DE1670486A1 - Verfahren zur Isolierung von Cephalosporin C - Google Patents

Description

· ? Druqk der Ofrenlegungssearift bee Iuieldunesmaterlagen.
Aktenzeichen ι J 16 70 486.2 _ΛΑ«_Α»_ΛΛ

U.Zeicaen ι 21.23t-B$/H 1870486

CIBA AKTIENGESELLSCHAFT, BASEL (SCHWEIZ)

Case 6067 . '

Deutschland

Verfahren zur Isolierung von Cephalosporin C· Gegenstand der Erfindung ist ein neues Verfahren

zur Isolierung von Cephalosporin C in Form eines Derivate*

aus verdünnten, Cephalosporin C-haltigen Lösungen, insbe-

sondere ius Lösungen, die Cephalosporin C .m Gemisch mit

1 .

anderen gelösten Stoffen enthalten, vor allem aus einer Cephalosporin C-haltigen Kulturflüssigkeit.

Neu· Unttrteoen

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BAD

Die Isolierung von Cephalosporin C aus verdünnten, mit weiteren wasserlöslichen Stoffen "verunreinigten" wässrigen Lösungen« insbesondere aus Kulturflüssigkeiten, ist kompliziert und bietet vor alle« bei der Durchführung is technischen Mass tab Schwierigkeiten, weil das Cephalosporin C einerseits sehr empfindlich ist, andererseits von anderen Stoffen, die zum Teil ähnliche physikalische und chemisch· Eigenschaften aufweisen, abgetrennt werden muss.

Als Verfahren zur Isolierung von Cephalosporin C aus Fermentationslöeungen wurde z.B. vorgeschlagen, das Cephalosporin C an Aktivkohle zu adsorbieren, zu eluieren, das eluierte Material an Aluainiunoxyd zu adsorbieren, 'erneut zu eluieren, an einen Anionenaustauscherharz zu ad- sortieren, mit einer wässrigen Pufferlösung vom pH 2,5 bis 8,0, z.B. Pyridinacetat, das rohe Cephalosporin C zu elialeren und dieses dann eine» Extraktionsprozess mit Lösungs- . Mitteln su unterwerfen, vgl. die deutsche Patentschrift 1 014 711. Nach eine» weiteren Verfahren «eil Cephalosporin C durch LiJsunfcsmittelfraktionierung, insbesondere zwischen Wasser und. Phenpl oder alkyl-substituierten Phenolen erhalten werden. Ais weitere Möglichkeit wurde vorgesehen, Sluate aus der Aktivkohlesäule oder der Aluainiumoxydsäul· oder -der Säule aus Ionenaustauschern»^ solchen Bedingungen in bezug auf Temperatur und Acidität auszusetzen, dass das im Kulturflltrat enthaltene Cephalosporin N in PenicillinsÄure umgewandelt wird, das Cephalosporin C jedoch praktisch

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unbeeinflusst bleibt, oder das Cephalosporin H unter der Einwirkung von Penicillinase zu zerstören und das Cephalosporin C dann durch fraktionierte Extraktion mit Lösungsmitteln oder durch Chromatographie mit einem Ionenaustauschharz abzutrennen. Man hat auch versucht, Cephalosporin C

aus dem säurebehandelten Medium direkt mit einem Ionenaustauscher zu adsorbieren, Diese direkte Adsorption hatte jedoch die Nachteile, dass infolge der Anwesenheit anderer Anionen ausser Cephalosporin G sehr grosse Mengen des Anionaustauschharzes erforderlich waren und darüber hinaus die Chloridionen-- miteluiert wurden und in den weiteren Stufen des Verfahrens Schwierigkeiten verursachten· Sehliesslich wurde ein Verfahren beschrieben, bei dem das geklärte Fermentationsmedium mit einem stark saure Gruppen in der H-Form enthaltenden Kationenaustauscher auf ein pH von 2,8 bis 4,0 eingestellt Wird, dann der Kationenaustauscher von dem angesäuerten Medium abgetrennt und dieses durch einen starken ^ionenaustauscher in der Form eines Salzes nit einer schwachen, flüchtigen, monobasischen organischen Säur§ von praktisch den gesamten Chloridionen und anderen anorganische Anionen befreit wird und sehliesslich das Cephalosporin C aus dem Perkolat z.B. durch Adsorption an einem Anionenaustauscher in der Acetatform und Elution mit Pyridinacetatpuffer gewonnen wird,(vgl, die deutsche Patentschrift 1 126 564). Die Verfahren, bei denen Cephalosporin C an Ionenaustauschern absorbiert wird, haben den Nachteil, da&s

