmedium gemäß der Erfindung, aus dem das
Myzel entfernt worden ist. Daher ist es nicht erforderlich, erst eine Konzentration
durchzuführen. Das Myzel kann durch Filtrieren oder durch Einstellen des pH-Wertes
der Kultur auf etwa 2 und anschließendes Zentrifugieren entfernt werden.
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Um die Fällung so vollständig wie möglich zu machen, werden die Salze
im Überschuß zugegeben. Aber dank der schlechten Löslichkeit des sich bildenden
Komplexes sind nur verhältnismäßig geringe Zusätze von Salzen nötig, was wirtschaftlich
sehr vorteilhaft ist. So kann schon eine Fällung durch Zusatz von einer Salzmenge,
die der Menge Tetracyclin entspricht, erzielt werden, d. h. etwa 0,5 g BaC12, 2
H20 und 0,5 g MriC12, 4 H20 auf 1 g Tetracyclin in der Lösung. Die besten Ergebnisse
beim erfindungsgemäßen Verfahren wurden durch Zusatz von 2,5 g BaCI." H,0 und 2,5
g MnC12, 4H20 auf 1 g Tetracyclin in der Lösung erzielt.
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Nach Beendigung des Salzzusatzes ist der pH-Wert der Lösung auf 7
gestiegen, wobei der Komplex ausfällt. Die Fällung wird durch Zentrifugieren oder
Filtrieren isoliert, in Wasser suspendiert -und mit Schwefelsäure bis zu einem pH-Wert
von 1,2 bis 2,0
angesäuert. Dabei wird der Komplex gespalten, und
das Tetracyclin löst sich zusammen mit dem Mangan in Form von Mangansulfat, während
Bariumsulfat ausfällt. Um das Flüssigkeitsvolumen zu verringern, wird das Auflösen
vorteilhafterweise in zwei Stufen durchgeführt. Nach der ersten Suspension und Ansäuerung
der Lösung erfolgt das Zentrifugieren. Die zurückbleibende Fällung wird wieder in
Wasser suspendiert, angesäuert und zentrifugiert.
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Es ist zweckmäßig, bei der Ansäuerung Natriumsulfat zuzugeben, denn
es wurde gefunden, daß dadurch ein reineres Tetracyclin entsteht, dadurch gleichzeitig
eine vollständigere Fällung des Bariumsulfats gesichert wird.
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Die beiden Flüssigkeitsmengen, die nach dem Zentrifugieren anfallen,
werden zusammengegossen und der pH-Wert auf den isoelektrischen Punkt des in Frage
stehenden Tetracyclins eingestellt. Dabei fällt das letztere aus, und das Mangansulfat
bleibt in Lösung.
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Eine andere Methode zur Gewinnung und/oder Reinigung des Tetracyclins
vom Nährboden beruht auf Verwendung von Ionenaustauschern.
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Es wurde früher vorgeschlagen, eine Lösung von Tetracyclin durch schwache
oder starke saure Ionenaustauscher zu reinigen. Die Adsorption an schwachen sauren
Ionenaustauschern ist aber nicht besonders wirksam, und wenn stark saure Ionenaustauscher
verwendet werden, ist es später schwer, das adsorbierte Tetracyclin zu entfernen.
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Das vorliegende Verfahren vermeidet diese Nachteile dadurch, daß das
Tetracyclin an einem starken basischen Ionenaustauscher adsorbiert, durch eine saure
Flüssigkeit herausgelöst und anschließend dieser Auszug neutralisiert wird. Durch
Verdampfen wird das Tetracyclin gewonnen.
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Diese Methode hat eine Reihe von Vorteilen, insbesondere dadurch,
daß ein starker basischer Ionenaustauscher eine große Adsorptionskapazität hinsichtlich
der Tetracycline hat und eine wirksame Reinigung ermöglicht, da während der Adsorption,
wenn der Ionenaustauscher positiv geladen ist, einige positiv geladene Ionen ungehindert
hindurchgehen und einige durch Waschen entfernt werden können, wobei auch einige
anorganische und organische Verunreinigungen entfernt werden. Schließlich ist es
sehr leicht, das adsorbierte Tetracyclin zu befreien, und die Ausbeute ist nahezu
quantitativ. Eine Reihe von handelsüblichen Ionenaustauschern kann bei diesem Verfahren
Verwendung finden, so z. B. die unter dem Namen Amberlite IRA 400 und Dowex 1 erhältlichen.
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Als Ausgangsprodukt wird ein Gärungsmedium verwendet, von dem das
Myzel des tetracyclinbildenden Mikroorganismus entfernt wurde. Aber die besten Ergebnisse
wurden erzielt, wenn von einer konzentrierten Lösung, z. B. von einer Lösung, die
beim isoelektrischen Punkt ausgefällt und wieder gelöst wurde, ausgegangen wird.
