KR820001739B1 - 헤파린의 회수방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

헤파린의 회수방법

본 발명은 장점막이 제거된 동물의 장을 염화나트륨 수용액으로 처리하여 형성되는 장염수(Intestinal brine)로 부터 헤파린을 회수하는 방법에 관한 것이다. 헤파린은 천연의 항응고제로서 오랫동안 의약으로 사용돼왔다. 현대의약에서까지도 그것은 필수불 가결한 것이며 그 사용 범위는 날로 증가되고 있다.

최근에 헤파린을 함유한 동물조직, 즉 페, 간으로 부터, 더최근에는 특히 돼지, 소, 양의 장점막으로부터 유효물질인 헤파린을 분리시킬 목적으로, 많은 방법이 개발되어왔다. (GB-PS 754, 885. DE-PS1, 228, 241, US-PS 3, 058, 884, DE-PS 1, 253, 868), 그러나, 원료물질이 쉽게 부패되기 때문에, 이들 원료물질을 저장하는데 제한을 받고, 또 냉동시켜 오랜시간 보존시킬 수 있다하여도 기술적인 복잡성 때문에 비용이 상당히 많이 든다는 단점이 있다. 또한 그 과정중에 발생하는 냄새로 인하여 인근의 생산자나 주민들은 자주 불쾌한 일을 당하게 된다. DE-PS 제 1253868 호에는 헤파린을 회수하는 통상의 방법중 몇몇이 요약되어 있다. 헤파린을 세포로부터 용해시켜 내기 위하여 우선 동물조직, 즉장점막을 뜨거운 염수용액으로 처리하는데, 얻어지는 매질중의 헤파린의 양은 매우 적은양이다.

우리는 도살장 및 공장에서 장점막을 처리하는 과정에서 얻어진 염수증에 헤파린이 존재함을 발견하였다. 이러한 염수는 장점막이 이미 제거된 동물의 장관을 보존 및 탈수시킬 목적으로 0℃ 내지 실온에서 염화나트륨 용액중에 침적시킬때 얻어지는 데, 예를들면 3 내지 5.6몰의 염화나트륨 용액을 사용할 수 있으며 그 최대온도는 30℃ 이다.

본 발명은 장점막이 제거된 동물의 장관을 염화나트륨 수용액으로 처리하여 얻어진 장염수로부터 헤파린을 분리시켜 회수하는 방법에 관한 것이다. 일반적으로 장염수는 돼지, 소, 양의 장관으로부터 얻어진다. 본 발명은 상기방법에 의해 회수된 헤파린도 제공해준다. 이 헤파린은 나트륨 헤파리네이트 또는 헤파린의 다른 생리학적으로 무독한 염의 형태로 회수된다. 본 발명에 사용되는 출발물질의 분리공정 및 임의의 정제 공정은 공지의 방법에 따라 수행한다.

DE-PS 제 1253868 호에 비추어볼 때, 저온에서 격렬하지 않은 조건하에서, 염화나트륨 용액중에 장관을 침적시켜 얻어진 염수중에 비교적 많은양의 헤파린이 들어있다는 사실은 매우 놀라운 일이다. 또한 이 헤파린이 화학적으로 같은종류의 부산물이 거의 없는상태로 얻어진다는 것도 기대밖의 일이다. 따라서 이전에는 환경을 오염시키는 폐물로만 여겨졌던 이 염수가 헤파린을 제조하는 새로운 원료자원으로 나타났으며 지금은 이 원료물질의 부족으로 그 공급이 부족되고 있는 상황이다. 불순물이 존재하지 않기 때문에, 조(粗) 헤파린을 제조하는 과정을 매우 양호한 방법으로 수행할 수 있으며 종래의 기술에 따른 복잡한 분리조작을 수행할 필요가 없어졌다. [참조 : US-PS 제 3451996 호 및 GB-PS 제 1221784].

더군다나, 수득되는 헤파린의 질이 시장에서 구할수 있는 헤파린보다 매우 우수하다. 본 발명에 사용된 장염수(intestinal brine)로 부터 공지의 방법에 따라 분리된 조(粗) 헤파린은 정제과정을 거치면 mg당 200usp 단위이상을 갖는 헤파린이 얻어질 정도로 순수한 상태이다. 이미 시판되고 있는 헤파린 제제는 일반적으로 mg당 150usp 단위의 헤파린으로, mg당 155usp 단위의 헤파린 조차도 거의 드물다.

mg당 1usp 단위는 미국약전 분석법에 따라 얻어진 특정한 활성도로서, 양의 플라스마에서 관찰된 혈구응집을 억제하는 저지력을 나타낸다. 1usp 단위는 약 1.1 I.U. 에 해당된다. 예들들어, 미국약전에서는 장점막으로부터 얻어진 헤파린 제제는 적어도 140usp 단위를 가져야 한다고 기술하고 있다. 수많은 개량법이 개발되었으나, 시판되고 있는 헤파린 제제의 활성도는 아직까지 만족스럽지 않은 상태이다. 엘. 더블유. 가나나그와 엘. 비 자크스는 mg당 최초로 175usp를 갖는 헤파린을 분리시키는데 성공하였으나, 이 방법은 헤파린을 그의 바륨염의 형태로 반복하여 결정화시키는 공정을 포함하고 있기 때문에 실험실적으로만 수행할 수 있다.