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ein grosser Teil des Cephalosporin C dabei zerstört wird.

Es wurde nun ein vorteilhaftes Verfahren gefunden, bei dem Cephalosporin C aus einer verdünnten wässerigen Lösung,, insbesondere einer Fermentationsflüssigkeit, in Form eines Derivates isoliert wird, das für die Weiterverarbeitung zu antibakteriell hochwirksamen Verbindungen, die sich von der 7-Aminocephalosporansäure ableiten, z.B. 7-Phenylacetylamino-cephalosporansäure oder 7-Thienylacetylamino-cephalosporansäure, besonders geeignet 1st. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man in einer Cephalosporin C enthaltenden wässrigen Lösung durch Reaktion mit N-Trlnitröbenzolsulfosäure N-Trinitrophenyl-cephalosporin C bildet und aus.der Lösung abtrennt· -

Das Verfahren kann auch zur Reinigung von rohem Cephalosporin C-verwendet werden, indem man das Rohprodukt in Wasser oder einem anderen Lösungsmittel auflöst und die Lösung wie erwähnt behandelt. Ferner kann man das Verfahren auch zur Reinigung von Derivaten des Cephalosporin C, welche eine freie Aminogruppe In der Seitenkette aufweisen, z.B» von Estern des. Cephalosporin C, anwenden.

Wenn man das -neue Verfahren zur Isolierung des in Fermentationsfiüssigkeiten enthaltenen Cephalosporin C benutzt, kann man die Reaktion entweder in dem KuIturfiltrat oder direkt in der bei der Fermentation erhaltenen Kultur» brühe vornehmen..

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I- . .BAD OBiGlNAL.

Die Reaktion rait TrinitrobeMoasulfosäuBe^wird-zweck mässig bei Zimmertemperatur und bei einem pH von 7 - 3Ό* vorzugsweise 8,5 bis 9* durchgeführt. Man gibt die Trinitrobenzolsulfosäure in fester oder gelöster Form unter Rühren zu der Cephalosporin C-haltigen Lösung und sorgt dafür, dass das pH während der ganzen Reaktionszeit, ca. 1-2 Stunden, in dem erwähnten Bereich liegt. Eine Lösung von Trinitrobenzolsulfosäure wird vorzugsweise erhalten, indem man Pikrylchlorid mit einem Sulfit, beispielsweise Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsulfit, umsetzt. Die Lösung kann ohne weitere Aufarbeitung verwendet werden. Weiter ist es möglich, die Trinitrobenzolsulfosäure unmittelbar in der-Cephalosporin C-haltigen Lösung zu bilden, indem man z.B. Pikrylchlorid und Natriumsulfit zu der Lösung gibt. .

Nach Beendigung der Reaktion stellt man das pH auf 1 bis 3, vorzugsweise 1,8C bis 2, und trennt das Trinitrophenyl-cephalospDrin C ab. Dies geschieht vorzugsweise durch Extraktion mit einem mit Wässer nicht mischbaren Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, beispielsweise mit einem mit Wasser nicht mischbaren Alkohol, insbesondere einem niederen Alkänol mit 4-6 Kohlenstoffatomen wie n-Butanol, einem Amylalkohol, z.B. ri-A;nylalkohol, η-He- ' xylalkohol, 2-Aethyl-n-butanol; o<$er Benzylalkohol;oder •lnem Ester, Insbesondere Niederalkylester von niederen Alkaneäuren wie Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, z.B. BtflfsaureMthylester, Eesigeäurebutylester; oder einem mit :■■.·■■■■ . 009884/2177 ' bad