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Die Lösung geht durch eine Ionenaustauscherkolonne, die einen starken
basischen Ionenaustauscher in Form eines Hydroxyls enthält, wobei das Tetracyclin
vom Ionenaustauscher adsorbiert wird. Bevor die Lösung durch die Kolonne geht, ist
ihr pH-Wert. nicht kritisch, da er durch die Hydroxylionen aus der Kolonne auf jeden
Fall etwas erhöht ist, so daß das Tetracyclin vorwiegend negativ aufgeladen wird.
Wichtig ist aber, daß jener pH-Wert nicht wesentlich über 3 ist, da dann die Gefahr
einer Fällung besteht, noch bevor die Lösung durch die Kolonne gegangen ist.
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Nach der Adsorption wird die Kolonne mit Wasser und dann, falls nötig,
mit Alkohol gewaschen, um das zurückbleibende Wasser zu entfernen. Das Waschen mit
Alkohol ist nicht unbedingt nötig, da das nachfolgende Herauslösen mit Hilfe einer
wäßrigen Säure erfolgen kann. Die Ausbeute und die Reinigung jedoch sind in diesem
Fall nicht so gut wie beim Nachwaschen, mit einem niederen, mit Wasser mischbaren
Alkohol. Das anschließende Extrahieren wird mit einem angesäuerten Alkohol durchgeführt,
vorzugsweise mit einem mit Salzsäure angesäuerten Methylalkohol. Durch die Ansäuerung
wird der pH-Wert der Kolonne vermindert, wobei das Tetracyclin, das vorwiegend positiv
aufgeladen wird, durch den Ionenaustauscher zurückgestoßen und gelöst wird. Diese
Lösung wird neutralisiert, um das Tetracyclin zu gewinnen. Dieses kann auf verschiedene
Weise erfolgen. So kann z. B. eine Lauge wie Natriumhydroxyd oder Ammoniak zugegeben
oder der Auszug kann mit einem schwach sauren Ionenaustauscher auf Na+-Basis behandelt
werden. Dabei werden allerdings anorganische Salze und Wasser gebildet, die normalerweise
unerwünscht sind, da später diese Verunreinigungen schwer zu entfernen sind. Insbesondere
ist ein Gehalt an Wasser ungünstig, da bei der nachfolgenden Verdampfung des sauren
Methanolauszuges reines Methanol verdampft, so daß der Wassergehalt des Rückstandes
ständig ansteigt, wobei anorganische Verunreinigungen gelöst bleiben, anstatt daß
sie während der Verdampfung allmählich ausfallen.
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Darum wird im vorliegenden Verfahren die Neutralisation zweckmäßig
durch Behandlung mit einem schwach basischen Ionenaustauscher durchgeführt. Dieser
neutralisiert ohne Freisetzung von Salz, und während eine Wasserabsorption durchgeführt
wird, besonders wenn vorher mit Alkohol gewaschen wurde, hält der Ionenaustauscher
eine Anzahl negativer Ionen zurück und bewirkt so eine weitere Reinigung. Tatsächlich
wird auch eine geringe Menge Tetracyclin zurückgehalten, aber dieses wird wieder
freigesetzt und in den Prozeß zurückgebracht, wenn der Ionenaustauscher regeneriert
wird.
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Durch den leicht basischen Ionenaustauscher, Amberlite IR 45, wird
der pH-Wert des Extraktes auf etwa 4 erhöht. Die Behandlung ist sehr leicht durchzuführen,
indem der regenerierte und mit Alkohol gewaschene Ionenaustauscher im Extrakt bis
zur Neutralisation gerührt wird und der Ionenaustauscher anschließend durch Absaugen
entfernt und mit etwas Alkohol gewaschen wird. Da beide, der Ionenaustauscher und
das Tetracyclin, während der Neutralisation positiv geladen sind, ist der Verlust
an Tetracyclin klein.
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Die so neutralisierte Lösung wird dann verdampft, wobei ein weiteres
Ausfällen und Entfernen der Verunreinigungen möglich ist. Durch eine geeignete letzte
Konzentration, z. B. 50 mg Tetracyclin auf 1 ml Lösung, wird das Tetracyclin entweder
durch Zusatz einer starken Mineralsäure zusammen mit einem mit Wasser nicht mischbaren
Lösungsmittel in Form des Hydrochlorids oder durch Abkühlung in Form des Hydrats
gefällt. Nach erneuter Verdampfung kann ein weiterer Teil Tetracyclin aus der MutterIauge
gewonnen werden.