0.5M 내지 포화상태의 염화나트륨염을 함유하는 염화나트륨 용액이 동물장관을 보존하고 탈수시키는데 특히 적합하여 본 발명의 공정에 바람직하게 사용되는데, 3M 내지 포화몰량의 염화나트륨을 함유하는 염화나트륨 용액이 특히 바람직하다. 포화상태의 몰량이란 도살장내의 실온에서, 농축된 수용액중에 용해되어 있는 염화나트륨의 양이다. (농 염화나트륨 수용액은 실제로 26.4중량%의 염화나트륨을 함유한다). 젖어있는 상태의 장고나에 염화나트륨을 뿌려서도 농염화 나트륨 수용액을 얻을수 있다. 일반적으로 점막이 제거된 동물의 장관을 차거운 염화나트륨 용액으로 2시간 내지 3일간 처리한다. 그러나, 일반적으로 이러한 처리과정은 3내지 24시간내에 완결된다. 염화나트륨 용액으로부터 보존 및 탈수시킨 동무장관을 꺼낸후의 장염수중의 헤파린 함량은 놀라울 정도로 높다.

원료물질로서 본 발명에 따른 이러한 장염수를 사용하면, 헤파린을 거의 무색의 순수한 형태로 공업적인규모로 성공적으로 분리시킬 수 있다. 현재까지 다른 원료물질로부터 얻어진 조(粗) 헤파린은 표백시켜야 했는데 이 표백에는 비용이 많이들어 바람직하지 못하다. (참조 : US-PS 제 3179566 호)

더군다나, 장염수는 오랜기간동안 저장시에도 질적인 변화를 일으키지 않는 거의 무취의 저장성 원료물질이기 때문에, 화학적인 다른 보존법을 사용하여 보존시킬 필요가 없다.

본 발명은 또한 장관점막을 제거시킨 동물 장관을 염화나트륨 수용액중에 침적시켜 얻어진 장염수의 용도 및 이와 같은 염화나트륨 용액으로부터 헤파린을 분리시키는 방법을 제공해준다. 본 발명을 다음의 실시예로서 더욱상세히 설명한다. 각각의 경우에 사용된 장염수는 점막을 제거시킨 동물의 장을 약 10℃의 온도에서 26.4% 농도의 염화나트륨 수용액중에 침적시켜 얻은 것이다.

[실시예 1]

교반기가 장치된 1500ℓ 용액의 기구내에 들어있는 600ℓ의 장염수중에 교반하면서 메탄올 600ℓ를 실온에서 1/2시간에 걸쳐 가한다. 1/2시간 더 교반한후 이 혼합물을 1시간동안 정치시킨다. 침전된 염은 가라앉히면서 혼탁한 상동액을 2차 용기에 경사시키고, 얻어진 현탁액을 다시 경사시켜 상등액을 버리고 침전을 원심분리하여 분리시킨다. 진공중에서 건조시키면 mg당 10usp 단위를 갖는 생성물 1.44kg이 얻어진다. 이들중의 약 45%가 아직 염화 나트륨을 함유하고 있다. 425usp 단위, 즉 45.2g에 해당하는 양만큼 조 헤파린을 각각 200㎖의 2M 염화나트륨 용액으로 3번 추출하는데, 각각의 경우에 60℃에서 1시간 교반한다. 추출물을 모아 그 용액이 약 0.9몰/ℓ의 염소이온을 함유할때까지 물로 희석한다. 염화물 형태의 음이온-교환 제(Lewatet CA 9249)를 가하고 1시간동안 교반한다. 이 혼합물을 흡인여과하고, 약 200㎖의 0.9M 염화나트륨 용액으로 세척한다. 이어서, 이이온교환제를 40℃에서 2M 염화나트륨용액과 함께 5시간 교반하고, 흡인여과한 후 2M 염화나트륨 용액으로 세척한다. 용출액을 세척액과 함께 모으고 1.5배의 메탄올로 침전시킨다. 침전을 원심분리시키고, 50㎖의 물-메탄올(1 : 1.5 : 용량비)로 우선 세척한후 약 50㎖의 메탄올로 세척한후 건조시킨다. mg당 195usp 단위를 갖는 나트륨 헤파리네이트가 198g 얻어진다.

상기 방법으로 얻어진 mg당 200usp 단위를 갖는 나트륨 헤파리네이트 1.5g을 200㎖의 2M 염화 나트륨 용액중에 용해시키고, 이 용액은 흡인여과한후, 잔유물을 30㎖의 2M 염화나트륨 용액으로 우선 세척하고 이어서 완전히 염을 제거시킨 물 약 250㎖로 세척한다. 상기 언급된 이온 교환제(Lewatit CA (9249)를 사용하여 반복 정제시킨다.

사용출액과 세척액을 모아 상기 과정을 수행한다. 침전을 세척, 건조시키면 mg당 251usp 단위의 활성을 갖는 11.2g의 나트륨 헤파리네이트가 얻어진다.