Wasser nicht mischbaren Keton, besonders Diniederalkylketon, z.B. Diäthylketon, Methylisobutylketon; oder einem unsubstituierten oder einem substituierten, besonders chloriertem Kohlenwasserstoff, z.B. einem chloriertem Alkan wie Methylenchlorid, Chloroform, Aethylenchlorid;oder Gemischen dieser Lösungsmittel. Weiter kann man mit flüssigen basischen Ionenaustauschern in den genannten Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, z.B. mit Amberlite LA-2 in n-Butylacetat oder in 2-Aethyl-n-butanol, extrahieren. .

, Anstatt das Trinitrophenyl-cephalosporin zu extrahieren, kann man es auch aus der Lösung fällen, beispielsweise, indem man das pH auf 1 - 3* vorzugsweise l,8^r - 2 einstellt. .

Zwecks Umwandlung des Trinitrojiienyl-cephalosporln C- in 7-Amino-cephalosporänsäure kann man die Verbindung verestern und beispielsweise nach dem im englischen Patent 1 04l 989 beschriebenen Verfahren in .7-ACA überführen.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Gelsiusgraden angegeben.

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Beispiel 1 :

370 Liter Cephalosporin C-haltiger Kulturbrühe werden mit einer Lösung von 2,72 kg Oxalsäure in 10 Liter Wasser und 0,9 Liter einer Mischung von gleichen Volumen teilen Wasser und konzentrierter Schwefelsäure versetzt« so dass ein pH von 3 resultiert. Nach Zugabe von 8 kg "Celatom" (Diatomeenerde) als Filterhilfsmittel filtriert man

durch eine Filterpresse. Das klare-Filtrat (320- Liter) enthält 1,57 β Cephalosporin C pro Liter. Der feuchte Filter-rückstand (62 kg) wird verworfen· .

. Man fügt das Filtrat zu einer Lösung von 920 g 2,4,6-t'rinitrobenzolsulfonsäurem Natrium vom pH 7*5* die man erhält, wenn man 796 g wasserfreies Natriumsulfit in 3,35 Liter deionisiertem Wasser löst, 1 kg Eis zufügt und innert 15 Hinuten eine Lösung von 1,425 kg Pikrylchlorld in 4,35 Liter Aceton unter Rühren hinzugibt.-Das pH des Lösungsgemisches wird mit konzentrierter Natronlauge unter Rühren auf 9,0 gestellt und dann während 4 Stunden bei einer Temperatur von 26° auf 8,5 - 8,7 gehalten. Die klare rote Reaktionslösung, die das 2,4,6-Trinitrophenyl-cephalosporin C enthält, wird bei einem pH von 1,5 bis 2,0 das man mit 5-n.,Schwefelsäure einstellt, mittels eines Gegenstromextraktors mit Methylisobutylketon extrahiert. Man erhält 190 Liter Methylisobuty!keton-Extrakt. Dieser wird mittels