Wenn nötig, kann das so gewonnene 'I'etracyclin
noch besonders durch- Umkristallisieren oder durch Chromatogräphie gereinigt'werden:
Die folgenden Beispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutern.
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Beispiel 1 Eine gefrorene Kultur von Streptomyzet ATCC 13938
wurde rasch aufgetaut und in einen 300m1 fassenden Erlenmeyerkolben gegeben, der
40 ml eines Impfmediums (Nährboden) der folgenden Zusammensetzung enthielt: Kartoffelstärke
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 g Getreideeinweichflüssigkeit (trocken)
17 g Calciumkarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,59
Erdnußöl .........................
2 ml mit Wasser bis zi4 einem Gesamtvolumen von 11 aufgefüllt.
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Bevor dieses Reaktionsgemisch in den Autoklav gegeben wurde, wurde
der pH-Wert auf 6,7 eingestellt.
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Die Kultur wurde in einem rotierenden Mischbecher (25-mm-Takt, 250
Umdr./Min.) bei 28° C 18 bis 24 Stunden lang geschüttelt.
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In einer 10%igen Impfmenge wurde die Kultur dann in andere Erlenmeyerkolben
derselben Größe gegeben, die 40 ml der folgenden Gärungsmasse enthielten: Kartoffelstärke
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 g Getreideeinweichflüssigkeit (trocken)
7,5 g 25 0/a Ammoniak . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6,4 g 65% Salpetersäure
................ 6,4 g mit Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 11 aufgefüllt.
Bevor das Reaktionsgemisch in den Autoklav gegeben wurde, wurde mit Salpetersäure
der pH-Wert auf 6,3 eingestellt und jedem Kolben 0,25 ml Erdnußöl zugesetzt.
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Nachdem 60 Stunden lang geschüttelt wurde, wurden die Kolben entleert.
Durch eine Absorptionsmethode wurde festgestellt, daß die Ausbeute 0,910 mg Tetracyclin
und 0,070 mg Chlortetracyclin pro Milliliter betrug.
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Beispiel 2 Ein Impfstoff wurde gemäß Beispiel l hergestellt und in
einer Impfmenge von 2% in zwei Fünfliterkolben gebracht. Jeder dieser Kolben enthielt
1 1 des Impfmediums des Beispiels 1.
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Nachdem 30 Stunden lang bei 28° C im Schüttler (50-mm-Takt, 150 Umdr./Min.)
geschüttelt wurde, wurde der Inhalt der beiden Kolben in 501 des Gärers gebracht,
der 301 des Gärungsmittels aus Beispiel 1 enthielt.
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Während der Gärung wurde ein Luftstrom von 0,51 auf 1 1 Medium in
der Minute aufrechterhalten. Innerhalb der ersten 18 Stunden wurde mit Hilfe eines
Vierblattrührers gerührt, und zwar mit einem Kraftverbrauch von etwa 1,2 Watt pro
Liter. Darauf wurde das Rühren verstärkt, so daß es einem Kraftverbrauch von 1,6
Watt pro Liter entsprach. Das Schäumen wurde durch Zerstäuben einer 7%igen Silikonemulsion
in dem Gärer automatisch geprüft, jedesmal, wenn Schaum mit einer im Innern des
Gärers angebrachten Elektrode in Kontakt kam. Während der ersten 24 Stunden der
Gärung wurden 2-bis 3 ml Erdnußöl pro Stunde zugegeben. Nach 50 bis 56 Stunden wurde
das Gärungsmedium ausgewertet. Durch eine Absorptionsmethode wurden 0,875 mg Tetracyclin
pro Milliliter festgestellt, während eine mikrobiologische Methode 1;620 mg zeigte.
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Es wurde weiter, teils durch natürliche Mutation, teils durch Mutation
nach der bekannten UV-Strahlungstechnik, eine Reihe von Mutanten des Streptomyzet
ATCC 13 938 isoliert und, wie oben beschrieben, abgeprüft. Die Ergebnisse gehen
aus der folgenden Zusammenstellung hervor:
| Mutantenbezeichnung Produktion von Tetracyclin |
| in mg/1 |
| F 99-5 1270 |
| F 99-5-11-1 B 1430 |
| F 99-5-11-1 B: |
| Serie Nr. 1 1700 |
| Serie Nr. 537 2030 |
| Serie Nr. 597 2400 |
| Serie Nr. 797 2770 |
| Serie Nr. 1043 3130 |
| Serie Nr. 1057 3400 |
Beispiel 3 Dieser Versuch beschreibt die Gewinnung des Tetracyclins durch Fällung
mit Barium- und Mangansalzen.