[실시예 2]

GB-PS 제 754885 호에 서술된 방법과 유사한 방법으로 3ℓ의 장염수에 교반하면서 아세트산을 가하여(약 50㎖) pH를 3.1 내지 3.2로 조정한다. 몇시간후에 이 혼합물을 경사시킨후 잔여물을 원심분리 시킨다. 침전을 버리고 용액을 모아 수산화 나트륨용액으로 중화 시킨다.

이어서 동량의 메탄올을 교반하면서 서서히 가하고, 45분후 이 현탁액을 침전된 염화나트륨으로부터 경사시킨다. 이 현탁액을 수시간 방치하고 상등액을 경사한후 잔유물을 원심분리한다. 침전을 진공하에 건조시키며 mg당 21usp 단위를 갖는 3.43g의 조 헤파린의 수득된다.

425000usp 단위, 즉 20.2g에 해당하는 양만큼의 조(粗) 헤파린을 실시예 1과 유사한 방법으로 정제하면 mg당 262usp 단위를 갖는 나트륨 헤파리네이트 10.65g이 얻어진다.

[실시예 3]

3ℓ의 장염수를 12ℓ의 물로 희석하여 염소의 몰농도가 0.85M이 되도록 한다. 50g의 규조토와 100㎖의 수중의 6g의 벤젠토니움 클로라이드(Hyamine 1622, Rohm ＆ Haas)를 가한다. 수시간후에 경사시키고, 잔여물을 흡인 여과한다. 물로 세척한후 아직 젖은 상태인 침전을 DE-PS 제 1228241 호의 방법에 따라 각각 200㎖의 2M 염화나트륨 용액으로 3번 추출한다. 추출액을 모아 2배용량의 메탄올로 침전시킨다. 침전을 분리 건조시키면 mg당 155usp 단위를 갖는 465g의 헤파린이 수득된다.

[실시예 4]

30ℓ의 장염수를 염산의 물농도가 약 0.85M이 될때까지 120ℓ의 물로 희석한다(참조 : DE 제-PS 1156938 호). 이 혼합물에 아세트산(약 50㎖)을 가하여 pH3.2로 산성화 시키고, 몇시간후에 침전이 형성되면, 투명한 상등액을 경사시킨 다음, 원심분리시킨다. 건조시키면 mg당 6.5usp 단위를 갖는 조 헤파린이 111g얻어진다. 425000usp 단위 즉 65.5g에 해당하는 양만큼의 조(粗) 헤파린을 실시예 1에 서술된 방법으로 정제한다. 이온-교환기에 의해 1차 정제시키면 mg당 198usp 단위를 갖는 나트륨 헤파리네이트 196g이 얻어진다.

상기 방법으로 얻어진 mg당 200usp 단위를 갖는 15g의 나트륨 헤파리네이트를 200㎖의 2N 염화나트륨 용액중에 용해시킨다. 이 용액을 흡인여과하고, 잔유물을 30㎖의 2N 염화칼슘으로 우선 세척하고, 약 250㎖의 완전히 탈염시킨물로 세척한다. 용액을 모아 완전히 탈염시킨 물로 희석하여 염소의 몰농도가 0.9M 이 되도록 한다. 교반하면서 상기에서와 같이 이온 교환제(Lewatit CA 9249)로 처리한다. 염화나트륨용액대신 2N 염화 칼슘용액으로 용출 및 세척과정을 수행한다.

용출액 및 세척액을 모아 상기과정을 수행한다. 침전을 세척, 건조시키면 mg당 260usp 단위를 갖는 칼슘헤파리네이트 10.7g이 얻어진다.

[실시예 5]

10ℓ의 장염수를 40ℓ의 물로 희석하여 염소의 몰농도를 약 0.85M로 조정한다. 이 용액을 직경 26mm, 길이 380mm의 이온 교환 칼럼상의 여과기를 통하여 시간당 약 3ℓ의 속도로 펌프한다. 여기에는 Cl^--형의 중(中)염기성의 마크로포러스 음이온 교환 수지(Lewatit CA 9249)를 사용한다. DE-PS 제 1253868 호에 서술된 도웩스 1-X-1 등의 다른 음이온 교환수지도 사용할 수 있다.

이 수지를 컬럼으로부터 떼내어 500㎖의 0.9M의 염화나트륨용액으로 두번 세척하고 40℃에서 교반하면서 400㎖의 2M 염화나트륨 용액으로 5시간동안 용출시킨다. 이 용액을 1.5배 용량의 메탄올로 침전시키고 이 침전을 분리 건조시키면 mg당 149usp 단위를 갖는 헤파린 1.2g이 얻어진다.

Claims (1)

1. 장정막이 제거된 동물의 장을 실온에서 3 내지 24시간동안 염화나트륨 수용액 3M내지 포화용액으로 처리하거나, 물의 존재하의 고체염화나트륨으로 처리하여 형성되는 장염수(intestinal brine) 즉 동물의 장조직으로 부터 헤파린을 회수하는 방법.