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eines Gegenstromextraktors mit einem 0,2-M. Phosphatpuffer vom pH 8 extrahiert. Man erhält 95 Liter wässrigen Extrakt vom pH 6. Aus diesem wird das 2,4,6-Trinitrophenylcephalosporin C nochmals mit Methylisobutylketon bei pH 2 extrahiert. Die erhaltenen 50 Liter organischer Lösung werden bei pH β dreimal mit je 4 Liter Wasser extrahiert. Den so erhaltenen wässrigen Extrakt (12 Liter) kühlt man auf O bis 4° ab, stellt das pH mit 6-n. Salzsäure auf 2,0 ein> saugt den Niederschlag ab und wäscht ihn mit eiskaltem Was-' ser. Nach dem Trocknen verbleiben 751 g rohes 2,4,6-Trinitrophenyl-cephalosporin C. Aus dem Piltrat werden noch weitere 269 g des Produktes gewonnen. Das Dünnschichtehrο-matogramm an Silicagel im System n-Butanol-Eisessig-Wasser (75 s 7*5 ! 21) zeigt für 2,4,6-Trinitrophenyl-cephalospD-:-.. rin C in bezug auf Pikrinsäure als Bezugssubstanz einen RC,-Wert von 0,51· Daneben sind noch Flecken von stärker und schwächer polaren 2,4,6-Trinitrophenylverbindungen sichtbar. Die Ueberführung des Derivates in 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA) kann wie folgt vorgenommen werden: a) 200 g rohes 2, 4, 6-Trinitrophenyl-cephalosporin C werden in 2 Liter Methylisobutylketon suspendiert und mit einer Lösung von 200 g Diphenyldiazomethan (hergestellt durch Oxydation von Benzophenonhydrazon mit Mangandioxyd) in 6OO ml Methylisobutylketon versetzt. Nach 1,5 Stunden lässt man die rotviolette Lösung in 10 Liter Petroläther einlaufen.

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Dabei fällt der rohe 2,4,6-Trinitrophenyl-cephalosporin C-Dibenzhydrylester als hellgelbes Pulver aus. Der Niederschlag wird abgenutscht, mit Petrolather gewaschen und im Vakuum bei 40° getrocknet. Das Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System Toluol-Aceton (8:2) einen Rf-Wert von 0,53. Ausbeute: 280 g des Diesters mit einer Reinheit von 44 % entsprechend einer Ausbeute von 62 # bezogen auf das im Kulturfiltrat vorhandene:: Cephalosporin C. b) 9*6 g des gemäss a) erhaltenen Dibenzhydryle^sters werden in 260 ml absolutem Methylenchlorid gelöst. Nach Abkühlen der Lösung, auf -l8° versetzt man. mit 5 ml wasserfreiem Pyridin und gibt, dann eine Lösung von 7*8 ß Phosphorpentachlorid in 100 ml absolutem Methylenchlorid unter Rühren innert 10 Minuten tropfenweise zu..Man rührt noch 45 Minuten bei -12 bis -10° und gibt dann innert 5 Minuten 64. ml auf -10° abgekühltes Methanol hinzu. Die Lösung wird weiter 40 Minuten bei -10° und dann eine Stunde bei +10° .gerührt. und dann unter Rühren mit 110 ml 2-n. Salzsäure versetzt. Man trennt die Phasen und extrahiert die wässrige Phase mit 100 ml Methylenchlorid nach. Die vereinigten Methylenchloridphasen werden schonend im Vakuum eingedampft. Nach Trocknen im Hochvakuum erhält man einen harzigen, braunen Rückstand von rohem 7~Aminocephalosporansäure-benzhydryleeter. . . .,.-..

0) Man löst den 7-ACA-benzhydrylester in 5 ml Anisol, ver- eetit unter Kühlen mit 14 ml Trifluoressigsäure, lässt

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30 Minuten bei 20 - 30° reagieren und gibt dann ein auf -10° gekühltes Gemisch von 25 ml Triäthylamin und I80 ml Methanol hinzu. Das pH einer 10 #igen wässrigen Suspension ist 2,3, Man stellt das pH mit Triäthylamin (6 ml) auf 3,5, kühlt auf -l8° ab und lässt das Reaktionsgemisch kristallisieren. Der kristalline Niederschlag wird durch Nutschen abgetrennt, mit Methanol, Methylenchlorid und Diäthyläther gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. Man erhält die 7-Amino-cephalospDransäure in einer Reinheit von 83*3 %· Die Ausbeute beträgt 1,62 g = 63,5 % bezogen auf den eingesetzten 2,4,6.-Trinitrophenyl-cephalosporin-C-dibenzhydrylester.

. . ' Beispiel 2: '·.,. . .. .