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51 eines Nährbodens, der mit einem tetracyclinbildenden Mikroorganismus
versetzt war, wurden mit Salzsäure auf ein pH von 2,0 eingestellt und zentrifugiert.
Zu der abgetrennten Flüssigkeit, die 1 mg Tetracyclin pro Milliliter enthielt, wurden
12,5 g BaCl2, 2 H20 und 12,5 g MnCl2, 4 H20 zugegeben. Mit Hilfe von 4 n-BaOH wurde
der pH-Wert auf 7 eingestellt und 15 Minuten lang gerührt. Nachdem dieses Reaktionsgemisch
30 Minuten lang gestanden hatte, wurden die Flüssigkeit und die Fällung durch Zentrifugieren
abgetrennt. Der zurückbleibende Titer der Lösung ist 0,116 mg pro Milliliter.
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Die Fällung wurde in Wasser suspendiert und die Suspension mit H,S04
auf ein pH von 1,5 eingestellt. Nachdem 15 Minuten lang gerührt wurde, erfolgte
das Zentrifugieren. Dabei wurden 340 ml Flüssigkeit gesammelt, die einen Tetracyclintiter
von 9,430 mg pro Milliliter zeigten. Die Fällung wurde daraufhin wieder suspendiert,
gerührt und zentrifugiert, wobei 122 ml Flüssigkeit mit einem Titer von 0,932 mg
pro Milliliter erhalten wurden.
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Die beiden Flüssigkeitsmengen wurden vereinigt und mit NaOH auf ein
pH von 5,5 gebracht. Nach 2stündigem Stehen in der Kälte wurde zentrifugiert. Der
zurückbleibende Titer war 0,492 mg pro Milliliter, und die gefällte Substanz enthielt
0,285 mg Tetracyclin pro Milliliter nach dem Trocknen. Beispiel 4 Dieser Versuch
zeigt die Gewinnung von Tetracyclin durch Adsorption an einem stark basischen Ionenaustauscher.
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Eine saure wäßrige Lösung eines Produktes, das etwa 30 Gewichtsprozent
Tetracyclin enthielt, das durch Fällung beim isoelektrischen Punkt des Tetracyclins
gewonnen wurde, wurde zentrifugiert. Die gewonnene Flüssigkeitsmenge betrug bis
350 ml, und es wurde durch spektrophotometrische Analyse ein Gehalt
von
6,530 mg Tetracyclin pro. Milliliter gefunden entsprechend einer Gesamtmenge von
2285;5 mg Tetracyclin.
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Nach Zusatz von 350 ml Wasser wurde die Lösung durch eine 20 - 300-mm-Ionenaustauscherkolomie
geführt. In dieser Kolonne befanden sich ungefähr 100g Amberlite IRA 400, regeneriert
zum Hydroxyl. Die Durchlaufgeschwindigkeit wurde auf 1 ml pro Minute eingestellt.
Dabei wurde die Gesamtmenge Tetracyclin in der Kolonne zurückbehalten. Darauf wurde
erst mit 250 ml Wasser und dann mit 500 ml Methanol gewaschen.
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Die Kolonne wurde darauf mit 350 ml Methanol extrahiert und mit Salzsäure
im Verhältnis 5 ml 5n-Salzsäure zu 95 ml Methanol angesäuert. Eine spektrophotometrische
Analyse zeigte, daß der Extrakt 6,460 mg Tetracycliil pro Milliliter enthielt, was
einer Gesamtmenge von 2261 mg Tetracyclin oder 99 % der ursprünglichen Menge entspricht.
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Der Säureauszug wurde daraufhin durch Zugabe von 28 g Amberlite IR
45 neutralisiert, das vorher mit Methanol gewaschen wurde. Etwa 15 Minuten lang
wurde gerührt, wonoch der pH-Wert etwa 3 war. Der Ionenaustauscher wurde dann filtriert
und sorgfältig mit Methanol gewaschen. Diese Waschflüssigkeit wurde mit dem Filtrat
vereinigt. Die Lösung, welche nun- 2150 mg Tetracyclin enthielt wurde auf etwa 50
ml eingedampft, wobei sich eine Fällung bildete, die praktisch- kein Tetracyclin
enthielt. Das Filtrat wurde entweder durch weiteres Verdampfen aufgearbeitet, wobei
das Tetracyclin in Form eines Hydrats gewonnen wurde, oder durch Herabsetzung des
pH auf etwa 1 durch Zugabe einer starken Mineralsäure, wobei das Tetracyclin als
Hydrochlorid ausfiel. In beiden Fällen wurde die Fällung durch Zusatz eines mit
Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels, wie Diäthyläther, erleichtert.