10 Liter Külturfiltrat mit einem Gehalt von 1340 mg Cephalosporin C/Liter und I90 mg Stickstoff in Form primärer Aminogruppen pro Liter, hergestellt durch Filtration einer Fermentationslösung unter Zusatz von 2 #"Celafcom"als Filterhilfsmittel, wird mit 60 g 2,4,6-Trinitrobenzolsulfosäure versetzt und, nach Einstellung des pH auf 8,7, 2 Stunden bei diesem pH-Wert gehalten. Dann versetzt man die Reaktionslösung mit 250 g Hyflo Supercel" und stellt den pH-Wert unter Rühren mit konzentrierter Salzsäure auf 4,3· Der gelbe Niederschlag wird mit dem "Hyflo" zusammen abge-

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nutscht. Das klare Filtrat wird mit 3 Liter Essigester versetzt, der. pH-Wert wird mit Salzsäure auf 2,0 gestellt,- die Phasen werden getrennt und die leicht emulgierte Essigesterphase wird durch Filtration in Gegenwart von 50 g"Hyflo Supercel"geklärt. Die wässrige Phase wird noch dreimal mit je 1 Liter Essigester nachextrahiert.

Die vereinigten Essigesterextrakte werden mit 1 Liter Wasser versetzt und der pH-Wert mit Natronlauge auf 6,5 gestellt. Die Phasen werden getrennt. Die Essigesterphase wird noch dreimal mit 0,5 Liter Wasser bei pH 6,0 nachextrahiert.Die vereinigten wässrigen Extrakte werden mit 1 Liter Essigester versetzt und das pH wird mit Salzsäure auf 2,0 gestellt. Die Phasen werden getrennt und die wässrige Phase noch dreimal mit je 0,5 Liter Essigester nachextrahiert. Die vereinigten Essigesterextrakte werden zweimal mit je 0,3 Liter gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und auf 0,5 Liter eingeengt. Diese konzentrierte Lösung des 2,4,6-Trinitrophenyl-cephalosporin C wird unter leichtem Kühlen mit 0,2 Liter einer 47,5 #igen Lösung von Diphenyldiazomethan in Petroläther versetzt. Nach 1 3/4 Stunden bei Raumtemperatur wird der 2,4,6-Trinitrophenyl-cephalos'porin C-dibenzhydrylester durch Eintragen in 3,5 Liter Petroläther gefällt. Die Fällung wird genutscht und bei 40° im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute beträgt 51*2 g mit einem Gehalt von 40,4 %, d.h. 76,ß# der Theorie.bezogen auf das im KuI-

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turfiltrat vorhandene Cephalosporin C«

Beispiel 3 J

11,76 g Pikrylchlorid werden in J>6 ml n-Butanol suspendiert und mit einer Lösung von 6,6 g wasserfreiem Natriumsulfit in 72 ml Wasser versetzt. Nach 30-minütigem Rühren ist das pH der Lösung 6,5· Die rote Reaktionsmischung, die 15 g 2,4,6-Trinitrobenzolsulfosäure-Natriumsalz enthält, wird zu 6 Liter einer wässrigen Lösung von angereicherten| Cephalosporin C (Berechneter Gehalt an Cephalosporin C-Natriumsalz 12,3 Zi Gehalt an Stickstoff in Form primärer Aminogruppen 1,9 %) zugegeben. Man stellt das pH mit Natronlauge auf 9,0 und hält es dann während einer Stunde auf 8,5 bis 8,7· Dann versetzt man die Reaktionslösung mit 1 Liter einer Mischung van n-Butylacetat-n-Butanol (1:1) und stellt das pH mit Salzsäure auf 2,0 ein. Nach 10 Minuten werden die Phasen getrennt. Die wässerige Phase wird noch zweimal mit je 50OmL n-Butylacetatir.n-Butanol-Ge-. misch nachextrahiert. Man vereinigt die organischen Extrakte, stellt das pH mit Natronlauge auf 5,5 und extrahiert sie mit 300, dann 200 und zuletzt mit 100 ml Wasser. Die gesamten wässrigen Lösungen werden nochmals bei pH 2 mit dem obigen n-Butylacetat-n-Butanol-Gemisch (100 ml, dann zwei-

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mal 50 ml) extrahiert und die organischen Auszüge nochmals bei pH 5,5 mit Wasser (100 ml, dann zweimal 50 ml). Die insgesamt 200 ml wässeriger Lösung versetzt man mit lOg^Hyflo-Supercel',' kühlt auf 0 bis 4° ab und stellt das pH mit 2-ri. Salzsäure auf 1,8 bis 2,0 ein. Dabei fällt das 2,4,6-Trinitrophenyl-cephalosporin C aus, Es wird zusammen mit dem FiI terhilfsmittel abgenutscht, mit eiskaltem, deionisiertem Wasser gewaschen und 15 Stunden bei 40° getrocknet. Die Ausbeute beträgt l8,07 g 2,4,6-Trinitrophenyl-cephalosporin C auf 10 g"HyfIo-Supereel". Im Dünnschichtehromatogramm an Silicagel im gleichen System wie im Beispiel 1 sind aus'ser dem Rfp-Wert von 0,51 nooh Flecken von stärker polaren und weniger polaren Trinitropheny!verbindungen sichtbar,

Das Produkt kann wie folgt in den Dibenzhydrylester übergeführt werden: , ■ . ·■

Man suspendiert das Fällungsgemisch in I80 ml n-Butylacetat und versetztmit 36 g Diphenyldiazomethan in .180 ml n-Butanol. Die Suspension wird 3 Stunden gerührt, das "Hyflo-Supercel" abgesaugt und das klare Filtrat Innert 20 Minuten in I8OO ml Petroläther (Kp. 50 - 70°) einlaufen gelassen. Man nutscht den hellgelben Niederschlag des rohen 2,4,6-Trinitrophenyl-cephalosporin C-dibenzhydrylesters ab, wäscht ihn mit Petroläther und trocknet ihn bei 40° im Vakuum. Die Ausbeute beträgt 24,7 S {^ #Lg) = 65,3 % bezogen auf das in der Aufgangs Losung enfchaLfcene CephaLosporln C.

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Beispiel 4.:

Man löst 17,3 S Pikrylchlorid "In 35 ml n-xButyläceJbat, gibt eine Lösung von 9,8 g wasserfreiem Natriumsulfit in .60 ml Wasser hi#zu und rührt kräftig während 15 Minuten. Die Butylacetatphase wird dabei farblos und die wässerige Phase, die 22 g 2,4,6-Trinitrobenzolsulfosäure-Natriumsalz enthält, intensiv rot. Man fügt die rote Lösung zu 6 Liter einer rohen Cephalosporin C (berechnet 12 g, Gehalt an primären Aminogruppen. 1,3 %) enthaltenden wässrigen Lösung, stellt das pH mit Natronlauge auf 9 ein und rührt 2 Stunden bei pH 8,5 - 8,7. Die Aufarbeitung erfolgt analog Beispiel 3· Man erhält 21,, 8 g rohes 2,4, 6-Trinitrophenyl-cephalosporin C auf 40 g "HyfIo-SuperCjsd", . "

Durch. Veresterung mit 43*6 g Diphenyldiazomethan analog Beispiel· 3-werden 28,65 g 2,4,6-Trinitrophenyl-cephalosporin C—dibehzhydrylester (Reinheit 55 %)' erhalten, d.h. 64,6 % der Theorie.

Beispiel 5 :

Man löst 16,29 g Pikrylchlorid in 34.2 ml Butylacetat, gibt eine Lösung von 9,L5 g wasserfreiem Natriumsulfifc Ln 66,6 mL Wasser hLnzu, rührb krliftlg während 15 Minuten. DLe Mltuihung wLcd In .5 LLter PLltrat einer CuphaLusiporin C ha It L^wn KuLtufbriiho ^'.^,οιαί'ΐη, la:; ruuih dura im EJoLüpLel L ^b'jnoii 'fr.vt'-üivaii erhalten wird. Van Fl It.rat enthalt

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im Liter 1809 mg Cephalosporin C und 205 mg Stickstoff in Form von primären Aminogruppen. Der pH-Wert der Mischung' wird mit Natronlauge auf 9,0 gestellt. Die Reaktiondauer beträgt zwei Stunden, wobei der pH-Wert zwischen 8,5 und 9 gehalten wird. · .

Nach Beendigung der Reaktion werden 60 g "Hyflo-Supercel" (Diatomeenerde) zugefügt und der pH-Wert mit Eisessig auf 4,0 eingestellt. Der dabei sich bildende inaktive Niederschlag wird mit dem Hyflo zusammen abgenutscht. Das klare Filtrat wird mit drei Portionen einer 5#igen Lösung von Amberlite LA-2 in Butylacetat extrahiert. Die drei Portionen betragen 600, 300 und 150 ml. Der pH-Wert des Extraktionsgemisches wird mit Eisessig jeweils auf 4,5 eingestellt. Nach 15 minütigem Rühren werden die Phasen zur Klärung jeweils zentrifugiert. Die inaktive wässerige Phase wird verworfen. Die vereinigten organischen Phasen werden mit 3OO ^ml Wasser versetzt und der pH-Wert der Mischung mit 5-n. Natronlauge unter intensivem Rühren auf 8,5 gestellt. Die wässerige Phase wird abgetrennt und die Extraktion noch zweimal mit je 180 ml V/asser in gleicher Weise wiederholt.

Die vereinigten wässerigen Extrakte werden mit Petroläther gewaschen, auf 0-4° C abgekühlt und mit 5 N Salzsäure auf pH 2 gestellt. Der sich bildende Niederschlag von rohem 2,4,6-Trinitrophenyl-cephalosporin C wird abgenutscht, mit kaltem Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. ■

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Claims (6)

1. Patentansprüche :

   '1. Verfahren zur Isolierung von Cephalosporin C in Form eines Derivates, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer verdünnten. Cephalosporin C-haltigen wässrigen Lösung durch Reaktion mit Trinitrobenzolsulfosäure N-Trinitrophenyl-cephalosporin C bildet und aus der Lösung abtrennt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man von einer Cephalosporin C-haltlgen Kultur?-- flüssigkeit ausgeht; . * , ·
3. 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion bei Zimmertemperatur durchgeführt wird. " . -
4. 4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 - 3,· dadurch ; gekennzeichnet, dass die Reaktion bei einem pH von 7 - 10, vorzugsweise 8,5 bis 9* durchgeführt wird.
5. 5. Verfahren nach den Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Trinitrobenzolsulfosäure in Form einer Lösung, die man durch Umsetzung von Pikrylchlorid mit einem Sulfit erhält, angewendet wird.

   ,o Unterlagen (Art. ν § ι Abs. 2 <\r. 1 ssu 3 des Änderung««·.»,4.8.19071

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6. 6. Verfahren nach den Ansprüchen 1-5* dadurch gekennzeichnet, dass das N-Trinitrophenyl-cephalosporln C durch Extraktion aus der Lösung abgetrennt wird.

   7* Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das N-Trinitrophenyl-cephalosporin C bei einem pH von 1-3* vorzugsweise 2, extrahiert wird.

   8· Verfahren nach den Ansprüchen 6 oder 7* dadurch gekennzeichnet, dass man das N-Trinitrophenyl-cephalosporin C mittels eines mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches extrahiert.

   9· Verfahren nach den Ansprüchen 6 oder 7* dadurch gekennzeichnet, dass man das N-Trinitrophenyl-cephalosporin C mittels eines flüssigen Ionenaustauschers extrahiert.

   10* Verfahren zur Isolierung von Cephalosporin C in Form eines Derivates wie in den Beispielen beschrieben. '

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